方法对角膜细胞的谱系追踪使用多色荧光记者小鼠

在本文中，我们描述了使用 R26R-Confetti 小鼠设计和执行多色谱系追踪实验的原理。我们提供了一种用于追踪角膜上皮细胞的特定方案，可以针对其他感兴趣的组织进行修饰。

该方法的总体目标是定位和跟踪角膜上皮中干细胞和祖细胞的迁移、扩增和存活。这种方法可以帮助回答角膜上皮细胞生物学领域关于稳态、组织修复、衰老和病理学的关键问题。该技术的主要优点是易于建立，并且允许以克隆方式对细胞进行无创谱系追踪。

首先，选择具有诱导型组织特异性启动子的 Cree 转基因小鼠品系来标记角膜缘和角膜上皮祖细胞和干细胞。使用他莫昔芬诱导型 K 14 Cree ERT 系列。接下来，根据研究问题和可用的 Cree 线选择合适的 brainbow 盒。

在这种情况下，使用了 Brainbow 2.1 系列。将纯合子 R 26 R 五彩纸屑菌株与纯合子 K 14 Cree ERT 菌株杂交，产生具有四个颜色 K 14 阳性细胞的小鼠，以诱导转基因小鼠的重组。首先称取 80 毫克他莫昔芬，涡旋将其溶解在一毫升玉米油中。

将溶液放入摇动的水浴中，保持在 65 摄氏度直至完全溶解，然后将其留在浴中直到下次麻醉。一只 8 周龄的 Brainbow 2.1 Cree ERT 杂合子小鼠，用脚趾捏检查麻醉深度，小心地将 100 微升他莫昔芬溶液涂抹在小鼠的每个眼表上。直接施用他莫昔芬可产生高效的 Cree 诱导将任何残留的他莫昔芬溶液在 4 摄氏度下避光存放长达一周。

应用前加热溶液，每只小鼠连续三天重复加热。首先将 1 克他莫昔芬粉末溶解在 5 毫升无菌二甲基亚砜中。为了产生每毫升 200 毫克的溶液，请将溶液置于摇动的水浴中，保持其 65 摄氏度直到它变得透明，然后将其留在浴中直至使用。

然后麻醉小鼠并使用脚趾捏检查麻醉深度，将眼药膏涂抹在小鼠未处理的眼睛上，以保护其在手术过程中免受脱水，并给予足够的镇痛药。接下来，将 200 微升他莫昔芬溶液吸入注射器中，不连接任何针头，并将其局部涂抹在眼睛的整个角膜上。液体在室温下在组织上凝固。

照顾老鼠直到它保持胸骨躺着，只有在它完全清醒时才将其送回他人的陪伴下。在诱导后的适当时间点牺牲小鼠后，如文本协议中所述的眼睛受伤。首先按压眼睑，将眼球从眼窝中弹出，使眼睛成核。

将弯曲的镊子滑到眼球后面以固定视神经，然后向上拉眼球以将其分离。将每个眼球放入含有 PBS 的 60 毫米培养皿中。将含眼板置于手术立体显微镜下。

确保您认识眼睛的基本结构、角膜、角膜缘和视神经。去除眼睛周围的视神经、肌肉和结缔组织。将眼睛放在后部，角膜朝下，然后用弹簧剪刀在眼球后部的巩膜上切开一个切口。

扩大切口，让晶状体弹出并用镊子去除虹膜。接下来，从中心向外围切开，做四到五个径向切口，使角膜变平，然后用薄平刮刀去除虹膜的任何剩余部分。最后，切开角膜缘周围多余的外周组织以固定角膜。

将解剖的组织转移到 12 孔培养皿中，并在 4% 对位甲醛中孵育 10 分钟。然后在 PBS 中短暂洗涤组织以对细胞核进行染色。将角膜在 2 μg/mL 的 DPI 溶液中孵育 10 分钟，然后在 PBS 中短暂洗涤。

接下来，将角膜放在载玻片上，上皮面朝上。然后将一滴封固剂滴在角膜上，并用盖玻片盖住。让载玻片在室温下干燥过夜，并储存在 4 摄氏度。

对于角膜成像，使用光谱共聚焦系统，该系统能够分离 R-F-P-Y-F-P-G-F-P 和 CFP 发射。首先，根据大脑的荧光蛋白设置荧光、激发和发射波长。Bo 盒，注意防止发射信号的交叉激励或重叠。

接下来，获取平铺图像以高分辨率可视化整个角膜。在这里，在所有四个荧光通道中获得 12 x 12 图像的数组。最后，合并图像以创建复合谱系。

使用 R 26 R 五彩纸屑小鼠进行示踪实验，以跟踪角膜缘和角膜上皮祖细胞的命运。在稳态条件下，正如预期的那样，在诱导后 10 天观察到小簇荧光细胞。四个月后，从角膜缘到角膜中心的条纹出现，表明细胞在角膜损伤后从角膜缘迁移以再生角膜。

锯从角膜缘迁移迅速，在 7 天内形成长而厚的角膜缘条纹。该模型对于追踪和研究不同情况下的角膜干细胞和祖细胞很有价值。未来，它将允许研究在稳态和应激条件下（如受伤、化学灼伤突变等）下的克隆细胞扩增、存活和迁移。

该模型也可用于剖析正常和病理角膜再生的分子机制。这项技术可能有助于我们了解不同的病理状况，如角膜营养不良、烧伤和角膜创伤，以及评估不同治疗对角膜再生、细胞扩增和迁移的影响。