Name: 高效液相色谱分析和触多巴胺摄取对小鼠多巴胺能稳态的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 学习利用高效液相色谱法和突触体多巴胺摄取技术评估小鼠多巴胺能稳态。这些方法可测量纹状体组织多巴胺含量及转运体功能，适用于化学遗传学操作或药物处理后的神经科学研究。

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本工作得到了哥本哈根大学2016年卓越计划（U.G.、A.R.、K.J.）、伦德贝克基金会（M.R.）、伦德贝克基金会纳米医学生物膜研究中心（U.G.）、美国国立卫生研究院基金P01 DA 12408（U.G.）以及丹麦独立研究理事会—医学科学（U.G.）的资助。

遵循丹麦动物实验监察局的指导方针（许可编号：2017-15-0201-01160），实验在本地动物福利委员会监督下，于完全通过AAALAC认证的设施中进行。
1. 突触体多巴胺摄取（方法1）
注意：本方案适用于两个脑组织的平行评估，但也可成功用于同时对四个脑组织进行突触体多巴胺（DA）摄取实验。
<ol>
	<li>准备工作
	<ol>
		<li>根据表1标记48个1.5 mL微量离心管（每个脑组织样本24个）。为每个脑组织样本使用不同颜色的离心管，以避免样本混淆</li>
		<li>标记51个闪烁瓶，编号#1–51。</li>
		<li>将磷酸盐缓冲液（PBS）置于冰上，用于保持脑组织低温。</li>
		<li>开启离心机，使其预冷至4 °C。</li>
		<li>预先称量两个微量离心管，以在突触体分离步骤（第2.6节）中获得精确的组织重量。</li>
		<li>通过混合4 mM HEPES和0.32 M蔗糖制备匀浆缓冲液。用NaOH调节pH至7.4，并置于冰上保存。 
		注：匀浆缓冲液可分装后于-20 °C保存，并在实验当天解冻使用。</li>
		<li>通过以下成分配制摄取缓冲液：25 mM HEPES、120 mM NaCl、5 mM KCl、1.2 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、1 mM抗坏血酸（0.194 g/L）、5 mM D-葡萄糖（0.991 g/L）。用NaOH调节pH至7.4（钠离子浓度约为130 mM），并置于冰上保存。 
		注：对于2个脑组织样本，需准备1500 mL摄取缓冲液。可将不含抗坏血酸和葡萄糖的成分配制成10倍浓缩液（10x stock solution），4 °C保存。实验当天新鲜稀释为1倍工作液（1x working solution），并补充抗坏血酸和葡萄糖。用NaOH调节pH至7.4。</li>
		<li>通过以下成分配制含配体的摄取缓冲液：25 mM HEPES、120 mM NaCl、5 mM KCl、1.2 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、1 mM抗坏血酸（0.194 g/L）、5 mM D-葡萄糖（0.991 g/L）、1 μM苯丙肼（pargyline）、100 nM去甲替林（desipramine）、10 nM儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT）抑制剂。用NaOH调节pH至7.4，并置于冰上保存。 
		注：取50 mL摄取缓冲液加入上述配体。苯丙肼用于抑制单胺氧化酶（MAO）介导的多巴胺（DA）氧化降解。COMT抑制剂（RO-41-0960）用于防止DA（泛指儿茶酚胺类）通过COMT途径降解。去甲替林用于抑制去甲肾上腺素和5-羟色胺转运体的摄取作用，从而使摄取结果特异性反映多巴胺转运体（DAT）活性。</li>
		<li>通过以下成分配制含配体和可卡因的摄取缓冲液：25 mM HEPES、120 mM NaCl、5 mM KCl、1.2 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、1 mM抗坏血酸（0.194 g/L）、5 mM D-葡萄糖（0.991 g/L）、1 μM苯丙肼、100 nM去甲替林、10 nM COMT抑制剂、500 μM可卡因。用NaOH调节pH至7.4，并置于冰上保存。 
		注：取7 mL含配体的摄取缓冲液加入可卡因。加入可卡因以测定非特异性DA摄取的背景值，用于从总摄取量中扣除，从而仅保留DAT特异性摄取（由于去甲替林已抑制SERT和NET）。也可使用高效特异性的DAT抑制剂GBR-12935替代可卡因。 
		重要提示：此后所有操作均需保持样本在冰上进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>突触体制备
	<ol>
		<li>逐只通过颈椎脱位法处死小鼠并断头。</li>
		<li>使用剪刀剪开皮肤暴露颅骨，并剪除断头后残留于颅骨后部的多余组织。用小直剪沿矢状缝（sutura sagittalis）剪开颅骨，尽可能向前剪至最前端。</li>
		<li>将剪刀尖分别插入小鼠双眼眶内，剪开颅骨以取出完整脑组织。迅速取出脑组织并放入冰冻PBS中，以保持低温，同时进行第二只小鼠的脑组织分离。</li>
		<li>使用脑组织切片模具，从纹状体区域切取3 mm厚的冠状切片（前后方向：+1.5 mm至-1.5 mm），随后使用打孔器进行精细解剖。打孔区域参见图1。</li>
		<li>此后所有操作中，组织样本必须始终置于冰上。</li>
		<li>将组织转移至1.5 mL微量离心管中称重。 
		注：此重量将在步骤1.2.14中使用。</li>
		<li>对第二个脑组织重复步骤1.2.1–1.2.6。</li>
		<li>两个脑组织称重完成后，将组织转移至含有1 mL冰冻匀浆缓冲液的玻璃匀浆器中。</li>
		<li>使用电动研磨杵以800 rpm转速匀浆，进行10次均匀的上下研磨。 
		注：一次研磨指一次上下运动，首次约持续5秒，后续每次约3–4秒。在等渗介质中匀浆至关重要，可防止突触体破裂6。适当力度结合等渗介质可使突触前末梢重新封闭，包裹胞质、突触小泡、线粒体及细胞骨架15。</li>
		<li>将匀浆液转移至1.5 mL微量离心管中，并用0.5 mL额外匀浆缓冲液冲洗匀浆器，收集残留匀浆液。</li>
		<li>在另一脑组织匀浆过程中，将样本置于冰上保存。两个脑组织样本需平行进行步骤1.2.12–1.2.13。</li>
		<li>通过离心（1,000 × g，10分钟，4°C）沉淀细胞核和细胞碎片。</li>
		<li>将上清液（S1，含细胞膜和胞质）转移至新的1.5 mL微量离心管中，于16,000 × g、4°C离心20分钟。</li>
		<li>弃去上清液（含胞质），将沉淀物（P2，含粗制突触体）用40 μL/mg组织的匀浆缓冲液重悬（基于步骤1.2.6测得的重量）。使用p1000移液器轻柔重悬粗制突触体组分，避免用力过大导致突触体破裂。 
		注：最终体积应至少达到280 μL。若不足，需以超过40 μL/mg的比例稀释。步骤1.2.1–1.2.13应尽快完成，所有操作均需保持在冰上。一旦粗制突触体在匀浆缓冲液中重悬，只要保持低温，其稳定性较好6,15,16。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 摄取实验
<ol>
	<li>向指定的12个1.5 mL微量离心管中加入440 μL摄取缓冲液 + 配体 + 可卡因，向其余36个1.5 mL微量离心管中加入440 μL摄取缓冲液 + 配体（参见表1中的布局）。 
	注意：在实验开始前15分钟将这些离心管从冰上取出，使其升至室温，但在使用前仍需保持在冰上以保护抑制剂的活性。</li>
	<li>制备饱和曲线（多巴胺（2,5,6-[3H]-DA）（3-H多巴胺）（91.1 Ci/mmol）在不同终浓度（0.031、0.0625、0.125、0.25、0.5和1.0 μM）下的测定）。
	<ol>
		<li>将六个2 mL微量离心管标记为10、5、2.5、1.25、0.62和0.31。</li>
		<li>向编号最小的5个微量离心管中各加入750 μL摄取缓冲液 + 配体。</li>
		<li>向标记为10的离心管中加入1,455.4 μL摄取缓冲液 + 配体、14.6 μL多巴胺（1 mM）和30 μL 3-H多巴胺（11 μM）。</li>
		<li>从标记为10的离心管中转移750 μL至标记为5的离心管中，充分混匀后，再从该管中转移750 μL至标记为2.5的离心管中。以此方式依次进行后续稀释。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将玻璃微纤维滤膜置于12孔滤板桶上后，用4 mL摄取缓冲液预冲洗滤膜。</li>
	<li>向含有440 μL缓冲液的前24个1.5 mL微量离心管中（参见表1中的布局）加入10 μL突触体膜悬液。轻轻涡旋混匀后短暂离心，确保突触体完全浸入缓冲液中。37 oC孵育10分钟。 
	注意：为保证不同脑组织样本之间的公平比较，摄取实验中的时间必须精确。建议使用秒表以确保准确性。</li>
	<li>向最前两列中加入50 μL浓度分别为10和5 μM的多巴胺（见第2.2节），37 oC振荡孵育5分钟。精确孵育5分钟后，加入1 mL冰浴预冷的摄取缓冲液终止反应。随后依次对浓度为2.5和1.25 μM（见第2.2节）以及0.62和0.31 μM的多巴胺重复上述操作。</li>
	<li>将样品加入已预冲洗的微纤维滤膜上，并用5 × 4 mL冰浴预冷的摄取缓冲液进行洗涤。当前12个样品完成过滤后，将滤膜转移至闪烁管中。随后对下一组12个样品重复该步骤。</li>
	<li>对下一个脑组织样本重复步骤2.4–2.6。</li>
	<li>准备3个最大计数管：将微纤维滤膜置于闪烁管49–51的底部，并在其上方加入25 µL最高浓度的多巴胺（10 μM）。</li>
	<li>将全部51个闪烁管置于通风橱中静置1小时。</li>
	<li>向每个闪烁管中加入3 mL闪烁液，并在摇床上剧烈振荡1小时。</li>
	<li>使用β计数器对[3H]-DA进行1分钟计数。
	<ol>
		<li>打开仪器程序并设置：同位素标记：H-3，样品容器/滤膜类型：4 mL瓶，4×6格式，检测类型：常规，计数时间：1分钟。 
		注意：若时间方便，此步骤可于次日进行。样品过夜时需用锡箔纸覆盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白浓度测定
	<ol>
		<li>使用标准BCA蛋白检测试剂盒测定突触体的蛋白浓度，用于将每分钟计数（cpm）校正为fmol/min/μg，并实现样本间摄取量的准确比较。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据分析
<ol>
	<li>利用摄取实验的数据为每组绘制饱和曲线，并计算反应速率（Vmax）和米氏常数（KM）。 
	注意：KM值反映了达到Vmax一半时所需的底物浓度。因此，Vmax直接反映了多巴胺转运体（DAT）的功能（即最大摄取能力），该能力取决于细胞膜表面DAT的数量，以及翻译后修饰和/或相互作用蛋白对其活性的调节，同时也受离子梯度变化的影响。KM值是底物与转运体亲和力的间接衡量指标，同样可受到翻译后修饰和/或相互作用蛋白的调节。因此，为全面评估功能变化，有必要通过例如细胞表面生物素化实验等方法直接测定表面表达水平。Schmitz等人已对多巴胺再摄取过程以及KM和Vmax值的意义进行了综述17。</li>
</ol>
4. 高效液相色谱法（方法2）
<ol>
	<li>脑组织解剖
	<ol>
		<li>标记并称量微型离心管；每只小鼠每个脑区各一管。</li>
		<li>逐只通过颈椎脱位和断头处死小鼠，迅速按1.2节所述方法取出脑组织，并立即进行后续解剖操作。</li>
		<li>使用脑切片模具，切取纹状体的3 mm冠状切片，随后使用打孔器对伏隔核（NAc）和背侧纹状体（dStr）进行更精细的双侧解剖。打孔区域参见 图3。</li>
		<li>将组织转移至1.5 mL微型离心管中，迅速置于干冰上。称量组织重量后立即放回干冰中。 
		注意：组织重量对后续浓度计算至关重要。</li>
		<li>对下一只小鼠重复步骤4.1.1–4.1.4。 
		注意：将组织置于–80oC保存直至进一步处理，或立即进行组织处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 组织制备
<ol>
	<li>开启离心机，使其预冷至指定温度 4 °C</li>
	<li>制备匀浆溶液（0.1 N 高氯酸（HClO₄）、0.05% 三氯三氟乙烷（TCA）、0.1% 乙二胺四乙酸（EDTA））4）并置于冰上保存。</li>
	<li>使用匀浆液，配制新鲜的 0.1 pmol/μLμL 从1 mM的储备液中稀释多巴胺标准品（10,000倍稀释）。 
	注意：通过将多巴胺溶解于匀浆缓冲液中，配制成1 mM的储存液，可保存于 20 °C 约一个月。如果关注其他脑区，则需要调整标准品的浓度，因为包括前额叶皮层、海马、黑质和腹侧被盖区在内的其他脑区，其多巴胺（DA）含量较纹状体可低至100倍。</li>
	<li>添加 500 μL 每份样品中加入匀浆液即 NAc 和 dStr 组织；第 4.1 节），使用超声波匀浆器以全速匀浆约 30 秒。匀浆过程中将样本置于冰水中。每处理一个样本后，用清水清洗超声波匀浆器（全速运行 30 秒）。</li>
	<li>将样品以30 min离心 4 °C，14,000 × g。</li>
	<li>转移约 200 μL 样本转移至玻璃器皿 0.22 μm 使用1 mL塑料注射器过滤（直径1 cm）。 
	注意：只要所选滤光片满足要求，玻璃滤光片的使用并不重要 0.22 μm 以去除高分子量物质。</li>
	<li>采用电化学检测法（EC）-高效液相色谱法分析样品18 如第6节所述</li>
</ol>
6. 高效液相色谱分析
<ol>
	<li>配制以下流动相溶液：55 mM 醋酸钠，1 mM 辛烷磺酸钠，Na2EDTA 0.1 mM，乙腈 8%，乙酸 0.1 M，pH = 3.2 
	注意：使用 0.1 M 乙酸调节 pH。pH 值必须精确。溶液应通过在线脱气机（HPLC 系统的集成部件）进行脱气。配制 2 L 流动相，约每月更换一次（当噪声明显增加时即应更换）。更换流动相后，由于存在波动，约需 24 小时方可达到稳定状态。</li>
	<li>检测器的设置：
	<ol>
		<li>将电压输出设为 700 mV，温度设为 32 °C 在检测器烘箱上；这一点非常重要。使用在线手册创建一个范围程序。（详见手册）。根据要求添加时间程序 表2. 
		注意：本研究中，程序设定为在特定保留时间自动调节电流，以使高效液相色谱（HPLC）保持在最佳电流水平，并尽可能放大色谱图峰形，同时确保峰形仍在可视范围内。该参数已针对小鼠纹状体脑组织裂解液进行优化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当程序已添加至检测器后，通过三次注入标准品（5、10 和 15 μL). 
	注意：标准（10 μL (10 μL x 0.1 pmol/μL 每十个样品应注入一次标准品（= 1 pmol DA），并根据最近的标准品对样品进行校准。在实验前一天通过调整三点标准曲线对系统进行微调，并检查色谱图是否在预期范围内。若观察到显著噪声，则更换流动相。若峰高超过 990 mV，应减小进样体积重新进样，或建立新的梯度程序和新的标准曲线。检测限定义为各标准品（NA、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、3-MT 和 5-HT）所注入的最低峰信号值相对于噪声（mV）的 3 倍。
	<ol>
		<li>通过打开LC溶液并启动分析1来设置系统；此操作将开始在线模式。输入用户ID和密码，然后单击确定。等待LC溶液连接至仪器。进入批处理表并填写数据信息（例如，样本类型：样本为 unknown，标准品为 std，分析类型：IT QT，进样体积：10，内标量：Level 1 con）。保存文件（转到 文件 -&gt; 将批处理文件另存为 -&gt; 保存。</li>
		<li>通过按“Start Batch”使系统注入第一个样品。这将导致样品的注入 10 μL 使用自动进样器与溶剂输送模块对样品进行进样。 
		注意：使用泵流速为0.15 mL/min，并采用C18反相色谱柱。此处使用安培检测器进行电化学检测。玻碳电极应设置为0.8 V，参比电极为Ag/AgCl。为测定多巴胺，采用色谱法 3 µ ODS (3) C18（DA 2 mm × 100 mm，粒径 3 µm) 以实现色谱分离。</li>
		<li>提取记录和计算的峰面积。
		<ol>
			<li>样品运行结束后，进入数据采集以查看色谱图，然后进入液相色谱后运行分析。&gt; 选择文件名（色谱图将会打开）-&gt; 点击“查看”。在手动积分栏中，添加所有需要积分的峰 -&gt; 前往数据报告并打印读数。 
			注意：此处使用 LC 溶液软件进行数据分析和系统控制。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据标准品的已知浓度，利用峰面积计算样品中多巴胺的浓度，计算方法如下：
	<ol>
		<li>使用标准品的峰面积（等于 1 pmol）来获得因子 A。 
		<img alt="因子A公式：1 pmol/标准品峰面积，用于定量分析的方程。" src="/files/ftp_upload/56093/56093eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"></li>
		<li>使用因子A计算样品的浓度。 
		样品浓度（以 pmol 为单位） 10 μL) = 因子A × 样品的峰面积</li>
		<li>使用此公式计算样品浓度，单位为 ng。 
		样品浓度 pmol / 10 µL x 500 µL x MW 多巴胺 = 样品浓度（ng） 
		样品浓度（单位：ng）= 样品浓度（单位：pmol/μL）× 样品体积（单位：μL）× 分子量（单位：g/mol）÷ 1000 10 μLx 500 μL x MW 多巴胺</li>
		<li>使用样品浓度（ng）计算样品浓度（pg/g 组织）（样品浓度 pg / 组织 g = pg/g 组织）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了可用于阐明任意小鼠模型中多巴胺稳态的实用实验方案。我们提供了使用高效液相色谱法（HPLC）测定小鼠脑组织中多巴胺水平以及通过突触体多巴胺摄取实验评估多巴胺转运体（DAT）功能活性的详细操作步骤。下文将详细阐述HPLC实验和突触体多巴胺摄取测定的相关操作、方案及其局限性。
突触体摄取实验方案可为多巴胺转运蛋白（DAT）的功能提供有价值的见解。结合细胞表面生物素化实验13，可获得关于DAT的总量、表面表达水平及其功能性的信息。鉴于DAT在多巴胺传递中的关键作用及其在多种疾病中的参与，建立能够模拟DAT功能的检测方法已成为重要目标。突触体多巴胺摄取实验的一个优势在于，该实验可在死后 体内 化学遗传学操作以及其他不同操作 体内 药物处理或行为训练，以及对基因修饰小鼠的研究。药物处理可在突触体分离制备后进行，而非 体内 如有需要，可直接检测药物对DAT的作用效果22.
除了进行突...

多巴胺（DA）是一种调节性神经递质，在运动行为、奖赏机制和认知功能中起关键作用1,7,8,9。DA稳态失衡与多种神经精神疾病相关，例如注意缺陷多动障碍、药物成瘾、抑郁症和帕金森病1。DA由突触前神经元释放至突触间隙，在此结合并激活突触前膜和突触后膜上的受体，从而进一步传递信号。释放后突触中DA的水平由DAT在空间和时间上进行调控3,10。该转运体可将DA从细胞外空间摄取回收，从而维持生理浓度的DA水平3,11。在小鼠中基因敲除DAT会导致一种高多巴胺能表型，其特征为突触DA水平升高、细胞内DA储存池耗竭以及突触后多巴胺能信号传导的显著改变10,12。
本文介绍了两种独立的实验方案，一种用于测定多巴胺（DA）组织含量，另一种用于评估多巴胺转运体（DAT）的功能活性。结合Gabriel等人所描述的细胞表面生物素化检测方法13，这三种方法可全面评估DA含量及DAT功能水平，从而对多巴胺稳态进行系统分析。利用这些方法，可对多种转基因小鼠或疾病模型中的多巴胺稳态特征进行表征和描述。这些技术已在本实验室常规应用，并经过实施与优化。目前，这些检测方法已成功用于研究改变DAT羧基末端结构14，或在酪氨酸羟化酶（TH）启动子驱动下表达Cre重组酶5对多巴胺稳态所产生的影响。

<table><tbody><tr><td>COMT抑制剂</td><td>Sigma Aldrich，德国</td><td>RO-41-0960</td><td>用于突触体多巴胺摄取实验的方案</td></tr><tr><td>[3H]-多巴胺</td><td>美国马萨诸塞州波士顿，珀金埃尔默生命科学公司</td><td>NET67-3001MC</td><td>用于突触体多巴胺摄取实验的方案</td></tr><tr><td>玻璃微纤维滤膜</td><td>GF/C 玻璃纤维滤膜，Whatman，GE Healthcare Life Sciences，白金汉郡</td><td>1822-024</td><td>用于突触体多巴胺摄取实验的方案</td></tr><tr><td>HiSafe 闪烁液</td><td>Perkin Elmer</td><td>1200-437</td><td>用于突触体多巴胺摄取实验的方案</td></tr><tr><td>MicroBeta2</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>用于突触体多巴胺摄取实验的方案</td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技 Pierce</td><td>23225</td><td>用于突触体多巴胺摄取实验的方案</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma生命科学</td><td>H3375</td><td>用于突触体多巴胺摄取实验的方案</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma生命科学</td><td>S7903</td><td>用于突触体多巴胺摄取实验的方案</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma生命科学</td><td>S3014</td><td>用于突触体多巴胺摄取实验的方案</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma生命科学</td><td>P9541</td><td>用于突触体多巴胺摄取实验的方案</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>默克股份公司</td><td>10043-52-4</td><td>用于突触体多巴胺摄取实验的方案</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma生命科学</td><td>63065</td><td>用于突触体多巴胺摄取实验的方案</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma生命科学</td><td>A0278</td><td>用于突触体多巴胺摄取实验的方案</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma生命科学</td><td>G7021</td><td>用于突触体多巴胺摄取实验的方案</td></tr><tr><td>Pargyline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-8013</td><td>用于突触体多巴胺摄取实验的方案</td></tr><tr><td>地昔帕明</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D3900</td><td>用于突触体多巴胺摄取实验的方案</td></tr><tr><td>多巴胺</td><td>Sigma生命科学</td><td>H8502</td><td>用于突触体多巴胺摄取实验的方案</td></tr><tr><td>可卡因</td><td>Sigma生命科学</td><td>C5776</td><td>用于突触体多巴胺摄取实验的方案</td></tr><tr><td>脑基质</td><td>ASI 仪器</td><td>RBM2000C</td><td>用于突触体多巴胺摄取实验的方案</td></tr><tr><td>Cafano 机械聚四氟乙烯匀浆器</td><td>布赫 &amp;和 Holm</td><td>已停止</td><td>用于突触体多巴胺摄取实验的匀浆步骤</td></tr><tr><td>Antec Decade（安培检测器）</td><td>Antec，荷兰莱顿</td><td>已停用：新型号 DECADE Elite / Lite&amp;trade; 电化学检测器型号 175 和 176</td><td>高效液相色谱法实验方案</td></tr><tr><td>Avantec 0.22 &amp;mu;m 玻璃滤膜</td><td>Frisenette ApS，丹麦</td><td>13CP020AS</td><td>高效液相色谱法实验方案</td></tr><tr><td>色谱柱：Prodigy 3 &amp;mu; ODS-3 C18</td><td>Phenomenex，YMC Europe，Chermbeck，德国</td><td>部件编号：00A-3300-E0</td><td>高效液相色谱法实验方案</td></tr><tr><td>LC 溶液软件</td><td>岛津</td><td>LabSolutions 系列工作站</td><td>用于高效液相色谱（HPLC）方案</td></tr><tr><td>高氯酸 0.1 M</td><td>Fluka 分析</td><td>35418-500ml</td><td>高效液相色谱方案（组织制备）</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134-50g</td><td>用于高效液相色谱（HPLC）方案</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Bie&amp;amp;Berntsen</td><td>1.06346 1000g</td><td>高效液相色谱法实验方案</td></tr><tr><td>辛烷磺酸钠一水合物</td><td>Aldrich</td><td>74885 -10g</td><td>高效液相色谱实验方案</td></tr><tr><td>乙腈，等度高效液相色谱级</td><td>Scharlau</td><td>AC03402500</td><td>高效液相色谱法实验方案</td></tr><tr><td>0.22 μm 滤器</td><td>Frisenette ApS，丹麦</td><td>Avantec 13CP020AS</td><td>高效液相色谱方案（组织制备）</td></tr><tr><td>85% 正磷酸</td><td>默克</td><td>1.00563. 1000毫升</td><td>用于高效液相色谱（HPLC）方案</td></tr><tr><td>电极</td><td>Antec，荷兰莱顿</td><td>AN1161300</td><td>高效液相色谱法实验方案（参见在线手册）</td></tr><tr><td>DECADE II 电化学检测器上的检测器程序</td><td>Antec，荷兰莱顿</td><td>轻量版&amp;trade; 电化学检测器型号 175 和 176</td><td>高效液相色谱法实验方案</td></tr></tbody></table>

利用高效液相色谱分析和突触体多巴胺摄取评估小鼠多巴胺能稳态

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

多巴胺（DA）是一种调节性神经递质，控制运动活动、奖赏过程和认知功能。多巴胺能（DAergic）神经传递功能受损与多种中枢神经系统相关疾病密切相关，例如帕金森病、注意缺陷多动障碍和药物成瘾1,2,3,4。阐明涉及多巴胺失衡的疾病机制在很大程度上依赖于动物模型来模拟疾病的某些方面，因此评估多巴胺稳态特定环节的实验方案对于揭示这些疾病的新型机制和潜在治疗靶点具有重要意义。
本文介绍了两种实用的实验方案，结合使用可实现对小鼠多巴胺能系统功能的检测。通过检测多巴胺（DA）水平和多巴胺转运体（DAT）功能，可以获得关于DA稳态的生化和功能参数5。在研究DA系统时，能够可靠地测定成年动物脑内源性DA水平至关重要。因此，本文展示了如何对小鼠脑组织进行高效液相色谱（HPLC）分析以测定DA含量。实验以背侧纹状体（dStr）和伏隔核（NAc）组织为例进行，但该方法同样适用于其他多巴胺能神经支配的脑区。
多巴胺转运体（DAT）对于多巴胺（DA）重摄取至突触前末梢至关重要，从而调控释放的DA在时间和空间上的活性。在评估多巴胺稳态时，了解纹状体中DAT的表达水平及其功能状态具有重要意义。本文提供了一种实验方案，可通过突触体6多巴胺摄取实验，同时获取关于DAT表面表达水平及其功能的信息。
现有方法结合标准免疫印迹实验方案，为研究人员提供了表征多巴胺能系统的重要工具。

当前的多巴胺（DA）摄取实验方案（图1）包含评估小鼠突触体中多巴胺转运体（DAT）功能所需的所有步骤。本研究中代表性DA摄取实验结果（图2）展示了野生型小鼠的饱和曲线，包括未经蛋白量调整的数据（图2B）和经蛋白量调整后的数据（图2A）。通常，实验会将野生型小鼠与突变型小鼠进行比较，从而获得每种基因型的饱和曲线5。在此情况下，图2A和2B中野生型与突变型小鼠之间的差异可能由多种因素导致。实验人员若能更严格地遵循方案中的每一步操作，则原始数据（2B）与蛋白量调整后数据（2A）之间的差异将越小。造成差异的最明显原因包括：i）步骤1.2.6中组织称重不准确；ii）在步骤1.2.8至1.2.10中，将组织转移至匀浆玻璃器或从中取出时发生组织损失；iii）步骤1.2.13中上清液转移不精确，以及步骤1...

突触体多巴胺摄取与高效液相色谱分析是研究小鼠多巴胺稳态的实验工具，分别用于评估多巴胺转运体功能和纹状体组织中多巴胺水平。本文中，我们提供了测定多巴胺组织含量及评估多巴胺转运体功能的实验方案。

多巴胺（DA）是一种调节性神经递质，调控运动活动、奖赏过程和认知功能。多巴胺能（DAergic）系统的功能障碍……

本实验方案中介绍了两种技术。第一种技术旨在通过测量突触体样本中多巴胺的摄取来评估多巴胺转运体功能；第二种技术则通过高效液相色谱分析来测定组织中多巴胺的含量。这些方法通过展示如何测量小鼠脑组织中多巴胺含量以及评估多巴胺转运体功能，提供了多巴胺稳态的重要参数。这些技术的主要优势在于，可在体内操作（如化学遗传学干预、体内药物处理或动物行为训练）之后进行检测。高效液相色谱（HPLC）操作的示范将由神经精神病学实验室副教授 Pia Weikop 进行。开始此操作时，通过切开皮肤并去除多余组织以暴露颅骨。接着，沿矢状缝向前完全切开颅骨。将剪刀尖插入眼眶，剪除剩余的颅骨组织。迅速取出脑组织并置于冰上预冷的PBS中。随后使用脑组织切片模具，切取纹状体部位厚约三毫米的冠状切片，再通过穿孔进行更精细的解剖。随后，将组织转移至1.5毫升微量离心管中称重。然后，对第二个脑组织重复上述操作。待两个脑组织均称重后，将组织转移至含有1毫升冰上预冷的匀浆缓冲液的匀浆玻璃管中。接着，使用电动研杵匀浆组织。然后，将匀浆液转移至1.5毫升微量离心管中，并用0.5毫升额外的匀浆缓冲液冲洗匀浆玻璃器皿，收集残留的匀浆液。随后，通过离心沉淀细胞核和细胞碎片。然后，将含有细胞膜和细胞质的上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中，在4摄氏度下离心20分钟。随后，弃去含有细胞质的上清液，用匀浆缓冲液将含有粗制突触体的沉淀重新悬浮，每毫克组织加入40微升。在此步骤中，向指定的12个1.5毫升微量离心管中各加入440微升摄取缓冲液、配体和可卡因，向其余36个1.5毫升微量离心管中各加入440微升摄取缓冲液和配体。将六个 2 毫升微量离心管标记为 10、5、2.5、1.25、0.62 和 0.31。然后，向编号最小的五个微量离心管中各加入 750 微升摄取缓冲液和配体。接下来，向标为 10 的离心管中加入 1,455.4 微升摄取缓冲液和配体、14.6 微升未标记的多巴胺以及 30 微升氚标记的多巴胺。接下来，将标记为10的试管中的750微升混合液转移至标记为5的试管中。充分混匀后，从此试管中取750微升混合液转移至标记为2.5的试管中。按此稀释方法依次处理剩余各试管。随后，将玻璃微纤维滤膜置于12孔滤板上，用4毫升摄取缓冲液预润洗。接着，向首批24个含有440微升缓冲液的1.5毫升微量离心管中，各加入10微升突触体膜悬液。轻轻涡旋混匀，短暂离心，以确保突触体完全浸入缓冲液中。然后，在37摄氏度下孵育10分钟。10分钟后，向最前两列分别加入50微升浓度为10微摩尔和5微摩尔的多巴胺，并在37摄氏度下振荡孵育5分钟。5分钟后，加入1毫升冰上预冷的摄取缓冲液以终止反应，随后依次对2.5微摩尔和1.25微摩尔、以及0.62微摩尔和0.31微摩尔的浓度组重复上述操作。将样品加入预先冲洗过的微纤维滤膜，并用五次、每次四毫升的冰上预冷摄取缓冲液进行洗涤。前12个样品加入滤膜后，将滤膜转移至闪烁瓶中。随后对接下来的12个样品重复此步骤。通过将微纤维滤膜置于闪烁管底部，编号为49至51，并在滤膜上加入25 µL浓度为10 µmol/L的最大多巴胺溶液，制备三个最大计数管。随后，将全部51个闪烁游戏副本置于通风橱中静置1小时。然后，向每个闪烁管中加入3 mL闪烁液，并在摇床上剧烈振荡1小时。使用β计数器对氚标记的多巴胺计数一分钟，打开程序并选择合适的设置。进行蛋白质测定时，采用标准BCA蛋白检测试剂盒，测定突触体的蛋白浓度，以便进行校正及样品间摄取量的正确比较。进行组织制备时，向每个样品中加入500 µL匀浆液，并使用超声匀浆器在全速下将所有样品匀浆约30秒。匀浆过程中将样品置于冰水中。随后，在 4 °C 条件下以 14,000 × g 离心 30 分钟。之后，在采用 EC-HPLC 方法分析样品前，将每份样品约 200 µL 转移至玻璃制 0.22 µm 滤膜。设置检测器时，将检测器炉温设为 32 °C，并将输出设定为 700 mV。将小瓶放入自动进样器中。根据在线手册创建一个范围程序，并按照表二添加时间程序。通过打开程序来设置系统。接下来，输入用户 ID 和密码，然后单击确定。随后，等待程序连接至仪器。然后，进入批处理表并填写数据信息。依次点击文件、保存批处理文件，然后点击保存，以保存文件。随后，按下开始批处理以注入第一个样品。之后，当样品运行结束后，进入数据采集界面以查看色谱图。然后，进入液相色谱运行后分析，选择文件名，点击“查看”。在手动积分栏中，添加所有需要积分的峰，然后进入数据报告并打印读数。将程序添加至检测器后，通过注入5、10和15微升的制备标准品进行三点校准曲线。本图中，代表性数据展示了通过野生型小鼠突触体制剂中多巴胺转运体摄取多巴胺的饱和曲线。黑色圆点分别为四只小鼠的数值，单独显示。绿色曲线展示了通常如何通过合并每组四到六只小鼠的数据来呈现结果。此图为在根据样品的实际蛋白浓度进行校正之前的原始数据饱和曲线。该图显示了含可卡因样品的计数，这些计数用于从摄取数据中扣除背景信号。该对照实验对于确定摄取数据的可靠性至关重要。此直方图展示了多巴胺转运体的摄取能力，结果显示多巴胺转运体的Km值为0.1 ± 0.03 微摩尔，与旋转圆盘伏安法所测得的多巴胺转运体Km值（0.6 至 1.2 微摩尔）相符。在进行突触体光学实验操作时，制备突触体过程中必须始终将组织置于冰上。在完成多巴胺摄取测定的突触体实验后，可进一步进行表面生物素化测定等附加实验，以确定多巴胺摄取功能的改变是否可归因于多巴胺转运体表面表达水平的变化。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过检测纹状体组织样本中多巴胺转运体的功能及多巴胺水平，来研究小鼠体内多巴胺稳态的机制。

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高效液相色谱分析和触多巴胺摄取对小鼠多巴胺能稳态的评价

本文描述了一种在小鼠中进行单侧内侧前脑束6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁的实验方案。该方法死亡率较低（13.3%），存活小鼠中有89%表现出纹状体多巴胺含量减少&gt;95%，且对侧旋转偏差达90.63±4.02%，偏向损毁侧。...

帕金森病单侧损毁6-OHDA小鼠模型的建立

安培法通过检测多巴胺自发氧化产生的氧化电流，来测量单个细胞释放的多巴胺。同时采用电压钳制与安培法技术，可揭示多巴胺转运体的整体“活性”与其对多巴胺逆向转运调控作用之间的机制关系。...

同时进行电压钳制与安培法的单细胞多巴胺释放测量

多巴胺在中脑核团中受到独特调控，这些核团含有多巴胺神经元的胞体和树突。本文介绍一种解剖与样本处理方法，旨在最大化对啮齿类动物黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）中脑核团内多巴胺调控研究的结果质量，从而提升结论的可靠性与科学洞察力。...

黑质与腹侧被盖区多巴胺调节的全面分析

本视频演示了从小鼠脑组织中分离的突触体中评估多巴胺摄取的方法。该方法包括通过多巴胺转运体准备用于多巴胺摄取的突触体，用不同浓度的放射性标记多巴胺处理突触体，分离突触体，并通过测量放射性来定量多巴胺的摄取量。...

使用放射性标记多巴胺测量小鼠脑突触体中的多巴胺摄取

在帕金森病及一般的运动障碍疾病中，敏感且可靠的动物行为学检测方法对于评估新型潜在治疗手段至关重要。本文介绍了一套适用于小鼠的可操作性感觉运动功能测试组合，该测试组合对黑质纹状体系统的不同程度损伤具有不同程度的敏感性，可用于临床前研究。...

帕金森病小鼠模型中感觉运动功能的评估

本文介绍了两种已建立的实验方法，用于研究黑腹果蝇（Drosophila）中多巴胺能（DA）神经元随年龄增长而发生的神经退行性变化：攀爬/惊吓诱导的负向趋地性实验，可用于研究DA神经元功能退化的效应；以及酪氨酸羟化酶免疫染色，用于在全脑制片中识别并计数DA神经元。...

评估神经退行性表型 黑腹果蝇 通过攀爬实验和全脑免疫染色检测多巴胺能神经元

脂氧合酶（LOX）同工酶可生成可能增强或减弱神经炎症与神经变性的产物。 通过基因-环境相互作用研究，可识别特定LOX同工酶的作用。利用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的黑质纹状体损伤模型，在两种LOX同工酶缺陷的转基因小鼠品系中，可比较LOX同工酶对多巴胺能完整性和炎症反应的贡献。...

基因-环境相互作用模型揭示帕金森病易感机制

本文详细介绍了利用碳纤维电极和酶法生物传感器技术进行固定电位安培记录，以在雌性仓鼠自然奖赏行为期间高时间分辨率地测量多巴胺和谷氨酸的释放。...

测量雌性叙利亚仓鼠在自然奖赏行为期间细胞外神经递质的体内变化

我们提出了一种便捷的固相萃取联合高效液相色谱（HPLC）电化学检测（ECD）方法，用于同时测定婴儿尿液中三种单胺类神经递质及其两种代谢物。我们还鉴定出代谢物MHPG可作为婴儿脑损伤早期诊断的潜在生物标志物。...

一种便捷的儿茶酚胺类神经递质及其代谢物的提取与高效液相色谱分析方法

在伏隔核中鉴定多巴胺 D1-α 受体对于阐明中枢神经系统疾病期间 D1 受体功能障碍至关重要。我们采用了一种新型的 RNA 原位 杂交检测方法，以可视化特定脑区中的单个 RNA...

通过一种创新的RNA 原位检测技术鉴定啮齿类动物伏隔核中的多巴胺D1-α受体

本方法介绍了一种利用急性脑切片检测内源性单胺类物质释放的简单技术。该实验装置采用一个48孔板，其中包含用于单胺释放的组织固定装置。释放的单胺类物质通过高效液相色谱法（HPLC）结合电化学检测进行分析。此外，该技术还可作为药物发现的筛选方法。...

一种基于孔板的急性脑切片内源性单胺释放量检测方法

学习利用高效液相色谱法和突触体多巴胺摄取技术评估小鼠多巴胺能稳态。这些方法可测量纹状体组织多巴胺含量及转运体功能，适用于化学遗传学操作或药物处理后的神经科学研究。

利用高效液相色谱分析和突触体多巴胺摄取评估小鼠多巴胺能稳态

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