用活细胞显微镜研究低压等离子体灭菌对枯草芽孢杆菌孢子存活的不利影响

这项协议说明了评估在用低压等离子体处理后恢复枯草芽孢杆菌孢子后, 监测活力参数和 DNA 修复过程的相关性所需的重要连续步骤。荧光标记的 DNA 修复蛋白质通过时间分辨共焦显微镜和扫描电子显微镜。

这组连续方法的总体目标是使用时间分辨共聚焦荧光显微镜和扫描电子显微镜可视化和监测低压血浆处理后恢复枯草芽孢杆菌孢子的 DNA 修复中的活力参数。我们的方法可以帮助回答微生物灭活和灭菌领域的关键问题。它帮助我们分析低压等离子体处理对生物指标（如枯草芽孢杆菌孢子）的不利影响。

我们技术的主要优点是我们结合了多种方法，视图测定、扫描电子显微镜和使用时间结果荧光显微镜监测 DNA 修复，以验证低压等离子体处理的有害影响。为了进行孢子生产，将相应的枯草芽孢杆菌菌株的 5 毫升过夜培养物（补充有适当的抗生素）转移到 200 毫升双倍强度液体 shafer 孢子形成培养基中，并在 37 摄氏度下剧烈曝气培养至少 72 小时或更长时间，直到超过 95% 的培养物已孢子化。通过 3000 G 离心 15 分钟，在 15 mL 试管中收获孢子，并使用无菌蒸馏 H 2 O 在重复洗涤步骤中纯化样品。

通过面部造影剂检查纯度和发芽状态，并确保孢子悬浮液由大于 99% 的相亮孢子组成，并且没有营养细胞、发芽孢子和细胞碎片，否则可能会干扰进一步的显微镜实验。通过在 LB 琼脂上接种 50 微升 10 倍连续稀释液来确定孢子滴度，以计算 CFU 并将板在 37 摄氏度下孵育过夜。测定 CFU 后，通过浓缩或使用无菌水稀释样品，将样品调整至每毫升 10 至第 9 个孢子。

载玻片或圆形 25 毫米盖玻片形式的样品载体放入电动气溶胶喷雾装置内，与喷嘴对齐。将孢子培养物转移到喷嘴流体入口，并在 0.15 秒时以 1.3 bar 的压力开始喷涂。喷雾的孢子悬浮液在微小的载玻片上形成一层薄膜，该薄膜在几秒钟内迅速干燥，形成均匀分布的孢子单层。

将处理过的样品载体储存在室温下的无菌容器中。要清洁和加热等离子系统中的所有表面，请使用 500 瓦的氩等离子体以 5 帕斯卡的速度启动系统，持续 5 分钟。预处理减少了在腔室通风过程中来自环境空气（如氮气、氧气和水

放空腔室后，小心地将样品放在反应器容器中央的玻璃架上。关闭腔室并抽空。然后，使用所需的工艺气体填充腔室并将系统内的压力调节到 5 帕斯卡。

然后，开始等离子体工艺。在规定的处理时间后，关闭电源和气体供应，并小心地对系统进行通风，以防止样品从样品架中吹出样品。通风后，取出样品并将其储存在无菌容器中。

对于非等离子体处理的对照，只有在存在相当于最长等离子体应用时间的工艺气体的情况下，才能将样品暴露在真空中。制备高压灭菌的 10% 聚醋酸乙烯酯或 PVA 溶液，并使用 500 微升溶液小心地覆盖样品载体。让它们风干 4 小时后，使用无菌镊子剥去现在包含孢子样品的干燥 PVA 层，并将其转移到 2 毫升反应管中。

向试管中加入 1 毫升无菌水并涡旋以溶解 PVA 层，以回收超过 95% 的能够发芽的孢子。使用无菌水在 96 孔板中连续稀释样品 1 至 10。将 50 微升每种稀释液接种在 LB 琼脂上，并在 37 摄氏度下孵育过夜后，计算菌落数并确定每毫升的 CFU。

对于发芽实验，通过煮沸 700 微升培养基来制备 1 毫米厚的 1.5 磅琼脂垫，然后将其移液到无菌显微镜培养皿中。10 分钟后，使用无菌手术刀切出 8 毫米 x 8 毫米 x 1 毫米 LB 琼脂垫，然后小心地将琼脂转移到孢子单层的顶部，这些孢子单层放在 25 毫米玻璃盖玻片上已经安装在成像室中。琼脂放置方法结合了两个特定功能。

在激光显微镜检查期间，它可以稳定光学平面中的样品，并限制侧向细胞的运动。除了用于发芽论文外，这种方法还可以应用于其他微生物以及真核细胞。用琼脂覆盖样品后，将玻璃盖玻片快速转移到成像室中。

在整个成像过程中，将样品保存在 37 摄氏度的加热台上。每种情况至少使用 3 次生物学重复。在通过自动共聚焦激光扫描和明场显微镜对样品进行成像后，以 2.6% 的激光功率记录延时序列，并将共聚焦孔径设置为五个 aer 单位和每 30 秒一帧的采样频率，从零到五个小时，具体取决于实验。

在激光显微镜检查期间，应用高剂量的单色光可能会完全抑制孢子萌发。因此，使用激光强度和更长的间隔来获得单帧。在孢子聚集、多层孢子分布或被灰尘颗粒污染的情况下，可能会发生等离子体处理阻塞或阴影，并使阴影孢子发芽。

为了进行扫描电子显微镜检查，一旦孢子单层用金钯溅射编码，使用在 5 千伏加速电压下运行的场发射 SEM 对样品进行成像，包括 inlan 二次电子探测器，以揭示地形对比度。如图所示，枯草芽孢杆菌孢子的血浆处理导致存活率随着血浆处理持续时间的增加而降低。这些 SEM 图像揭示了特征性的纵向脊状结构，这些结构在所有处理和未处理的孢子中始终可见。

对照组相比，长达 30 秒的等离子体处理不会诱导孢子表面形态的显着变化。血浆处理持续时间的增加会导致表面更颗粒状，并且在处理 120 或 240 秒的孢子中可以观察到小裂缝和裂缝。在这些时间分辨的共聚焦激光扫描显微镜实验中，几乎所有用真空作为对照处理的孢子都会发芽并形成具有相当均匀单个细胞长度的杆状细胞形态。

相比之下，用血浆处理 15 秒的孢子已经显示出发芽能力降低到不到 75% 或正负 4%。此外，细胞要么长成很长的杆状，要么保持小并粘在孢子壳中。血浆处理 30 秒后，只有 25% 的孢子发芽或减少 6%，营养细胞的生长明显延迟并且长度不同。

在尝试此过程时，重要的是要使用相差显微镜确认孢子单层的质量，以确保没有重叠或发芽的孢子。开发后，用于图像稳定的琼脂垫方法为等离子体灭菌和活细胞显微镜研究人员铺平了道路。观看此视频后，您应该更好地了解如何在载玻片上制备孢子单层、使用等离子体处理灭活孢子的确定性以及进行活细胞和扫描电子显微镜检查。

与其他净化方法（例如环氧乙烷或伽马射线）相比，等离子体灭菌是一种有效且安全的方法，可以减少几乎任何类型表面上的大量有害微生物。