一种快速高效地纯化由人胚胎干细胞分化而来的内胚层细胞的方法

本方法的总体目标是从人类胚胎干细胞（ES细胞）中分离纯化内胚层细胞。该方法有助于解答干细胞领域中关于内胚层分化的关键科学问题。该技术的主要优势在于，通过去除未分化细胞，可获得高纯度的内胚层细胞群体。

开始实验前，用基底膜基质对六孔细胞培养板进行包被，每孔加入一毫升，室温孵育至少30分钟。随后，用无菌玻璃巴斯德吸管吸出80%至90%融合度的人类胚胎干细胞培养物中的培养基，以收集人类胚胎干细胞。

每孔加入两毫升 PBS 清洗细胞。振荡培养板并吸去盐水，以去除死亡细胞和碎片。接着，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下，用一毫升无酶传代溶液试剂轻柔解离细胞团块，直至细胞明显分散成较小的团块为止。

约七分钟后，向孔中加入 1 毫升 DMMF12 培养基。使用 1 毫升移液枪头上下吹打数次，使残留的细胞团块解离为单细胞悬液。用同一支移液枪将细胞转移至离心管中，并用 1 毫升新鲜 DMMF12 培养基冲洗孔壁，将冲洗液一并收集至该离心管中。

离心收集细胞后，将沉淀重悬于5毫升添加ROCK抑制剂的ES细胞培养基中。计数细胞，并将1.5×10⁵个细胞接种至基底膜基质包被的培养板中，每孔接种量为1.5×10⁵个细胞，培养基中需含有ROCK抑制剂以防止细胞凋亡。将细胞培养约24小时。

然后使用无菌的玻璃巴斯德吸管，将每孔中的培养基更换为 2 毫升原始条带诱导培养基。继续培养 24 小时后，将培养基更换为内胚层诱导培养基，进行为期 48 小时的孵育，并每天更换培养基。在培养的最后一天，且至少在收获细胞前 1 小时，向培养基中添加新鲜的 ROCK 抑制剂。

然后使用无菌的玻璃巴斯德吸管从每个孔中吸出培养基，并用无酶传代溶液试剂解离细胞，操作方法如前所述。当获得单细胞悬液后，对细胞进行计数并离心。此后务必确保所有培养基和缓冲液中均含有ROCK抑制剂，以防止细胞死亡。

否则，在回缩后将无法正确附着。用 100 微升 PEB 缓冲液重悬沉淀，每 1 × 10⁷ 个细胞加入 ROCK 抑制剂。然后向细胞中加入 CXCR4 APC 抗体。

轻轻振荡管子以混匀。4摄氏度孵育15分钟后，用一至二毫升PEB缓冲液洗涤细胞，并使用无菌玻璃巴斯德吸管吸除上清液。每1×10⁷个细胞用80微升PEB缓冲液重悬沉淀，然后向细胞中加入20微升抗APC磁珠。

轻轻弹击混匀样品。随后将细胞在4 °C条件下孵育15分钟。孵育结束后，用1至2毫升添加了ROCK抑制剂的PEB缓冲液洗涤细胞。

将沉淀重悬于500 µL新鲜PEB缓冲液（含抑制剂）中。通过磁珠分离法分离CXCR4+细胞时，将一个中等大小的磁性柱安装至匹配的磁铁上，并用500 µL PEB缓冲液（含ROCK抑制剂）预淋洗柱子。当洗涤液完全从柱子顶部流尽后，将全部磁珠标记的细胞悬液上样至柱中，用锥形管收集穿流液。

用500微升含ROCK抑制剂的PEB缓冲液洗涤柱三次。然后将柱子从磁铁上转移至合适的收集管中。再将1毫升含ROCK抑制剂的PEB缓冲液快速通过柱子，以收集CXCR4+细胞。

可选择性地分别收集所有流穿样品，并从每个样品中取 20 µL 等分试样，通过流式细胞术测定每个等分试样中 CXCR4+ 细胞的百分比。可利用第一次的流穿样品重复此步骤，以收集未与柱结合的细胞。然后合并所有分装的 CXCR4+ 样品并进行离心。

最后，将沉淀重悬于1毫升添加了ROCK抑制剂的内胚层诱导培养基中，并将细胞以适当的密度接种至包被有基底膜基质的细胞培养容器中。在分化之前，人胚胎干细胞高表达多能性标志物SOX2，而定型内胚层标志物FOXA2则未被检测到。

分化后，ES细胞在基因和蛋白质表达方面发生显著变化。事实上，在分化培养基中培养四天后，许多原先的ES细胞核内均一地共表达SOX17和FOXA2，这是定型内胚层分化的典型特征。部分细胞则抵抗分化过程，不表达这两种标志蛋白中的任何一种。

事实上，这些细胞仍保持其多能性标志物 SOX2 的表达。在此代表性实验中，分化第三天时，收获的 ES 细胞中近 60% 表达 CXCR4，经磁珠分选去除多能性细胞及其他非目标谱系细胞后，CXCR4+ 细胞纯度提高至 85% 以上。将纯化的 CXCR4+ 细胞接种后，仅检测到少量 SOX2+ 细胞，而绝大多数接种细胞表达 FOXA2。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在两小时内完成。在完成该步骤后，还可进行免疫组织化学或定量 PCR 等其他类似实验，以回答有关分化过程的更多问题。观看本视频后，您应能充分理解如何通过磁珠分选法纯化内胚层细胞。