定向蛋白质包装至外膜囊泡中 大肠杆菌设计、生产与纯化

本实验的总体目标是从细菌外膜囊泡（OMV）中纯化并表征含酶的囊泡，以将其用作体外催化试剂。该酶分离技术可从培养基中收获细菌OMV，并用于无细胞催化有机磷化合物的反应。与传统方法相比，细菌OMV内部的定向包装显著提高了酶在多种反应和储存条件下的稳定性；传统方法通常会导致酶活性逐渐且持续地丧失。

该技术的应用前景涵盖多种领域中具有重要意义的蛋白质包装，例如治疗剂的开发、环境修复或无细胞催化系统的构建。尽管本方案详细描述了从大肠杆菌（E.coli）中纯化外膜囊泡（OMVs）的方法，但若对包装策略稍作修改，该技术也可广泛适用于从多种微生物细胞培养物中纯化 OMVs。根据文本方案在细菌中生成外膜囊泡（OMVs）后，将完整的细菌培养基在 4°C 条件下以 7,000 × g 离心 15 分钟。

移除上清液并妥善保存，注意不要扰动细胞沉淀。然后将上清液进行第二次离心，以确保从培养基中彻底去除所有细菌。为去除保存的培养基中的蛋白质聚集体和大颗粒细胞物质，将溶液吸入无菌的10至50毫升注射器中。

将一个0.45微米的滤器连接到注射器的末端。然后推动活塞，将滤过液收集到一个新的离心管中。或者，将培养基转移至无菌过滤装置，通过真空过滤法进行过滤。

将装置连接至真空泵或抽吸装置以产生负压。将过滤后的培养基转移至新的容器中。为了分离外膜囊泡（OMVs），将过滤后的培养基转移至超速离心管中。

使用与所用离心管相匹配的转子，在约 150,000 ×g 及 4 °C 条件下将培养基离心 3 小时。超速离心后应立即进行操作，以避免沉淀物损失；将耗尽 OMV 的培养基从略呈棕色的 OMV 沉淀中倾倒除去，该沉淀可能肉眼可见，也可能不可见。超速离心后形成的 OMV 沉淀可能仅轻微附着于离心管壁。

倾倒时需小心操作，确保沉淀物不被扰动或丢失。将上清液保留，用于后续动态光散射分析，以确认培养基中的外膜囊泡（OMV）颗粒已完全去除。向沉淀物中加入0.5至1毫升无菌过滤的PBS（pH 7.4）或其他根据实验需求或条件确定的过滤缓冲液，在室温下孵育30分钟。

然后小心地用移液器吸取纯化的OMV溶液，轻轻混匀，以确保整个沉淀物完全溶解。为确定OMV的粒径分布，打开所用仪器的动态光散射（DLS）纳米颗粒追踪分析软件。开启显微镜，并清洁显微镜及纳米颗粒追踪装置的所有表面。

使用一个1毫升无菌注射器，通过下方接口将约0.5毫升OMV样品直接加入颗粒追踪仪的观察窗口，注意完全覆盖整个观察窗口，同时避免向系统中注入气泡。将纳米颗粒追踪装置放置在显微镜载物台上，打开激光器，然后在软件中点击“Capture”（采集）。

调节显微镜焦距和载物台，以在软件窗口的预览屏幕中观察到颗粒。调节相机快门和相机增益，直至在暗背景上清晰地看到明亮的颗粒。将捕获时长设置为60秒，然后点击“录制”。

当系统提示时，输入样品设备温度，标记样品，并在每次运行结束后将视频数据保存至用户指定的文件夹中。将所有分析参数保持在自动检测模式，然后点击“处理序列”。记录软件测定的粒径分布及浓度，单位为每毫升颗粒数。

为确定OMV的蛋白质含量，可采用SDS-PAGE和Western印迹法评估OMV的纯度、酶的产生情况以及SpyCatcher（SC）与SpyTag（ST）交联效率。必须确认目标酶和锚定蛋白的表达。重组蛋白的表达常因多种原因而失败，因此应在进行OMV表征之前确认蛋白表达是否成功。

为进行磷酸三酯酶（phosphotriesterase，PTE）活性检测，将5微升经CHES缓冲液1:1,000稀释的对氧磷（paraoxon）加入含有5微升纯化OMVs的90微升CHES缓冲液中。在总反应时间约两小时内，每隔20秒在405纳米和348纳米处测定吸光度，以监测显色性对氧磷降解产物对硝基苯酚（p-nitrophenol）的生成进程。最后，根据文本方案进行数据分析。

图中显示了通过扫描电镜观察到的大肠杆菌纯化外膜囊泡（OMV）形态的示例。根据颗粒追踪仪器的测定，OMV 的大小范围为 50 至 250 纳米。该图展示了 OMV 的绝对浓度。

当N端OMP-A-ST与PTE-SC在阿拉伯糖和IPTG存在下共转化时，与对照样品相比，观察到OMV产量显著增加。此处的SDS-PAGE和Western Blot进一步表征了OMV的蛋白质含量以及OMP-A-ST、天然OMP-A、PTE-SC和OMP-A-ST-PTE-SC的重组蛋白表达情况。在本图中，通过使用对氧磷作为显色底物测定初始反应速率，确定了菌体沉淀、超速离心上清液以及纯化的超速离心OMV沉淀中总体PTE表达水平和OMV包装效率。

此处使用Triton X-100验证对氧磷（paraoxon）在完整OMV双层膜中的转位。加入或不加去垢剂时酶活性差异很小，表明对氧磷可自由通过OMV上的内源性孔道。最后，如本实验所示，PTE-SC的动力学数据拟合为标准的米氏酶动力学方程，适用于N端OMP-A-ST与PTE-SC共转化并在阿拉伯糖和IPTG存在条件下、以及PTE-SC在阿拉伯糖激活条件下表达的情况。

在完成所有基因构建并确认无误后，酶的包装和OMV纯化可在两天内完成。每当开发新的构建体时，需要第三天来确认和表征OMV。在进行该实验操作时，务必注意核实所有材料和离心设备的安全等级。

此外，在进行下一步之前，验证每一步是否成功至关重要。此处描述的表征步骤可结合其他方法，以确认酶的包装情况和外膜囊泡（OMV）的形态。蛋白质浓度、脂质含量、脂多糖（LPS）浓度以及其他多种特性可能因不同的负载物和偶联条件而有所差异，并可能影响后续应用。

观看本视频后，您应能充分理解如何纯化和表征含有酶的外膜囊泡（OMVs），并开展初步检测以评估其酶活性。请注意，操作细菌和化学试剂可能具有极高危险性，在执行本实验时，务必采取适当的无菌技术并使用个人防护装备等安全措施。