为内胚层细胞从人类胚胎干细胞系生成的分离纯化一种快速有效的方法

该方法的总体目标是纯化由人胚胎干细胞或 ES 细胞产生的内胚层细胞。这种方法可以帮助回答干细胞领域关于内胚层分化的关键问题。该技术的主要优点是去除未分化细胞后可以获得纯的内胚层细胞群。

在开始程序之前，每孔用 1 毫升基底膜基质包被六个孔细胞培养板。在室温下至少 30 分钟。然后，为了收获人 ES 细胞，用无菌玻璃牧场移液器从 80% 至 90% 汇合的人胚胎干细胞培养物中吸出培养基。

并用每孔 2 毫升 PBS 洗涤细胞。摇动板并吸出生理盐水以去除死细胞和碎片。接下来，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下，用 1 毫升无酶传代溶液试剂轻轻解离细胞簇，直到细胞表现出明显的破坏迹象，形成更小的簇。

大约 7 分钟后，向孔中加入 1 mL DMMF12 培养基。并使用 1 mL 移液器吸头上下移液数次，以将剩余的细胞聚集体分离成单个细胞悬液。使用相同的移液器，将细胞转移到离心管中，用 1 毫升新鲜的 DMMF12 培养基冲洗孔，将洗涤液汇集在管中。

离心细胞后，将沉淀重悬于 5 mL 补充有 ROCK 抑制剂的 ES 细胞培养基中。计数细胞，并在补充有 ROCK 抑制剂的培养基中以 1.5：4 乘以 10 至每孔的基底膜基质包被板上接种第五个细胞，以防止细胞凋亡。将细胞孵育约 24 小时。

然后使用无菌玻璃巴斯德移液器用 2 毫升原始条纹诱导培养基替换每个孔中的培养基。再培养 24 小时后，用内胚层诱导培养基更换培养基，孵育 48 小时，每天更换培养基。在培养的最后一天和收获细胞前至少一小时，向培养基中加入新鲜的 ROCK 抑制剂。

然后使用无菌玻璃巴斯德移液器从每个孔中吸出培养基，并用无酶传代溶液试剂解离细胞，如刚才所示。当获得单细胞悬液后，对细胞进行计数并离心。确保从此时起，所有培养基和缓冲液都含有 ROCK 抑制剂，以防止细胞死亡。

否则，它们在后退后将无法正确连接。将沉淀重悬于 100 μL PEB 缓冲液中，每 1 乘以 10 次补充 ROCK 抑制剂至第七个细胞。然后将 CXCR4 APC 抗体添加到细胞中。

轻轻弹动试管以混合。在 4 摄氏度下 15 分钟后，在 1 至 2 mL PEB 缓冲液中洗涤细胞，并使用无菌玻璃巴斯德移液器吸出上清液。将沉淀重悬于每 1 乘以 10 的 80 微升 PEB 缓冲液中，以重悬于第七个细胞中，并向细胞中加入 20 微升抗 APC 微珠。

轻轻轻弹混合样品。然后将细胞在 4 摄氏度下孵育 15 分钟。孵育结束时，用 1 至 2 mL 补充有 ROCK 抑制剂的 PEB 缓冲液洗涤细胞。

并将沉淀重悬于 500 μL 新鲜 PEB 缓冲液加抑制剂中。为了通过磁珠分离分离 CXCR4 + 细胞，将中等大小的磁柱加载到适当大小的磁力架上，并用 500 μL PEB 缓冲液和 ROCK 抑制剂预冲洗柱。当所有洗涤液从色谱柱顶部排出后，将整个磁珠标记的细胞体积涂到色谱柱上，将流过的液流收集在锥形管中。

用 500 μL PEB 缓冲液和 ROCK 抑制剂清洗色谱柱 3 次。然后将色谱柱从磁体转移到合适的收集管中。并将 1 ml PEB 缓冲液加 ROCK 抑制剂浸入柱中，以收集 CXCR4 + 细胞。

或者，可以单独收集所有流过样品，并且每个样品中的 20 微升等分试样可用于通过流式细胞术确定每个样品中 CXCR4 + 细胞的百分比。可以在第一次流出时重复此过程，以收集未与色谱柱结合的细胞。然后合并两个 CXCR4 + 样品并离心。

最后，将沉淀重悬于补充有 ROCK 抑制剂的 1 毫升内胚层诱导培养基中，并将细胞以适当密度接种在基底膜基质包被的细胞培养容器中。在分化之前，人 ES 细胞表达高水平的多能性标志物 SOX2。而未检测到确定的内胚层标志物 FOXA2。

分化后，ES 细胞的基因和蛋白质表达发生剧烈变化。事实上，在分化培养基中 4 天后，SOX17 和 FOXA2 在许多前 ES 细胞的细胞核内均匀共表达，这是明确内胚层定型的标志。一些细胞抵抗分化过程，不表达两种标记蛋白。

事实上，保留了它们的多能性标志物 SOX2 表达。在这个代表性实验中，在分化的第 3 天，近 60% 的收获的 ES 细胞表达 CXCR4，在对多能细胞和其他不需要的谱系细胞进行磁珠分选后，其纯度富集到 85% 以上。接种纯化的 CXCR4 + 细胞后，仅检测到少量 SOX2 + 细胞，其中大多数接种细胞表达 FOXA2。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两个小时内完成。在此程序之后，可以执行其他如免疫组织化学或 QPCR 来回答有关分化过程的其他问题。看完这个视频，您应该对如何通过磁珠分选纯化内胚层细胞有了很好的了解。