Photoactivatable 激动剂对 T 细胞活化的时空控制

该协议描述了一种基于成像的方法, 激活 t 淋巴细胞使用 photoactivatable 肽 MHC, 使精确的时空控制 t 细胞活化。

该方案的总体目标是描述使用光激活肽 MHC 在 T 淋巴细胞中诱导极化信号传导。这种方法可以帮助回答免疫细胞信号转导中的关键问题，例如淋巴细胞如何转导快速定位信号，然后对这些信号产生极化细胞反应。该技术的主要优点是它提供了对 T 细胞信号传导的时空控制。

它通过固定 T 细胞受体激活的精确时间和位置来实现这一点。演示该程序的是我实验室的研究生 Elisa Sanchez。首先，将生物素化的聚-L-赖氨酸或生物-PLL（在蒸馏去离子水中稀释 1 至 500）加入 8 孔室盖玻片中。

在室温下孵育 30 分钟。孵育后，用蒸馏去离子水洗涤，然后在室温下干燥 2 小时。用含 2% BSA 的 HEPES 缓冲盐水组成的封闭缓冲液封闭生物 PLL 涂层表面，在室温下封闭 30 分钟。

孵育后，从生物 PLL 涂层表面去除封闭缓冲液，不要让孔干燥。然后加入链霉亲和素并在 4 摄氏度下孵育。一小时后，用 HBS 清洗涂层表面。

填充并倒置腔室载玻片孔 4 到 5 次，从孔中去除 HBS。不要让井干燥。将 CD4 阳性 T 细胞或 CD8 阳性细胞的特异性生物素化光激活肽主要组织相容性复合物配体和粘附分子添加到生物 PLL 包被表面。

避光并在室温下孵育 1 小时。孵育后，像以前一样洗涤并留在 HBS 中直到准备好播种。最后，将 200， 000 个表达适当 TCR 的 CD4 阳性或 CD8 阳性 T 细胞加入正确的孔中，让细胞在 37 摄氏度下粘附 15 分钟。

一旦细胞附着在表面并扩散，它们就可以进行光活化和成像。使用配备兼容 UV 的 150X 物镜的倒置全内反射荧光显微镜进行图像采集。分别使用 488 纳米和 561 纳米激发激光器监测绿色和红色通道中的探针。

安装包含 T 细胞的腔室载玻片后，根据需要调整显微镜设置以获得 TIRF 或落射荧光照明。在 Live 模式下，选择表达目标荧光探针的细胞区域。使用软件控制在单个细胞下建立用于光活化的微米级区域。

然后，开始客户获取。通常，需要 80 个时间点，每个时间点之间的间隔为 5 秒。在双色实验的情况下，这为连续的 488 纳米和 563 纳米曝光留出了时间。

然后，在获得 10 个时间点后，通过打开数字光圈快门 1 到 1.5 秒来光激活所选区域。延时拍摄完成后，选择新的单元格字段并重复该过程。首先确定细胞外用于背景校正的背景区域的荧光强度。

在单元格外部绘制一个微米大小的正方形区域并制作蒙版。要确定荧光强度，请单击 Analyze（分析）、Mask Statistics（掩码统计）。选择 Mean fluorescence intensity （平均荧光强度） 并导出值。

确定每个时间点光活化区域内的荧光强度。选择 蒙版 以突出显示已光激活的区域。要确定荧光强度，请单击 Analyze（分析）、Mask Statistics（掩码统计）。

选择 Mean fluorescence intensity （平均荧光强度） 和 Export the values （导出值）。通过选择 Mask （遮罩） 以突出显示已光激活的区域，获取光激活区域中心的 X 和 Y 坐标。突出显示光激活区域后，依次选择 Analyze、Mask Statistics 和 Center of Area 和 Export the values 。

确定目标荧光探针的 X 和 Y 坐标。选择 Manual Particle Tracking（手动粒子跟踪），然后单击随时间变化的目标荧光探针。跟踪完所有时间点后，选择 Analyze、Mask Statistics 和 Center of Area 和 Export the values。

将 T 细胞附着在含有光激活 MCC-IEFK 的腔室盖玻片上。C1-GFP 是脂质第二信使 DAG 的探针，使用 TIRF 显微镜和 RFP-微管蛋白在落射荧光模式下成像。T 细胞下方表面的局部光活化诱导 DAG 在照射区的积累。

随后在几秒钟内，中心体重新定位到同一区域。C1-GFP 积累可以通过计算光活化区中心背景校正后随时间变化的归一化荧光强度来量化。响应光活化的中心体重新定位可以通过计算中心体与光活化区中心之间的距离作为时间的函数来量化。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在不到一天的时间内完成。我们通常会生成 15 到 20 部延时电影以供分析。这种方法为研究人员探索 T 细胞中激活信号的精确动力学和极化铺平了道路。

它还适用于研究自然杀伤细胞中的抑制性信号传导。因此，我们现在对通讯性免疫细胞相互作用是如何组装和溶解的有了更好的了解。