Name: 从外膜囊泡内蛋白质导演包装大肠杆菌:设计，生产和纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 学习从大肠杆菌培养基中纯化和表征酶填充外膜囊泡的方法，用于无细胞催化反应。该技术显著提高酶稳定性，适用于治疗开发和环境修复等多种生化应用领域。

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本研究由美国海军研究办公室通过向海军研究实验室提供的核心资金资助。

1. 质粒的制备
<ol>
	<li>制备质粒（例如， pET22质粒，包含锚定蛋白（OmpA）与生物正交连接结构域的融合蛋白（本实验方案中称为anchor-ST）、表位标签（如用于纯化和鉴定的6xHis、myc或FLAG标签）、周质空间定位标签、抗生素抗性基因，以及根据所选细菌菌株匹配的复制起点7.
	<ol>
		<li>使用市售质粒DNA提取试剂盒，按照生产商提供的操作说明从过夜培养物中提取质粒DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备质粒（例如， pACYC184），其中包含待包装至OMV内的酶/蛋白质（PTE），该酶/蛋白质与锚定蛋白的互补生物正交连接结构域融合（本方案中称为enzyme-SC）、表位标签、周质定位标签、与锚定蛋白质粒不同的抗生素抗性基因，以及根据所选细菌菌株确定的合适复制起点7.
	<ol>
		<li>使用市售质粒DNA提取试剂盒，按照生产商提供的操作说明从过夜培养物中提取质粒DNA7.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. OMV 包装 E. coli 菌液的制备
<ol>
	<li>质粒提取
	<ol>
		<li>使用商业质粒提取试剂盒，按照制造商提供的方案，从不同的维持细胞系中纯化编码酶-SC构建体和锚定-ST构建体的质粒7。通过测量260 nm和280 nm处的吸光度确定DNA浓度和纯度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共转化
	<ol>
		<li>选择一种市售的E. coli菌株以促进蛋白表达。 
		注：本实验中使用BL21(DE3)细胞。由于锚定-ST构建体依赖T7启动子和T7 RNA聚合酶进行蛋白表达，因此需要含有T7溶原基因的菌株。若使用其他细菌菌株，则必须具备T7溶原基因，或使用非pET22质粒7。</li>
		<li>将纯化的质粒DNA稀释至等摩尔浓度，然后根据所选感受态细胞的制造商方案，通过热激转化或电穿孔法将其转入感受态细菌细胞中。</li>
		<li>将转化后的细胞涂布于含有抗生素的Luria-Bertani（LB）琼脂平板上，同时添加氨苄青霉素（pET22）和氯霉素（pACYC184），终浓度均为25 µg/ml。</li>
		<li>将培养皿置于37 °C过夜培养，以筛选出同时含有两种质粒的克隆。 
		注：存活于抗生素筛选条件下的菌落将用于后续所有OMV的制备。在所有液体培养中均需添加抗生素（氨苄青霉素和氯霉素），以维持选择压力并确保两种质粒的存在。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 外膜囊泡的制备
<ol>
	<li>菌落扩增
	<ol>
		<li>从2.2.4节所述的筛选平板中挑取单菌落，接种于5 ml含有前述浓度抗生素（步骤2.2.3）的培养基（通常为TB或LB）中。</li>
		<li>将过夜培养的种子液按1:100的比例稀释至带挡板的培养瓶中。 
		注：培养基体积应介于250–500 ml之间。</li>
		<li>在37 °C、250 rpm振荡条件下培养，以确保培养液获得充分通气。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>各质粒的诱导表达
	<ol>
		<li>使细菌培养物生长至OD600为0.6–0.8，通常在接种主培养瓶后约培养3小时。</li>
		<li>为提高PTE-SC载荷囊泡的最终产量，将整个培养物在7,000 × g离心15分钟，弃上清后将菌体沉淀重悬于预热的新鲜培养基中。 
		注：此可选步骤有助于在诱导PTE-SC表达前去除培养基中已存在的空外膜囊泡（OMV）。</li>
		<li>将L-阿拉伯糖溶于水配制成20%的储存液，并使用0.22 µm滤器进行无菌过滤。L-阿拉伯糖溶液可在4 °C保存2–4周。</li>
		<li>向培养瓶中加入L-阿拉伯糖溶液，使其终浓度为0.2%，以启动PTE-SC的表达。 
		注：此步骤有助于在通过诱导突变型OmpA-ST促进囊泡化增加之前，预先在周质空间中富集PTE-SC。</li>
		<li>将异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）溶于水配制成1 M溶液，并使用0.22 µm滤器进行无菌过滤。 
		注：IPTG一旦溶解后应立即使用。分装后的IPTG溶液可于–20 °C冷冻保存3–6个月，使用前可迅速解冻。</li>
		<li>在额外培养3小时后，加入IPTG至终浓度0.5 mM，以启动OmpA-ST的表达。</li>
		<li>继续在37 °C振荡培养8–14小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 外膜囊泡纯化
<ol>
	<li>完整细菌的去除
	<ol>
		<li>将细菌培养基在 4 °C 条件下以 7,000 × g 离心 15 分钟，使完整细菌沉淀。</li>
		<li>小心倾倒并保留离心后位于细胞沉淀上层的培养基，注意不要扰动细胞沉淀。</li>
		<li>重复步骤 4.1.1 和 4.1.2，再进行一次离心循环，以确保从培养基中彻底去除所有完整细菌，注意倾倒并保留培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质聚集体的去除
	<ol>
		<li>使用 0.45 µm 膜滤器进一步纯化细菌培养基，以去除残留细菌及不需要的大分子细胞物质。 
		注意：为获得更高的回收率并减少蛋白质吸附，建议使用生物相容性膜材料，如醋酸纤维素（CA）或聚偏二氟乙烯（PVDF）。对于小于 100 ml 的样品使用注射器滤器，大于 100 ml 的样品则使用真空滤器。
		<ol>
			<li>进行注射器过滤时，将培养基吸入无菌的 10–50 ml 注射器中。将 0.45 µm 滤膜连接至注射器鲁尔端口，推动活塞，将滤过液收集至新容器中。</li>
			<li>进行真空过滤时，将培养基转移至无菌过滤装置中。将装置连接至真空泵或水抽泵以产生负压。将过滤后的培养基转移至新容器中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过超速离心分离外膜囊泡（OMV）
	<ol>
		<li>将过滤后的培养基加入离心管中，注意在离心机中对称位置的离心管需保持质量平衡。</li>
		<li>在超速离心机中，使用与仪器和离心管匹配的转子，在 4 °C 条件下以约 150,000 × g 离心 3 小时，使 OMV 沉淀。</li>
		<li>离心结束后立即小心倾去上清液（即去除 OMV 后的培养基），避免扰动 OMV 沉淀；若让 OMV 沉淀长时间留在液体中，会导致沉淀软化，降低 OMV 回收率。 
		注意：该沉淀通常呈浅棕色，其可见性取决于初始细菌培养物的量，可能肉眼可见也可能不可见。也可选择直接从离心管顶部吸除上清液，需注意去除的培养基越多，最终 OMV 样品纯度越高。</li>
		<li>将离心后的上清液保存，用于后续动态光散射（DLS）检测，以确认 OMV 颗粒已完全从培养基中去除。</li>
		<li>向 OMV 沉淀中加入 0.5–1 ml 无菌过滤的磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）或 pH 8.0 的 100 mM N-环己基-2-氨基乙磺酸（CHES）缓冲液，室温孵育 30 分钟，确保沉淀不干燥。 
		注意：溶液离子强度、pH 和温度的极端条件可能导致 OMV 溶解度降低并促进其聚集。</li>
		<li>小心用移液器将纯化的 OMV 溶液从离心管中转移，轻柔混匀，确保整个沉淀完全溶解。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 外膜囊泡表征
<ol>
	<li>根据各仪器配套的制造商操作规程，使用任何市售的动态光散射（DLS）或纳米颗粒追踪分析软件，测定外膜囊泡（OMV）的粒径分布和颗粒浓度。 
	注意：本实验中使用 NanoSight LM10 纳米颗粒追踪系统及 NTA 2.3 分析软件测定 OMV 的粒径分布和浓度。
	<ol>
		<li>打开软件。</li>
		<li>开启显微镜，并清洁显微镜及纳米颗粒追踪单元的所有表面。</li>
		<li>使用 1 ml 无菌注射器通过鲁尔接头将约 0.5 ml OMV 样品直接加入颗粒追踪装置的观察窗中，确保完全覆盖观察区域，且避免向系统中注入气泡。</li>
		<li>将纳米颗粒追踪单元放置于显微镜载物台上，并打开激光器。</li>
		<li>在软件中点击 &#34;Capture&#34;。</li>
		<li>调节显微镜焦距和载物台位置，使软件窗口中的预览画面清晰显示颗粒。</li>
		<li>调节 &#34;Camera Shutter&#34; 和 &#34;Camera Gain&#34;，直至在暗背景下清晰观察到明亮的颗粒。</li>
		<li>将采集时长调整为 60 秒。</li>
		<li>点击 &#34;Record&#34;。</li>
		<li>当系统提示时，输入样品/设备温度，标记样品，并在每次运行结束后将视频数据保存至用户指定的文件夹。</li>
		<li>将所有分析参数（检测阈值、模糊度、最小轨迹长度、预期最小颗粒尺寸）保持在自动检测模式，然后点击 &#34;Process Sequence.&#34; 
		注意：请参考仪器手册了解如何独立调节各参数以优化分析结果。</li>
		<li>记录软件测定的颗粒粒径分布及每毫升颗粒浓度。 
		注意：典型的 OMV 流体动力学粒径范围为 30–200 nm，颗粒浓度约为 ~10 × 108 个/ml。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定 OMV 蛋白质含量
	<ol>
		<li>采用标准 SDS-PAGE 和 Western 印迹实验流程，评估 OMV 的纯度、酶的表达水平以及 SC-ST 交联效率7。 
		注意：交联效率不会达到 100%7。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 酶包装的验证
<ol>
	<li>PTE活性检测
	<ol>
		<li>在25 °C条件下，使用合适的缓冲液（如100 mM CHES缓冲液，pH 8）在比色皿或96/384孔板中进行所有酶学检测。</li>
		<li>向90 µl CHES缓冲液中加入5 µl 1:1,000稀释的对氧磷（paraoxon）溶液和5 µl纯化的OMV（约比培养基中的OMV浓度浓缩36倍）。 
		注意：对氧磷是一种有毒农药，必须根据生产商和机构的指南进行操作。</li>
		<li>以 405 nm 波长（ε = 18.1 mM）每隔 20 秒定期读取吸光度，总反应时间约为 2 小时-1cm-1）以及348 nm（等吸收点，ε = 5.4 mM-1厘米-1）以监测显色底物对氧磷分解产物的反应进程， p-硝基苯酚 
		注意：当 pH 值高于 8 时，主要的去质子化形式为 p-硝基苯酚存在时，可在405 nm处进行准确定量监测。在所有其他复杂体系或较低pH溶液中，由于存在多种形态的产物，必须利用348 nm处的等吸光点进行检测。 p-硝基苯酚将存在。</li>
		<li>通过确定第6.1.3步中进程曲线线性部分的斜率，计算初始反应速率，以比较各样品中PTE的相对含量、包装效率及PTE总产量。</li>
		<li>采用标准酶学测定方案进行检测 KM，V最大值 和 k猫 用于OMV包封的PTE。 
		注意：可利用林-伯氏双倒数作图法（Lineweaver-Burk分析）测定这些动力学参数，其中y轴截距等于1/V最大 斜率 = KM/最大值20.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>跨膜底物/产物扩散
	<ol>
		<li>按照步骤6.1所述方法，使用CHES缓冲液中体积分数为0–3%的Triton X-100进行浓度梯度增加，执行相同的动力学检测分析。 
		注意：在可溶性OMV中加入Triton X-100可破坏脂质双分子层，使OMV内容物充分暴露于反应溶液中。</li>
		<li>计算并比较每个Triton X-100浓度下的初始反应速率，以验证底物/产物是否穿过膜结构。若与不含Triton X-100时的酶活性（初始反应速率）相比，酶活性变化较小，则表明底物/产物能够跨膜转运。若在Triton X-100存在时酶活性显著升高，则表明底物可能无法自由扩散进入外膜囊泡（OMV）。</li>
		<li>在含有Triton X-100的条件下检测游离酶活性（如上文第6.1节所述），以验证酶活性未受到该表面活性剂本身的抑制。 
		注意：如果Triton X-100对活性影响较大，可选用其他添加剂（如皂苷或各类聚山梨酯/Tween表面活性剂）来破裂OMV膜，可能更为合适。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 外膜囊泡储存
<ol>
	<li>冷冻
	<ol>
		<li>将约 100 µl 纯化的 OMV 直接放入液氮中，快速冷冻样品，注意不要将离心管完全浸入液氮，也不要让液氮直接接触样品本身。 
		注意：纯化的 OMV 可直接在纯化过程中用于溶解 OMV 沉淀的缓冲液中进行速冻，无需额外添加冷冻保护剂7。</li>
		<li>将速冻后的分装样品储存在 -80 °C 条件下。</li>
		<li>通过将样品置于室温（RT）条件下解冻第 7.1.1 步的冷冻分装样品，注意不要加热样品。</li>
		<li>在以该方式制备所有储存样品之前，应执行第 6.1 步所述的酶活性测定，比较冻融前后的初始反应速率，以确认酶活性在冻融后无显著损失。 
		注意：若发现冷冻导致酶活性下降，应将纯化的 OMV 储存在 4 °C 条件下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冻干
	<ol>
		<li>使用市售的冻干设备对速冻后的纯化 OMV 分装样品进行冻干处理21。</li>
		<li>将冻干后的分装样品在室温下可储存数周，或在 -80 °C 下长期储存数月。</li>
		<li>向冻干的 OMV 中加入与冻干前相同体积的纯化水，在室温下静置 30 分钟以重新水合样品。必要时轻轻混匀，注意不要涡旋或超声处理 OMV。</li>
		<li>在无需预先稀释或溶解的应用中，可将冻干的 OMV 粉末直接添加至使用点。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案旨在展示一种典型的定向包装技术，其中目标酶由大肠杆菌（E. coli）产生并被包装至外膜囊泡（OMV）中。与许多复杂技术一样，该方案可在多个环节进行修改，以适应不同具体应用需求，部分修改示例如下文所述。尽管OMV包装及酶封装机制可根据特定需求进行调整，但本方案中仍有一些步骤对成功实施至关重要。首先，完整细菌及细胞碎片的去除极为关键，将直接影响后续所有定量或样品分析的结果。通常，通过两次连续离心结合过滤步骤足以去除这些污染物。然而，在每次离心后倾倒上清液时，均需格外小心，以尽量减少污染物的转移。类似地，超速离心后所得的最终OMV沉淀通常仅松散地附着于离心管底部。在最后阶段，移除废弃培养基时必须谨慎操作，确保沉淀物在容器底部保持不动。在某些情况下，最好在使用动态光散射（DLS）或纳米颗粒追踪分析仪完成样品分析之前，暂时保留最终的培养基，以确认OMV沉淀未在方案的最后步骤中丢失。以下是一些可能在本方案及其他针对研究人员特定需求定制的类似方案中出现的额外注意事项。
该系统中使用磷酸三酯酶（PTE）为有机磷污染区域的环境修复提供了优良的酶封装模型，且PTE可被其他目标...

本文介绍了一种用于设计、制备和纯化载酶细菌外膜囊泡（OMV）的方法。OMV 是一种小的、主要为单层膜结构的蛋白脂质体，大小范围为 30–200 nm1,2。迄今为止研究的所有革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均已被证实能够从其表面释放 OMV 或细胞外囊泡（EV）3,4。由于分泌 OMV 的细菌种类多样，且 OMV 具有多种不同功能，其确切的生成机制尚未完全阐明。研究表明，OMV 可运输多种类型的货物，包括小分子、肽、蛋白质以及遗传物质，在复杂的信号传导、基因转移和毒力功能中发挥重要作用5,6。
OMV 生物合成的确切机制尚未被充分阐明，且在不同细菌物种之间似乎存在差异。尽管如此，我们已开发出一种方法，通过在目标蛋白与细菌外膜及后续 OMV 中一种高丰度内源蛋白之间构建合成连接，从而提高重组蛋白向 OMV 中的包装效率。在缺乏这种合成连接或人工引入亲和力的情况下，重组表达蛋白与 OMV 之间的相互作用极为有限，所观察到的包装效率非常低7。这一结果是可以预期的，因为蛋白进入 OMV 的过程要么是在细菌表面 OMV 形成的瞬间通过随机包封实现，要么是通过目前尚不明确的定向包装机制完成。已有研究发现，仅通过在周质空间过量表达蛋白即可实现一定程度的包装，该策略依赖于随机包封，但其包装效果高度依赖于具体蛋白，某些蛋白可高效包装，而另一些则完全无法包装8-10。通过利用常见的合成生物学技术，我们旨在对大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）进行改造，使其能够同时生产、包装并分泌一种具有活性的目标酶进入 OMV，从而绕过当前关于 OMV 形成机制及细菌选择货物蛋白进行包装机制的知识局限。
在本应用中，选择了一种分裂蛋白生物偶联系统作为合成连接方式，以促进定向包装至OMV中。顾名思义，分裂蛋白生物偶联系统由两个可相互结合的互补亚基结构域组成。本实验方案所选用的分裂蛋白结构域称为SpyCatcher（SC）和SpyTag（ST）结构域，源自Streptococcus pyogenes的纤连蛋白结合蛋白（FbaB）11。该分裂蛋白系统的独特之处在于，当两个亚基彼此靠近时，邻近的天冬氨酸和赖氨酸残基之间会自发形成异肽键，从而产生共价连接。异肽键的形成无需添加分子伴侣蛋白、催化酶或辅因子，可在室温（RT）及广泛的生理相关条件下快速发生12。
作为概念验证，来自磷三酯酶（phosphotriesterase, PTE）（EC 3.1.8.1） Brevundimonas diminuta 被选中进行包装到 E. coli 衍生的外膜囊泡13PTE 含有一个双核 Zn/Zn 活性位点，能够通过水解反应将芳基二烷基磷酸酯分解为二烷基磷酸酯和芳基醇。14有机磷化合物通过抑制神经肌肉接头处乙酰胆碱酯酶对乙酰胆碱的水解作用，干扰正常的神经递质功能，因此具有极高危险性15长时间或大量接触有机磷酸酯通常会导致无法控制的抽搐，并通常引起死亡 通过 窒息。尽管PTE对对氧磷（一种高效杀虫剂）表现出最高的催化活性，但它 also 能够水解多种其他农药以及V/G类化学神经毒剂。16为促进外膜囊泡（OMV）的包装，设计了一种细菌质粒，该质粒编码一个基因构建体，包含一个可诱导启动子、一个周质定位序列以及位于SC基因序列上游的一个短的多克隆位点。将PTE基因插入到信号肽序列与SC序列之间，可构建一种遗传开关，使PTE-SC融合蛋白靶向定位至周质空间，从而实现其在OMV中的包装。尽管本文所述研究主要针对PTE酶，但该酶基因具有可替换性，可被其他基因序列替代，以实现不同酶或蛋白质的OMV包装。
作为合成连接的第二部分，选择了一种丰富的外膜蛋白（OmpA）来呈递ST肽序列。尽管锚定蛋白的选择可以有所不同，但所选蛋白必须具备一个位于周质空间的可容许结构域，能够耐受融合构建体而不引起细胞毒性，已知存在于OMV中，并且在重组表达时不会发生聚集。OmpA是一种37.2 kDa的跨膜孔蛋白，已知在细菌外膜及后续产生的OMV中高度表达17。它参与大小小于&#60;2 nm的小分子物质穿过细菌膜的转运过程18。天然OmpA具有两个结构上独特的结构域：一个跨膜β桶状模体，以及一个位于周质可溶的C端部分，后者已知可与肽聚糖相互作用19。在本研究设计的突变型OmpA-ST融合蛋白中，OmpA的C端部分被删除，并将ST肽融合至朝向周质的N端或C端。删除OmpA的周质部分会减少外膜与肽聚糖之间的相互作用，导致膜稳定性下降，从而引发过度出泡7。此外，在表达重组OmpA-ST构建体的同时保留了基因组来源的OmpA，以避免外膜发生严重失稳。

<table><tbody><tr><td>IPTG</td><td>任何</td><td></td><td>始终新鲜配制，或分装后冷冻保存。</td></tr><tr><td>L-阿拉伯糖</td><td>任何</td><td></td><td>可预先配制并在 4 ℃ 保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>任何</td><td></td><td>在培养基经高压灭菌并冷却至适当温度后，立即加入。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氯霉素&amp;nbsp;</td><td>任何</td><td></td><td>在培养基经高压灭菌并冷却至适当温度后，立即加入。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TB/LB 培养基</td><td>任何</td><td></td><td>其他生长培养基可能具有类似效果。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>任何</td><td></td><td>多种潜在适用的表面活性剂之一。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带挡板的培养瓶</td><td>任何</td><td></td><td>挡板可促进更高水平的通气。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CHES</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP318-100</td><td>用于对氧磷降解的最佳缓冲液（pH &gt; 8).</td></tr><tr><td>对氧磷</td><td>Chem Service</td><td>N-12816</td><td>剧毒物质，需小心操作并妥善处理。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.45 微米注射器滤器 &amp;micro;m</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>60183-221（30 mm）</td><td>滤膜直径取决于样品体积。低蛋白结合膜至关重要。</td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>新不伦瑞克</td><td>Excella E24</td><td>精确的温度控制和混匀对细菌的可重复性生长至关重要。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall 细胞培养离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>RC 5B PLUS</td><td>可处理大体积（500 ml）且离心力可达 7,000 x g 的培养物离心机</td></tr><tr><td>Sorvall 超速离心机&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>WX Ultra 90</td><td>可承受离心力 &amp;ge;150,000 × g</td></tr><tr><td>超速离心机转子</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AH-629</td><td>确保使用正确的转子和离心管，并且所有部件均已正确平衡。</td></tr><tr><td>超透明超速离心管（25 x 89 毫米）</td><td>贝克曼库尔特</td><td>344058</td><td>使用前确保无应力裂纹，并确保管体精确平衡。</td></tr><tr><td>分光光度计&amp;nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000</td><td>酶动力学测定所必需。</td></tr><tr><td>DLS/粒子示踪</td><td>NanoSight&amp;nbsp;</td><td>LM10</td><td>用于OMV大小分布和浓度测定。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)</td><td>NEB</td><td></td><td>合适的细菌表达菌株。</td></tr><tr><td>pET22</td><td>EMD Millipore</td><td>69744-3</td><td>可使用其他质粒替代这些质粒。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pACYC184</td><td>NEB</td><td></td><td>其他质粒可替代这些质粒使用。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>示例试剂盒</td></tr></tbody></table>

定向蛋白质包装至外膜囊泡中 大肠杆菌设计、生产与纯化

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

随着合成生物学技术在编程外膜囊泡（OMV）方面的应用日益受到关注，OMV 正在展现出许多新颖且独特的用途，而在这些领域中，传统纳米颗粒的合成已被证明过于困难。迄今为止，所有革兰氏阴性细菌均被证实能够产生 OMV，并可包裹多种类型的货物分子，包括小分子、肽、蛋白质以及遗传物质。由于其所携带货物的多样性，OMV 被认为参与了多种生物学过程，具体功能取决于产生 OMV 的细菌种类，例如细胞间通讯、基因转移以及毒力因子的递送等。直到最近，随着能够控制并定向将重组蛋白包装进 OMV 的技术的发展，细菌来源的 OMV 才得以被广泛应用于多种领域。本实验方案描述了一种用于生产、纯化和使用酶包装型 OMV 的方法，该方法可显著提高重组酶的整体产量、增强囊泡形成能力，并提升酶的稳定性。成功实施本方案后，将获得一种能够同时表达重组蛋白并将其定向封装至 OMV 中的工程菌株，其原理是通过构建重组蛋白与外膜锚定蛋白之间的合成连接。本方案还详细说明了从细菌培养物中分离 OMV 的方法，以及正确的操作技术，并讨论了在将本方案应用于其他独特场景（如药物递送、医学诊断和环境修复）时需要考虑的关键因素。

同时表达两种重组蛋白（如本方案所述OMV包装策略所需）可通过多种不同途径实现。本文采用了一种双质粒系统，包含相容的复制起点和独立的可诱导基因表达盒。为表达PTE-SC构建体，对一种商用质粒骨架（pACY184）进行改造，插入一个阿拉伯糖诱导型基因表达盒，以及一段双精氨酸周质定位信号序列，其后连接一系列独特的限制性酶切位点，便于将酶基因克隆为与C端SC蛋白的融合形式。编码外膜锚定蛋白的质粒构建体为商用载体pET22，其利用 lac 用于调控蛋白表达的操纵子 pelB 周质定位序列。将短的ST序列克隆至截短的OmpA蛋白中，随后插入表达质粒。在两种质粒中均保留C末端的六组氨酸序列，以便同时鉴定OMV样品中的融合蛋白。这些基因构建体的构建与表征，包括OmpA的N末端和C末端ST融合构建体，已在Alves中进行了详细描述。 等7. 此处所述的基因构建体可能不适用于所有酶的包装。在某些情况下，可能需要更换周质定位信号、调控元件或表位标签。此外，某些蛋白质可能过大，完全无法穿越内膜。酶活性及外膜囊泡（OMV）...

本文介绍了一种用于制备、纯化和使用酶包封外膜囊泡（OMV）的实验方案，该囊泡可提高酶的稳定性，适用于多种不同应用。

对外膜囊泡（OMV）应用合成生物学技术进行编程的兴趣日益增长，正推动该领域产生一系列非常有趣且独特的研究成果……

本实验的总体目标是从细菌外膜囊泡（OMV）中纯化并表征含酶的囊泡，以用作体外催化试剂。该酶分离技术可从培养基中收获细菌外膜囊泡，并用于无细胞催化有机磷化合物的反应。与传统方法相比，细菌外膜囊泡内的定向包装显著提高了酶在多种反应和储存条件下的稳定性，而传统方法通常会导致酶活性逐渐且持续地丧失。该技术的应用前景涵盖多种领域中具有重要意义的蛋白质封装，例如治疗剂的开发、环境修复或无细胞催化系统的构建。尽管本方案详细描述了从大肠杆菌（E.coli）中纯化外膜囊泡（OMVs）的方法，但通过调整封装策略，这些技术也可轻易用于从多种微生物细胞培养物中纯化OMVs。根据文本方案在细菌中生成外膜囊泡（OMVs）后，将完整的细菌培养基在4°C条件下以7,000 × g离心15分钟。小心地移除并保存上清液，注意不要扰动细胞沉淀。然后，将上清液进行第二次离心，以确保从培养基中彻底去除所有细菌。为去除保存的培养基中的蛋白质聚集体和较大的细胞成分，将溶液吸入一个无菌的10至50毫升注射器中。将一个0.45微米的滤器连接到注射器的接头端。然后推动活塞，将滤过液收集到一个新的离心管中。或者，也可通过将培养基转移至无菌过滤装置，进行真空过滤。将装置连接至真空泵或抽滤瓶以产生负压。将滤过的培养基转移至新的容器中。为分离OMVs，将滤过的培养基转移至超速离心管中。使用与所用离心管匹配的转子，在约150,000 ×g及4 °C条件下将培养基离心3小时。超速离心后应立即进行后续操作，以避免沉淀物损失；将上清液（即去除了OMV的培养基）小心倾出，留下颜色略呈棕褐色的OMV沉淀，该沉淀可能肉眼可见，也可能不可见。超速离心后形成的OMV沉淀可能仅轻微附着于离心管壁。倾倒时应小心操作，确保沉淀物不被扰动或丢失。将上清液保留，用于后续动态光散射分析，以确认培养基中的OMV颗粒已完全去除。向沉淀物中加入0.5至1毫升无菌过滤的PBS（pH 7.4）或其他根据实验需求或条件确定的过滤缓冲液，在室温下孵育30分钟。然后小心地用移液器吸取纯化的OMV溶液，轻轻混匀，确保整个沉淀物已完全溶解。为确定OMV的粒径分布，打开所用仪器的动态光散射（DLS）纳米颗粒追踪软件。开启显微镜，并清洁显微镜及纳米颗粒追踪装置的所有表面。使用一个1毫升无菌注射器，通过下方接口将约0.5毫升OMV样品直接加入颗粒追踪仪的观察窗口，注意完全覆盖整个观察窗口，同时避免向系统中注入气泡。将纳米颗粒追踪单元放置在显微镜载物台上，打开激光器，然后在软件中点击“Capture”（采集）。调节显微镜焦距和载物台，使软件窗口预览屏幕中的颗粒可见。调节相机快门和增益，直至在暗背景上清晰显示明亮的颗粒。将采集时长设为60秒，然后点击“Record”（记录）。当系统提示时，输入样品设备温度，标记样品，并在每次运行结束后将视频数据保存至用户指定的文件夹中。将所有分析参数保持在自动检测模式，然后点击“处理序列”。记录软件测定的粒径分布及浓度，单位为每毫升颗粒数。为确定OMV的蛋白质含量，可采用SDS-PAGE和Western印迹法评估OMV纯度、酶的产生情况以及SpyCatcher（SC）与SpyTag（ST）交联效率。必须确认目标酶和锚定蛋白的表达。重组蛋白的表达常因多种原因而失败，因此应在进行OMV表征之前确认蛋白是否成功表达。进行磷酸三酯酶（PTE）活性检测时，将5微升经CHES缓冲液稀释1,000倍的对氧磷（paraoxon）溶液加入含有5微升纯化OMVs的90微升CHES缓冲液中。在总共约两小时的反应时间内，每隔20秒在405纳米和348纳米处测定吸光度，以监测显色性对氧磷降解产物对硝基苯酚（p-nitrophenol）的生成进程。最后，根据文本方案进行数据分析。图中显示了通过扫描电镜观察的纯化大肠杆菌外膜囊泡（OMVs）形态示例。根据颗粒追踪仪器测定，OMVs 的大小范围为 50 至 250 纳米。在该图中，显示了 OMVs 的绝对浓度。当N端OMP-A-ST与PTE-SC在阿拉伯糖和IPTG存在下共转化时，与对照样品相比，观察到OMV产量显著增加。此处的SDS-PAGE和Western Blot进一步表征了OMV的蛋白质组成以及OMP-A-ST、天然OMP-A、PTE-SC和OMP-A-ST-PTE-SC的重组蛋白表达情况。在本图中，通过使用对氧磷（paraoxon）作为显色底物测定初速度，确定了菌体沉淀、超速离心上清液及纯化的超速离心OMV沉淀中总体PTE表达水平和OMV包装效率。在此实验中，使用Triton X-100验证了对氧磷（paraoxon）在完整OMV双层膜中的跨膜转运。加入或不加入去垢剂时，酶活性差异很小，表明对氧磷可自由通过OMV上的内源性孔道。最后，如本实验所示，PTE-SC的动力学数据拟合为标准的米氏酶动力学方程，该数据来自在阿拉伯糖和IPTG存在下，与N端OMP-A-ST共转化的PTE-SC，以及在阿拉伯糖诱导条件下表达的PTE-SC。在完成所有基因构建并确认无误后，酶的包装和OMV纯化可在两天内完成。每当开发新的构建体时，需要第三天来确认和表征OMV。在进行该实验操作时，务必注意核实所有材料和离心设备的安全等级。此外，在进行下一步之前，验证每一步骤的成功至关重要。本文所述的表征步骤可结合其他方法，以确认酶的包装情况及OMV的形态。蛋白质浓度、脂质含量、LPS浓度以及其他多种特性可能因不同载荷和偶联条件而异，并可能影响后续应用。观看本视频后，您应能够充分理解如何纯化和表征含有酶的外膜囊泡（OMVs），并开展初步检测以评估其酶活性。请务必注意，操作细菌和化学试剂可能具有极高危险性，在执行本实验流程时，应始终采取适当无菌技术并使用个人防护装备等安全预防措施。

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科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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