3 A-seq2 的末端测序库的研制

该方法的总体目标是捕获 mRNA 的三个主要末端并对其进行测序，从而能够研究 mRNA 加工，特别是三个主要末端切割和多聚腺苷酸化，以及基因表达的定量。此处介绍的 A-seq2 方案和数据分析包可以帮助回答有关不同细胞类型和组织中转录本亚型的产生和功能的关键问题。A-seq2 方法的主要优点是它避免了通过长 poly（A） 拉伸进行测序，并且不会产生接头二聚体。

生长至 80% 汇合度的细胞用于此过程。取出生长培养基并用 PBS 洗涤细胞一次。通过每孔添加 1 毫升裂解缓冲液并使用橡胶刮刀将细胞材料从板表面完全分离，直接裂解板上的细胞。

使用 1 mL 移液器吸头将粘性裂解物从每个孔转移到 15 mL 塑料管中。与连接到 23 号皮下注射针头的 1 毫升注射器共享 DNA。对柱塞进行几次剧烈的上下运动，直到裂解物不再粘稠。

将裂解物转移到 1.5 mL 试管中。以 20， 000 倍 g 和 4 摄氏度离心 5 分钟，以去除碎屑。从裂解物中收集澄清的上清液。

添加到 oligo d（T）25 磁珠中并重悬混合物。将试管放在旋转轮上 10 分钟。接下来，将试管放在磁力架上 2 分钟。

取出透明液体。向每根试管中加入 0.8 毫升缓冲液 A，并将试管旋转 180 度 2 至 3 次。从第二次洗涤中取出缓冲液 A。

向每管中加入 0.8 mL 缓冲液 B，并在试管架上放置 2 分钟。要从磁珠中洗脱结合的 mRNA，去除缓冲液 B，向每个试管中加入 33 μL 水，然后重悬磁珠。在心形块上加热至 75 摄氏度 5 分钟。

立即旋转试管一秒钟，然后将它们放在磁力架上。将上清液转移到新试管中。向每管中加入 66 微升碱性水解缓冲液，混合并在加热块上以 95 摄氏度加热整整 5 分钟。

立即将试管放在冰上冷却。随后，使用 RNA 纯化试剂盒进行 RNA 分离，如文本方案中所述。要开始此程序，请向每个 RNA 样品中加入 14 μL 多核苷酸激酶预混液。

在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。30 分钟后，将激酶反应物上样到制备好的离心柱上。以 735 次 g 离心色谱柱 2 分钟。

丢弃色谱柱，将收集的反应管放在冰上。为了封闭 RNA 片段的三个主要末端以避免它们在后续连接反应中发生串联，请向每个样品中添加 17.5 μL poly（A） 聚合酶预混液。混合并旋转 1 秒钟。

在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。30 分钟后，向每个反应中加入 32.5 μL 水并纯化 RNA，如文本方案中所述。首先将反应物置于真空浓缩器中 10 分钟，以将体积减少至 6 μL。

然后向每个反应中加入 24 μL RNA 连接酶预混液。将反应物在加热的混合器上于 24 摄氏度孵育 16 小时，并以 1000 RPM 的速度间歇混合。第二天，向每个反应中加入 17 微升水并混合。

纯化 RNA，如文本方案中所述。将洗脱液放入真空浓缩器中 3 分钟，将体积减少至 11 μL。将反应物转移到 200 μL PCR 管中进行逆转录反应。

加入 1 微升引物。在 PCR 循环仪中以 70 摄氏度加热 5 分钟，然后在室温下放置 5 分钟。向每管中加入 8 微升逆转录预混液并混合。

将试管放入 PCR 循环仪中。加热至 55 摄氏度 10 分钟，再加热至 80 摄氏度 10 分钟。保持在冰上。

准备链霉亲和素珠子，如文本方案中所述。将逆转录反应物加入珠子溶液中，并在 4 摄氏度下在旋转轮上孵育 20 分钟。使用磁力架，用生物素结合缓冲液洗涤珠子两次，用 TEN 缓冲液洗涤两次。

珠子重悬于 50 μL TEN 缓冲液中。加入 2 微升尿嘧啶 DNA 糖基化酶混合物，并在 37 摄氏度下在混合器中孵育 1 小时，间歇混合。向每个反应中加入 50 μL 水、11 μL RNase H 缓冲液和 1 μL Rnase H。

在 37 摄氏度下孵育 20 分钟。将试管放在磁力架上，将含有裂解 cDNA 的液体转移到新试管中。使用 PCR 纯化试剂盒纯化裂解的 cDNA，如文本方案中所述。

将纯化的 cDNA 置于真空浓缩器中 8 分钟，以浓缩至 7 μL 的体积。要将 5 个引物接头连接到分离的 cDNA 的 5 个引物末端，向每个样品中加入 23 μL RNA 连接酶预混液，并在 24 摄氏度下孵育 20 小时。最后，向每个反应中加入 70 微升水。

进行试验 PCR 以确定在指数期达到文库扩增的最佳 PCR 循环数。将以下物质移液到 200 μL PCR 管中：25 μL DNA 聚合酶混合物、20 μL 连接反应、2 μL 水、1.5 μL 正向 PCR 引物和 1.5 μL 反向 PCR 指数引物。使用以下程序运行循环仪：在 95 摄氏度下运行 3 分钟，然后是 20 个循环，每个循环在 98 摄氏度下 20 秒，在 67 摄氏度下 20 秒，在 72 摄氏度下 30 秒。

在指定的循环后，直接从 Cycler 收集 7 微升等分试样。在 2% 琼脂糖凝胶上分离产物并观察 PCR 产物的迁移。确定指数扩增开始时的循环数，本例中为 12 个循环，并将此循环数用于大规模 PCR 反应。

在 2% 琼脂糖凝胶上将产物与大规模 PCR 反应物分离，并切下含有 200 至 350 个核苷酸 DNA 产物的凝胶切片。随后，使用凝胶提取试剂盒从凝胶切片中提取 DNA，如文本方案中所述。本视频中将仅显示最重要的计算步骤。

文本协议中提供了更多详细信息。首先克隆 Git 存储库并更改为新创建的目录。创建包含软件的环境并激活此环境。

下载生物体的基因组序列，从中获得了 A-seq2 数据。打开配置文件并设置输入参数，如文本协议中所示。开始分析。

通过分析来自两个 HEK-293 细胞样品的 a-seq2 读数来检查特定基因 NUP214 对 HNRNPC 蛋白敲低的反应，这些细胞样品用对照小干扰 RNA 或 HNRNPC 小干扰 RNA 处理。记录由分析管道注释的 poly（A） 位点的读数以 BAM 格式保存，用作 IGD 基因组浏览器的输入。读取峰的三个主要末端，在 mMRNA 处映射三个主要末端，以集成方式注释。

图谱表明，在 HNRNCR 敲低后，长 3 引物 UTR 亚型的使用增加。掌握后，A-seq 方案需要 8 小时的手动作时间或大约 2 到 3 天，这还不包括细胞培养和过夜连接的时间。在尝试该方案时，重要的是首先设计一个符合您所在位置使用的测序平台的原始集。

获得 mMRA 三个引物末端后，可以制备其他方法，如交联和免疫沉淀，以鉴定前 mRNA 三个引物末端加工的调节因子。A-seq2 为 RNA 加工领域的研究人员铺平了道路，以探索单个细胞类型中替代多聚腺苷酸化的调节和后果。观看此视频后，您应该对如何生成 mRNA 三个主要末端文库、分析测序数据、识别新的 poly（A） 位点并量化您的使用情况有很好的了解。

我们希望 A-seq2 能简化您开始 mRNA 加工调控的工作，并带来许多新的见解。