一种基于细胞的简单免疫荧光法检测血液中抗N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体自身抗体

本实验的总体目标是检测疑似自身免疫性脑炎患者血液中针对NMDA受体的自身抗体。该检测有助于解答在具有急性神经精神症状的患者中进行鉴别诊断的关键问题。该技术的主要优势在于其是一种简单且可靠的筛查方法。

开始此操作前，需准备明胶包被的培养板。将200微升2%明胶溶液分装至48孔培养板的每孔中，并在37°C孵育至少30分钟。30分钟后，吸除各孔中的明胶溶液。

在每孔中接种5 × 10⁴个HEK293细胞，加入200 µL含10% FBS的细胞培养基。将培养板置于37°C、含5% CO₂的湿润培养箱中过夜培养。次日，将每孔中的用过的培养基更换为200 µL含10% FBS的新鲜培养基。

根据实验中孔板的总孔数进行放大，通过将NR1-GFP质粒与培养基混合来制备溶液A。通过将转染试剂与培养基混合来制备溶液B。通过将溶液A与溶液B混合，并在室温下孵育20至30分钟来制备溶液C。

接下来，将40 µL溶液C分装至每个含有HEK293细胞的孔中。轻轻摇晃培养板，并将培养板置于37°C、含5% CO₂的湿润培养箱中过夜孵育。在进行基于细胞的免疫荧光检测之前，使用荧光显微镜在40至200倍放大倍数下观察宿主细胞中NR1-GFP重组蛋白的表达情况。

开始本实验时，首先从培养板的各孔中吸除废弃培养基，然后每孔加入 200 微升 PBS 洗涤三次。每孔加入 200 微升 4% 多聚甲醛溶液，在室温下孵育 15 分钟。吸除各孔中的多聚甲醛溶液，再用 200 微升 PBS 每孔洗涤三次。

接着，向每个孔中加入 200 µL 含 10% 脱脂奶粉的 PBST 溶液，室温下轻轻振荡孵育 1 小时。吸去各孔中的含 10% 脱脂奶粉的 PBST 溶液，用 200 µL PBST 洗涤各孔一次。将血浆用 PBST 按 1:100 稀释后作为一抗加入各孔中，室温下轻轻振荡孵育 1 小时。

孵育一小时后，吸去各孔中的稀释血浆，每孔用 200 微升 PBST 洗涤三次。每孔加入 200 微升 Alexa Fluor 594 标记的羊抗人 IgG，将培养板在室温下轻轻振荡孵育一小时。随后，吸去 Alexa Fluor 594 标记的羊抗人 IgG 溶液，每孔用 200 微升 PBST 洗涤三次。

第三次 PBST 洗涤后，向每个孔中加入 100 微升含 DAPI 的甘油溶液。使用荧光显微镜观察并拍摄细胞，根据每种染料选择正确的滤光片，并分别使用 4 倍、10 倍和 20 倍物镜配合 10 倍目镜进行成像。这些转染后 24 至 30 小时拍摄的代表性图像显示了表达 NR1-GFP 的 HEK293 细胞。

在荧光显微镜下，约有30%的细胞显示出绿色信号。在相应的Alexa Fluor 594图像中，B图中的红色信号表明抗NMDA受体自身抗体与HEK293细胞中表达的NR1结合。E图中微弱的红色信号表示Alexa Fluor 594图像的背景噪声。

表达NR1-GFP的细胞用于筛查人血浆样本中抗NMDA受体自身抗体的存在。在这些合并图像中，黄色表示NR1-GFP与抗NMDA受体自身抗体的共定位。箭头指示共定位明显的细胞示例。

在此情况下，若血浆样本中绿色和红色信号的重叠面积超过30%，则判读为阳性。在阴性对照的合并图像中，绿色和红色信号几乎无重叠，这证实了抗NMDA受体自身抗体在该检测中对NR1-GFP的特异性结合。一旦掌握该技术，若操作得当，可在四小时内完成。

在尝试该技术时，重要的是要记住这仅是一种筛查手段。在完成该操作后，可进一步采用其他方法，如蛋白质印迹分析和基于组织的分析，以回答更多问题，例如阳性病例的特异性。该技术的建立为精神病学领域的研究人员探索急性精神健康急症患者的鉴别诊断提供了新的途径。

观看本视频后，您应能充分了解如何开展血液中抗NMDA受体自身抗体的筛查实验。