从外膜囊泡内蛋白质导演包装大肠杆菌:设计，生产和纯化

该程序的总体目标是纯化和表征酶填充的细菌外膜囊泡，用作体外催化试剂。这种酶分离技术允许从培养基中收获细菌 OMV，然后用于对有机磷酸盐化合物进行无细胞催化。细菌 OMV 内的定向包装可显著提高酶在一系列反应和储存条件下的稳定性，这与通常会导致酶活性逐渐持续丧失的传统技术不同。

该技术的含义延伸到与多个领域相关的蛋白质包装，例如治疗剂的开发、修复或无细胞催化系统的开发。虽然该协议详细介绍了从大肠杆菌中纯化 OMV，但对包装策略进行修改的技术可以很容易地用于从各种微生物细胞培养物中纯化 OMV。根据文本方案在细菌中生成外膜囊泡或 OMV 后，将完整的细菌培养基在 7， 000 倍 G 和 4 摄氏度下离心 15 分钟。

取出并保存上清液，注意不要干扰细胞沉淀。然后，将上清液进行第二次离心，以确保从培养基中去除所有细菌。要从保存的培养基中去除蛋白质聚集体和大细胞物质，请将溶液吸入 10 至 50 mL 无菌注射器中。

连接一个 0.45 微米的过滤器以诱捕注射器的末端。然后按下柱塞并将流出液收集到新管中。或者，通过将培养基转移到无菌过滤装置中来对培养基进行真空过滤。

将装置连接到真空泵或水槽吸气器以产生吸力。将过滤后的培养基转移到新容器中。为了分离 OMV，将过滤后的培养基转移到超速离心管中。

使用与所用试管相对应的转子，在大约 150， 000 倍 G 和 4 摄氏度下旋转培养基 3 小时。超速离心后，为避免沉淀质量损失，立即从肉眼可见也可能不可见的略棕色 OMV 沉淀中倒出 OMV 耗尽的培养基。超速离心后形成的 OMV 沉淀只能松散地粘附在离心囊泡上。

倾析时应小心，以确保颗粒不会脱落和丢失。保存上清液以备以后动态光散射，以验证 OMV 颗粒是否已从培养基中完全耗尽。向沉淀中加入 0.5 至 1 毫升无菌过滤 PBS、PH 7.4 或其他过滤缓冲液（根据实验需要或条件确定），并在室温下孵育 30 分钟。

然后小心地移液纯化的 OMV 溶液，轻轻混合，以确保整个沉淀已溶解。要确定 OMV 粒度分布，请打开所用仪器的 DLS 纳米粒子跟踪软件。打开显微镜并清洁显微镜和纳米粒子跟踪单元上的所有表面。

使用 1 毫升无菌注射器，通过下部接头将大约 0.5 毫升 OMV 样品直接添加到粒子跟踪装置的观察窗中，注意覆盖整个观察窗，不要向系统中注入任何气泡。将纳米粒子跟踪单元放在显微镜载物台上并打开激光器。然后点击 捕获 在软件中。

调整显微镜焦距和载物台，以在软件窗口的预览屏幕上可视化颗粒。调整相机快门和相机增益，直到明亮的粒子在黑暗的背景上清晰可见。将捕获持续时间调整为 60 秒，然后单击 Record 。

出现提示时，输入样品设备温度，标记样品，并在每次运行完成后将视频数据保存到用户指定的文件夹中。将所有分析参数保持在自动检测模式，然后单击 Process Sequence。将粒度分布和浓度记录为每毫升颗粒数，由软件确定。

为了测定 OMV 蛋白含量，使用 SDS-PAGE 和 Western Blots 评估 OMV 纯度酶的产生，并使用 SpyCatcher 或 SC 评估 SpyTag 或 ST 交联效率。必须确认靶酶和锚蛋白的表达。由于各种原因，重组蛋白的表达通常不成功，应在 OMV 表征之前确认成功的蛋白质生产。

要进行磷酸三酯酶或 PTE 活性测定，将 5 微升 1 比 1， 000 稀释的 CHES 缓冲液中的 paraoxon 稀释液添加到 90 微升 CHES 中的 5 微升纯化 OMV 中。每 20 秒采集 405 纳米和 348 纳米的吸光度读数，总反应时间约为两小时，以监测显色对氧杂子分解产物对硝基苯酚的进展。最后，根据文本协议进行数据分析。

此处显示的是通过 SEM 从大肠杆菌中纯化的 OMV 的形态示例。使用粒子跟踪仪器确定的 OMV 大小范围为 50 至 250 纳米。在此图中，显示了绝对 OMV 浓度。

当 N 末端 OMP-A-ST 在阿拉伯糖和 IPTG 存在下与 PTE-SC 共转化时，与对照样品相比，观察到 OMV 产生显着增加。此处看到的 SDS-PAGE 和蛋白质印迹进一步表征了 OMP-A-ST、天然 OMP-A、PTE-SC 和 OMP-A-ST-PTE-SC 的 OMV 蛋白含量和重组蛋白表达。在该图中，通过使用对氧克作为显色底物的初始速度测量来确定细胞沉淀、UC 上清液和纯化的 UC OMV 沉淀中的总体 PTE 表达水平和 OMV 包装效率。

在这里，Triton X-100 用于验证对氧磷跨完整 OMV 双层的易位。有或没有去污剂的活性差异很小，表明对氧磷自由穿过 OMV 上的内源孔。最后，从本实验中可以看出，PTE-SC 动力学数据拟合了在阿拉伯糖存在下与 PTE-SC 共转化的 N 末端 OMP-A-ST 和 IPTG 和 PTE-SC 在阿拉伯糖激活存在下的标准 Michaelis-Menten 酶动力学方程。

一旦所有基因构建体都制成并确认，酶包装和 OMV 纯化就可以在两天内完成。每当开发新的构建体时，都需要第三天来确认和表征 OMV。在尝试此程序时，请务必记住验证所有材料和离心设备的安全等级。

此外，在继续执行下一步之前，验证每个步骤是否成功也很重要。此处描述的表征步骤可以补充其他步骤，以确认酶包装和 OMV 形态。蛋白质浓度、脂质含量、LPS 浓度和许多其他特性会因不同的有效载荷和内收条件而异，并可能影响下游应用。

观看此视频后，您应该对如何纯化和表征充满酶的 OMV 以及进行初步分析以评估酶货物的活性有很好的了解。不要忘记，与细菌和化学试剂一起工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终使用预防措施，例如适当的无菌技术和个人防护设备。