使用 A-seq2 进行 3' 端测序文库构建

该方法的总体目标是捕获并测序 mRNA 的 3' 末端，从而能够研究 mRNA 的加工过程，特别是 3' 末端的切割和多聚腺苷酸化，以及实现基因表达的定量分析。本文所介绍的 A-seq2 实验方案及配套的数据分析软件包，有助于解答关于不同细胞类型和组织中转录本异构体生成与功能的关键问题。A-seq2 方法的主要优势在于，它避免了对长段多聚(A)序列的测序，并且不会产生接头二聚体。

细胞生长至80%融合度时可用于本实验。移除培养基，用PBS洗涤细胞一次。每孔加入1毫升裂解缓冲液，直接在培养板上裂解细胞，并用橡胶刮刀将细胞材料从培养板表面完全刮下。

使用1 mL移液枪头将每个孔中的黏稠裂解液转移至15 mL塑料管中。用连接23号皮下注射针头的1 mL注射器反复剧烈抽吸数次，直至裂解液不再黏稠。

将裂解液转移至1.5毫升离心管中。在4 °C条件下以20,000 × g离心5分钟，以去除碎片。收集裂解液中的澄清上清液。

加入寡核苷酸 d(T)25 磁珠并重悬混合物。将离心管置于旋转仪上孵育 10 分钟。随后将离心管置于磁力架上 2 分钟。

弃去上清液。向每根试管中加入 0.8 毫升缓冲液 A，并将试管颠倒 180 度 2 至 3 次。从第二次洗涤中移除缓冲液 A。

向每根试管中加入 0.8 毫升缓冲液 B，并在试管架上静置 2 分钟。为洗脱结合在磁珠上的 mRNA，去除缓冲液 B，向每根试管中加入 33 微升水，并重悬磁珠。在预热的金属块中 75 摄氏度加热 5 分钟。

立即短暂离心管子1秒，然后将其置于磁力架上。将上清液转移至新管中。向每管中加入66微升碱性裂解缓冲液，混匀后在加热块上95摄氏度精确加热5分钟。

立即在冰上冷却离心管。随后按照文本方案所述，使用RNA纯化试剂盒进行RNA提取。开始该步骤时，向每个RNA样品中加入14微升多核苷酸激酶主混合液。

37 摄氏度孵育 30 分钟。30 分钟后，将激酶反应液加载至预先准备好的离心柱中。以 735 × g 离心 2 分钟。

弃去柱子，将收集到反应产物的离心管置于冰上。为阻断RNA片段的3'端，防止其在后续连接反应中发生串联，向每个样品中加入17.5 µL的多聚(A)聚合酶主混合液。混匀后瞬时离心1秒。

37摄氏度孵育30分钟。30分钟后，向每个反应体系中加入32.5微升水，并按照文本方案所述纯化RNA。开始该操作时，先将反应物置于真空浓缩仪中10分钟，使体积减少至6微升。

然后向每个反应体系中加入24 µL的RNA连接酶主混合液。将反应体系置于加热振荡仪中，在24 °C条件下孵育16小时，期间以1000 RPM间歇振荡。次日，向每个反应体系中加入17 µL水并混匀。

按照文本方案所述纯化RNA。将洗脱液置于真空浓缩仪中浓缩三分钟，使体积减少至11微升。将反应体系转移至200微升PCR管中，用于逆转录反应。

加入1 μL引物。在PCR仪中70°C加热5分钟，然后室温放置5分钟。向每管中加入8 μL逆转录主混合液，并混匀。

将试管放入PCR仪中。先在55摄氏度加热10分钟，再在80摄氏度加热10分钟。随后置于冰上保存。

按照文本方案中的描述制备链霉亲和素磁珠。将反转录反应产物加入磁珠溶液中，置于4°C旋转仪上孵育20分钟。使用磁力架，用生物素结合缓冲液洗涤磁珠两次，再用TEN缓冲液洗涤两次。

将磁珠重悬于 50 微升 TEN 缓冲液中。加入 2 微升尿嘧啶 DNA 糖基化酶酶混合液，在 37 摄氏度下于混匀仪中孵育 1 小时，期间间断混匀。向每个反应体系中加入 50 微升水、11 微升 RNase H 缓冲液和 1 微升 RNase H。

37 摄氏度孵育 20 分钟。将离心管置于磁力架上，转移含有切割后 cDNA 的液体至新离心管中。按照文本方案中的描述，使用 PCR 纯化试剂盒纯化切割后的 cDNA。

将纯化的 cDNA 置于真空浓缩仪中浓缩八分钟，浓缩至七微升体积。为将5'接头连接至分离得到的 cDNA 的5'末端，向每个样品中加入23微升RNA连接酶预混液，并在24摄氏度孵育20小时。最后，向每个反应体系中加入70微升水。

进行初步PCR以确定在指数扩增阶段达到文库扩增的最佳PCR循环数。将以下组分加入一个200微升PCR管中：25微升DNA聚合酶混合液、20微升连接反应产物、2微升水、1.5微升正向PCR引物和1.5微升反向PCR索引引物。使用以下程序运行PCR仪：95摄氏度3分钟，随后进行20个循环，每个循环包括98摄氏度20秒、67摄氏度20秒和72摄氏度30秒。

在指定循环数后，直接从扩增仪中收集七微升等份样品。使用2%琼脂糖凝胶分离扩增产物，并观察PCR产物的迁移情况。确定处于指数扩增初期的循环数（本示例中为12个循环），并采用该循环数进行大规模PCR反应。

在2%琼脂糖凝胶上分离大规模PCR反应的产物，并切下含有200至350个核苷酸DNA产物的凝胶条带。随后，按照文本方案所述，使用凝胶回收试剂盒从凝胶条带中提取DNA。本视频仅展示最重要的计算步骤。

更多细节请参见文本方案。首先克隆 Git 仓库并进入新创建的目录。创建包含所需软件的环境，并激活该环境。

下载获取 A-seq2 数据的生物体的基因组序列。打开配置文件，并根据文字实验方案中的说明设置输入参数。启动分析。

通过分析来自两份HEK-293细胞样本的a-seq2测序读段，研究了特定基因NUP214在HNRNPC蛋白敲低条件下的响应情况，其中细胞分别用对照小干扰RNA或HNRNPC小干扰RNA进行处理。分析流程所注释的poly(A)位点对应的测序读段以BAM格式保存，并作为IGD基因组浏览器的输入数据。这些读段峰的3'端映射至ensemble数据库中注释的mRNA 3'端。

这些图谱表明，在 HNRNCR 敲低后，长的三端非翻译区（3' UTR）异构体的使用增加。掌握 A-seq 实验方案后，实际操作耗时约 8 小时，或总计 2 至 3 天（不包括细胞培养和过夜连接所需时间）。在实施该方案时，首先设计一组符合本地测序平台要求的引物至关重要。

获得mRNA 3'末端后，可进一步采用交联免疫沉淀等方法，鉴定pre-mRNA 3'末端加工的调控因子。A-seq2为RNA加工领域的研究人员探索选择性多聚腺苷酸化在特定细胞类型中的调控机制及其生物学效应奠定了基础。观看本视频后，您应能够熟练掌握mRNA 3'末端文库的构建方法、测序数据的分析流程、新多聚腺苷酸化位点的鉴定以及使用频率的定量分析。

我们希望 A-seq2 能够帮助您更便捷地开展 mRNA 加工调控的研究，并带来许多新的科学发现。