血液中 n-甲基-d-天门冬氨酸 (NMDA) 受体自身抗体的简易细胞免疫荧光检测

该检测的总体目标是检测疑似自身免疫性脑炎患者血液中针对 NMDA 受体的自身抗体。该措施有助于回答急性神经精神症状患者鉴别诊断的关键问题。该技术的主要优点是它是一种简单可靠的筛查措施。

通过制备明胶包被的培养板开始此过程。将 200 微升 2% 明胶溶液分装到 48 孔培养板的每个孔中，并在 37 摄氏度下孵育板至少 30 分钟。30 分钟后，从孔中吸出明胶溶液。

在每个孔中接种 5 乘以 10 至第 4 个 HEK293 细胞，溶于 200 微升含有 10% FBS 的细胞培养基中。将板在 37 摄氏度下在提供 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育过夜。第二天，用 200 微升含有 10% FBS 的新鲜培养基替换每个孔中的用过的培养基。

根据实验中的孔总数按比例放大，通过将 NR1-GFP 质粒与培养基混合来制备溶液 A。通过将转染试剂与培养基混合来制备溶液 B。将溶液 A 和溶液 B 混合，并在室温下孵育混合物 20 至 30 分钟，以制备溶液 C。

接下来，将 40 微升溶液 C 分装到含有 HEK293 细胞的每个孔中。轻轻旋转板，并将板在 37 摄氏度下在提供 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育过夜。在进行基于细胞的免疫荧光测定之前，在荧光显微镜下以 40 倍至 200 倍的放大倍数检查宿主细胞中 NR1-GFP 重组蛋白的表达。

要开始此测定，首先从培养板的孔中吸出用过的培养基，然后用 200 微升 PBS 洗涤每个孔 3 次。向每个孔中加入 200 微升 4% 多聚甲醛溶液，并在室温下孵育板 15 分钟。从孔中吸出多聚甲醛溶液，并用 200 微升 PBS 洗涤每个孔 3 次。

接下来，向每个孔中加入 200 微升 PBST 溶液中的 10% 脱脂牛奶，并在室温下轻轻摇动孵育板 1 小时。从孔中吸出 PBST 溶液中的 10% 脱脂牛奶，并用 200 微升 PBST 洗涤孔一次。将孔与在 PBST 中稀释 1 至 100 的血浆作为一抗一起孵育，并在室温下轻轻摇动 1 小时。

一小时后，从孔中吸出稀释的血浆，并用 200 微升 PBST 洗涤每个孔 3 次。向每个孔中加入 200 μL 山羊抗人 IgG，与 Alexa Fluor 594 偶联，并在室温下轻轻摇动孵育培养板 1 小时。接下来，吸出与 Alexa Fluor 594 溶液偶联的山羊抗人 IgG，并用 200 μL PBST 洗涤每个孔 3 次。

第三次 PBST 洗涤后，向每个孔中加入 100 微升含有 DAPI 的甘油溶液。在荧光显微镜下，使用每种染料的正确滤光片和具有 4 倍、10 倍和 20 倍物镜的 10 倍目镜观察和成像细胞。转染后 24 至 30 小时拍摄的这些代表性图像显示了表达 NR1-GFP 的 HEK293 细胞。

大约 30% 的细胞在荧光显微镜下具有绿色信号。在相应的 Alexa Fluor 594 图像中，图 B 中的红色信号表示抗 NMDA 受体自身抗体与 HEK293 细胞中表达的 NR1 的结合。图 E 中的微弱红色信号表示 Alexa Fluor 594 图像的背景噪声。

表达 NR1-GFP 的细胞用于筛选人血浆样本中抗 NMDA 受体自身抗体的存在。在这些合并图像中，黄色表示 NR1-GFP 和抗 NMDA 受体自身抗体的共定位。箭头表示具有突出共定位的细胞示例。

在这种情况下，显示绿色和红色信号重叠大于 30% 的血浆样品将被解释为阳性。在阴性对照的合并图像中，绿色和红色信号几乎没有重叠，这证实了抗 NMDA 受体自身抗体在测定中与 NR1-GFP 的特异性结合。一旦掌握，如果执行得当，该技术可以在四个小时内完成。

在尝试这种技术时，重要的是要记住它只是一种筛选措施。遵循这些程序后，可以执行其他措施，例如蛋白质印迹分析和基于组织的分析，以回答其他问题，例如阳性病例的特异性。开发后，该技术为精神病学领域的研究人员探索急性心理健康紧急情况患者的鉴别诊断铺平了道路。

观看此视频后，您应该对如何进行检测以筛选血液中针对 NMDA 受体的自身抗体有很好的了解。