人类血小板的LC-MS分析作为研究线粒体代谢的平台

该程序的总体目标是确定外源性治疗或疾病状态如何改变细胞代谢。这种方法有可能揭示疾病状态或应用的毒素如何影响细胞代谢。一旦知道了这一点，我们的方法就有能力揭示某种干预是否可以纠正缺陷。

这项技术的主要优点是它不依赖于转化的细胞系，因此它更有可能提供与人类健康直接相关的答案。要开始此程序，请制备 10 毫摩尔的鱼藤酮二甲基亚砜储备溶液。对 10 毫摩尔鱼藤酮储备液进行连续稀释，以获得鱼藤酮浓度范围为 1 纳摩尔至 100 微摩尔的溶液。

接下来，将 50 微升每种储备溶液添加到 5 毫升先前制备的富集 Tyrode 缓冲溶液中，以制备鱼藤酮浓度范围为 10 皮摩尔至 1 微摩尔的溶液。向其中一个缓冲溶液样品中加入 50 μL DMSO 作为载体对照。要从全血中分离血小板，将全血样品以 175 x g 离心 15 分钟，不得间断。

完成后，将 1 毫升富含血小板的上层血浆层转移到 1.5 毫升微量离心管中。转移富含血小板的血浆时，注意不要干扰血沉棕黄层，以免血小板沉淀被淋巴细胞污染。以 400 x g 的离心速度离心富含血小板的血浆层 5 分钟。

然后，吸出 supernatent。对于每种情况，使用不少于 3 个生物学重复，将血小板沉淀重悬于 1 毫升先前制备的鱼藤酮溶液中。然后，将重悬的血小板在设置为 95% 湿度和 5% 二氧化碳的水套式二氧化碳培养箱中在 37 摄氏度下孵育 1 小时。

此时，通过以 3000 x g 的离心速度离心样品 3 分钟来沉淀血小板。吸出超天然垫后，加入适当的稳定同位素标记的内标。然后，将血小板重悬于 750 微升冰冷的 10% 三氯乙酸中。

用 0.5 秒脉冲对每个样品进行脉冲超声处理 30 次。离心后，将 C18 固相萃取柱贴在真空歧管上。用 1 mL 甲醇调节色谱柱。

然后，用 1 毫升双蒸水平衡色谱柱。将样品衍生的上清液穿过色谱柱。完成后，用 1 毫升水清洗色谱柱。

接下来，将 10 毫升玻璃离心管装入真空歧管中，以收集洗脱馏分。用 1 mL 25 mmol 乙酸铵和甲醇洗脱色谱柱。在氮气下干燥洗脱液后，将干燥的残留物重悬于 50 微升 5%5-磺基水杨酸中，并将样品转移到 HPLC 文件中进行分析。

正如先前在 SH-SY5Y 细胞中报道的那样，响应鱼藤酮的乙酰辅酶 A 硫酯相对水平的变化被认为是由复合物 1 的抑制引起的。具体来说，琥珀酰辅酶 A 呈剂量依赖性降低，同时 β-羟基丁酰辅酶 A 增加，而乙酰辅酶 A 水平保持不变。对鱼藤酮处理的人血小板的分析揭示了高度一致的结果，并提供了一组独特的实验数据。

值得注意的是，这一观察结果强调了对鱼藤酮反应的线粒体依赖性，因为血小板缺乏细胞核。按照此程序，可以执行其他方法（如代谢示踪）来回答其他问题，例如：这种治疗或疾病状态如何影响底物的利用？如果我们发现某些代谢物的水平发生了变化，为什么会发生变化？

通路中的哪些步骤受到影响，以何种方式受到影响？观看此视频后，您应该对如何从全血中分离血小板、进行受控离体激发和提取乙酰辅酶 A 硫酯用于 LCMS 分析有很好的了解。