Name: 血液中 n-甲基-d-天门冬氨酸 (NMDA) 受体自身抗体的简易细胞免疫荧光检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 学习使用HEK293细胞检测血液中NMDA受体自身抗体的简易细胞免疫荧光方法。该技术通过表达NR1-GFP重组蛋白，可在约四小时内完成筛查，为自身免疫性脑炎的鉴别诊断提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由长庚医学基金会资助（资助编号 CMRPG3C1771、CMRPG3C1772、CMRPG3E0631、CMRPG3E0632 和 CMRPG3E0633）。

该研究已获得中国台湾桃园市林口长庚纪念医院机构审查委员会的批准（102-2577A3）。
1. NR1-GFP 表达质粒的制备
<ol>
	<li>在无菌的 1.5 mL 离心管中，将 10 ng NR1-GFP 质粒与 100 µL 大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α 感受态细胞混合，用移液器轻轻吹打混合液 4–6 次，然后将离心管置于冰上孵育 20 分钟。</li>
	<li>将离心管在 42 °C 水浴中孵育 1 分钟，从水浴中取出离心管，向管中加入 1 mL LB 培养基（Lysogeny Broth），然后将离心管置于 37 °C 摇床中振荡培养 1 小时。</li>
	<li>取 50 µL 混合液涂布于含氨苄青霉素（0.1 mg/mL）的 LB 琼脂平板上，将平板置于 37 °C 培养箱中过夜培养。</li>
	<li>用无菌枪头从过夜培养的 LB 琼脂平板上挑取单个菌落，将枪头在含有 5 mL LB 培养基和氨苄青霉素（0.1 mg/mL）的细菌培养管中轻轻旋转混匀。将培养管置于 37 °C 摇床中振荡过夜培养。</li>
	<li>将 3 mL 过夜培养的菌液转移至含有 250 mL 无菌 LB 培养基和氨苄青霉素（0.1 mg/mL）的 500 mL 三角瓶中。将三角瓶置于 37 °C 振荡培养。使用分光光度计定期检测菌液在 600 nm 波长下的光密度（OD），直至 OD600 达到 0.6–1.0。 
	注意：将 800 µL 过夜培养的菌液与 200 µL 甘油充分混匀，制备甘油菌种，于 -80 °C 保存以备后续使用。</li>
	<li>从 250 mL 细菌培养物中提取 NR1-GFP 表达质粒
	<ol>
		<li>在 4 °C 条件下，以 6,000 × g 离心 15 分钟收集菌体。</li>
		<li>将菌体沉淀重悬于含 RNase A 的 10 mL 重悬缓冲液中，充分涡旋振荡至无可见团块。</li>
		<li>向菌液中加入 10 mL 裂解缓冲液，轻轻倒置混合 4–6 次，并在室温（RT）下孵育 5 分钟。</li>
		<li>向裂解液中加入 10 mL 预冷的沉淀缓冲液，轻轻倒置混合 4–6 次。</li>
		<li>将裂解液倒入带有盖子的滤器套筒中，在室温下静置 10 分钟。</li>
		<li>取下滤器出口端的盖子，将推杆插入套筒中，轻轻下压推杆，将滤过的裂解液收集至 50 mL 离心管中。</li>
		<li>向滤过的裂解液中加入 2.5 mL 厂家提供的专用缓冲液，通过倒置约 10 次混匀，然后将混合液置于冰上孵育 30 分钟。</li>
		<li>将滤过的裂解液混合物上样至已用 10 mL 平衡缓冲液预平衡的过滤柱中，依靠重力自然流过。</li>
		<li>用 30 mL 洗涤缓冲液洗涤柱子两次，然后用 15 mL 洗脱缓冲液洗脱 DNA。</li>
		<li>向洗脱的 DNA 溶液中加入 10.5 mL（0.7 倍体积）异丙醇，充分混匀，然后在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 30 分钟。</li>
		<li>小心弃去上清液，用 5 mL 无内毒素的 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀一次，再以 20,000 × g 离心 10 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，在化学通风橱中干燥沉淀 5–10 分钟，然后将沉淀溶解于 300–500 µL 无内毒素缓冲液中。</li>
		<li>使用分光光度计测定溶液在 260/280 nm 紫外波长下的吸光度，以确定质粒浓度。 
		注意：使用相同方案制备表达质粒 GFP。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用 NR1-GFP 表达质粒转染 HEK293 细胞
<ol>
	<li>向48孔培养板的每个孔中加入200 µL 2%明胶溶液，在37 °C孵育至少30分钟。</li>
	<li>吸除孔中的明胶溶液，每孔接种5 × 104个HEK293细胞，加入含10%胎牛血清（FBS）的200 µL细胞培养基。将培养板置于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中过夜孵育。 
	注意：细胞计数使用血细胞计数板进行。</li>
	<li>次日，将用过的培养基更换为每孔200 µL含10% FBS的新鲜培养基。</li>
	<li>针对每个单独的孔，通过将100 ng NR1-tGFP质粒与20 µL培养基混合制备溶液A，通过将0.8 µL转染试剂与20 µL培养基混合制备溶液B。根据实验所需孔数计算并放大各溶液的总体积。</li>
	<li>将溶液A与溶液B混合制备溶液C，在室温下孵育20–30分钟。</li>
	<li>向每孔含有HEK293细胞的孔中加入40 µL溶液C，轻轻摇动培养板混匀，然后将培养板置于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中过夜孵育。</li>
	<li>在荧光显微镜下（放大倍数40X–200X，激发/发射波长：482/502 nm）观察宿主细胞中NR1-GFP重组蛋白的表达情况，并继续进行基于细胞的免疫荧光检测。 
	注意：使用相同方案将GFP表达质粒转染至HEK293细胞中。</li>
</ol>
3. 基于细胞的免疫荧光检测
<ol>
	<li>吸弃孔中的废弃培养基，然后每孔加入 200 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次。</li>
	<li>每孔加入 200 µL 4% 多聚甲醛溶液，在室温下孵育 15 分钟。</li>
	<li>吸弃孔中的多聚甲醛溶液，每孔用 200 µL PBS 洗涤三次。</li>
	<li>每孔加入 200 µL 含 10% 脱脂奶粉的 PBST 溶液（PBS 中含 0.1% Tween-20），在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。</li>
	<li>吸弃孔中的含 10% 脱脂奶粉的 PBST 溶液，然后每孔用 200 µL PBST 洗涤一次。</li>
	<li>将稀释的血浆（以 PBST 按 1:100 稀释）作为一抗加入各孔，在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。 
	注意：血浆来源于疑似患有自身免疫性脑炎患者的血液。</li>
	<li>吸弃孔中的稀释血浆，每孔用 200 µL PBST 洗涤三次。</li>
	<li>每孔加入 200 µL 与 Alexa Fluor 594 偶联的山羊抗人 IgG 抗体（以 PBST 按 1:1,000 稀释），将培养板在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。</li>
	<li>吸弃与 Alexa Fluor 594 偶联的山羊抗人 IgG 溶液，每孔用 200 µL PBST 洗涤三次。</li>
	<li>每孔加入 100 µL 甘油溶液（含 50% 甘油的 PBS 溶液，并加入 1:100,000 的 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI））。</li>
	<li>使用荧光显微镜，配备 10X 目镜以及 4X、10X 和 20X 物镜观察并拍摄细胞图像。 
	注意：每种染料需使用正确的滤光片：NR1-GFP（激发/发射波长 = 482/502 nm），Alexa Fluor 594（激发/发射波长 = 561/594 nm），DAPI（激发/发射波长 = 358/461 nm）。使用表达 GFP 的 HEK 细胞以相同方法进行阴性对照实验。</li>
</ol>

<ol><li>Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+surface+antibody-mediated+autoimmune+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis.</a> Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).</li>
<li>Lancaster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+and+treatment+of+autoimmune+Encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis.</a> J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Pruss, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+analysis+of+NMDA+receptor+antibodies+in+encephalitis+of+unknown+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin.</a> Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).</li>
<li>Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+encephalopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Autoimmune encephalopathies.</a> Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).</li>
<li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+an+observational+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).</li>
<li>Chapman, M. R., Vause, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+diagnosis%2C+psychiatric+presentation%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment.</a> Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).</li>
<li>Gable, M., Glaser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-n-methyl-d-aspartate+receptor+encephalitis+appearing+as+a+new-onset+psychosis%3A+disease+course+in+children+and+adolescents+within+the+california+encephalitis+project%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project.</a> Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).</li>
<li>Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+experience+and+laboratory+investigations+in+patients+with+anti-NMDAR+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis.</a> Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraneoplastic+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).</li>
<li>Irani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methyl-D-aspartate+antibody+encephalitis%3A+temporal+progression+of+clinical+and+paraclinical+observations+in+a+predominantly+non-paraneoplastic+disorder+of+both+sexes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes.</a> Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).</li>
<li>Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+antibody+encephalitis%3A+performance+evaluation+and+laboratory+experience+with+the+anti-NMDA-receptor+IgG+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay.</a> Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).</li>
<li>Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+glutamate+receptor+ion+channel+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes.</a> Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).</li>
<li>Ramberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+diagnostic+accuracy+of+microscopy+and+flow+cytometry+in+evaluating+n-methyl-d-aspartate+receptor+antibodies+in+serum+using+a+live+cell-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay.</a> PLoS One. 10 (3), e0122037(2015).</li>
<li>Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+a+severe%2C+multistage%2C+treatable+disorder+presenting+with+psychosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis.</a> J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).</li>
<li>Dahm, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seroprevalence+of+autoantibodies+against+brain+antigens+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease.</a> Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).</li>
<li>Jézéquel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-+and+single+molecule-based+methods+to+detect+anti-n-methyl-d-aspartate+receptor+autoantibodies+in+patients+with+first-episode+psychosis+from+the+OPTiMiSE+project%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project.</a> Biol Psychiatry. , (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

文献中已报道多种基于细胞的免疫学检测方法，用于筛查抗NMDA受体的自身抗体，包括活细胞免疫荧光检测11、固定细胞免疫荧光检测9以及基于流式细胞术的检测方法14。活细胞免疫荧光检测应在表达NR1蛋白的细胞制备后尽快进行，而基于流式细胞术的检测则需要经过培训的技术人员和特殊设备。固定细胞免疫荧光检测是一种更为便捷的方法，适用于临床检测环境。因此，许多研究采用商业化的间接固定细胞免疫荧光检测试剂盒，用于筛查血清和脑脊液样本中的抗NMDA受体自身抗体12,15。所使用的试剂盒（见材料表）包含已固定且异源表达NMDA受体重组NR1亚基的HEK293细胞。该检测方法在血清和脑脊液样本中抗NMDA受体IgG抗体的检测中表现出优异的性能12。在本实验方案中，我们采用了与试剂盒制造商推荐方法相同的操作流程，唯一区别在于我们使用了NR1-GFP表达质粒...

抗NMDA受体自身免疫性脑炎是一种新近被认识的疾病实体，可发生于所有年龄段的患者，且主要影响女性患者1,2。在病因初始不明的脑炎患者中，它是诊断频率最高的脑炎类型之一3。抗NMDA受体脑炎患者通常先出现头痛或发热等前驱症状，随后迅速出现意识水平改变以及多种急性神经精神症状，包括激越、易激惹、焦虑、失眠、幻觉、妄想、攻击行为、怪异举止、运动异常、自主神经功能紊乱和癫痫发作4,5。对该疾病进行早期识别并及时采用免疫治疗，对于改善患者预后甚至实现完全康复具有重要意义6。因此，建议将抗NMDA受体自身免疫性脑炎作为表现为急性或新发精神病性特征患者的重要的鉴别诊断之一7,8。
除了临床特征外，检测血液或脑脊液中抗NMDA受体的自身抗体对于准确诊断抗NMDA受体自身免疫性脑炎至关重要9。目前，大多数用于检测抗NMDA受体自身抗体的免疫学检测方法仅在少数研究实验室中可获得10,11，且仅有一种 commercially available 的基于细胞的免疫荧光检测法可用于筛查抗NMDA受体自身抗体12。本研究的目标是建立一种简便的实验室自建基于细胞的免疫荧光检测法，可方便地在实验室中用于筛查抗NMDA受体自身抗体的存在，从而促进抗NMDA受体自身免疫性脑炎的临床研究。NMDA受体是一种在脑内特异性表达的异源四聚体离子通道蛋白复合物。它由两个必需的NR1亚基，以及一个或两个NR2A、NR2B、NR2C或NR2D亚基组合构成13。先前的研究报道，抗体主要靶向的表位位于NR1亚基的胞外N端结构域5。因此，在本方案中，我们在人胚胎肾上皮细胞系（HEK293）中表达带有绿色荧光蛋白（GFP）标签的人重组NMDA受体NR1亚基蛋白，并建立一种基于细胞的免疫荧光检测法，用于检测血液中IgG类抗NMDA受体自身抗体。

<table><tbody><tr><td>GRIN1（GFP 标签）- 人类谷氨酸受体，离子型，N-甲基-D-天冬氨酸 1（GRIN1），转录变体 NR1-1</td><td>Origene (Rockville, MD, USA)</td><td>RG219368</td><td>带有 C 末端 tGFP 序列标签的 NR1-cDNA 克隆</td></tr><tr><td>pCMV6-AC-GFP</td><td>Origene (Rockville, MD, USA)</td><td>PS100010</td><td>带有 C 末端 tGFP 标签的哺乳动物表达载体</td></tr><tr><td>EndoFree 质粒大提试剂盒</td><td>Qiagen (Hilden Germany)</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 转染试剂</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含丙酮酸钠</td><td>Thermo Fisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>经鉴定的胎牛血清，美国来源</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗人 IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 594 标记</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11014</td><td></td></tr><tr><td>阳性对照：抗谷氨酸受体（NMDA 型）</td><td>Euroimmun AG, L&amp;uuml;beck, Germany</td><td>CA 112d-0101</td><td></td></tr><tr><td>Euroimmun 检测试剂盒</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种基于细胞的简单免疫荧光法检测血液中抗n-甲基-d-天冬氨酸（nmda）受体自身抗体

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

抗NMDA受体自身抗体的存在可导致患者出现多种神经精神症状，称为抗NMDA受体自身免疫性脑炎。准确诊断该疾病的关键在于检测血液或脑脊液（CSF）中是否存在针对NMDA受体的特异性自身抗体。NMDA受体是一种离子通道蛋白复合物，包含四个亚基，其中包括两个必需的NMDA受体1亚基（NR1）以及一个或两个NMDA受体2A亚基（NR2A）、NMDA受体2B亚基（NR2B）、NMDA受体2C亚基（NR2C）或NMDA受体2D亚基（NR2D）。据报道，抗NMDA受体自身抗体的表位位于NMDA受体NR1亚基的胞外N端结构域。本研究的目标是建立一种简便的基于细胞的免疫荧光检测方法，可用于筛查血液中是否存在针对NMDA受体NR1亚基的自身抗体，从而促进抗NMDA受体自身免疫性脑炎的临床与基础研究。

按照本方案第1节所述步骤，从250 mL细菌培养物中平均可获得200–300 µg无内毒素的表达质粒NR1-GFP和GFP。根据方案第2节所述，将100 ng/孔的表达质粒用于转染培养在48孔板中的HEK293细胞。转染后24–30小时，细胞表达NR1-GFP和GFP重组蛋白，可在荧光显微镜下检测到。图1A显示表达NR1-GFP的宿主细胞图像，而图1D显示表达GFP的细胞图像。绿色信号可作为实验质量控制指标：在荧光显微镜下，约30%的细胞呈现绿色信号。图1A和1D显示表达NR1-GFP的宿主细胞图像。绿色信号可作为实验质量控制指标：在荧光显微镜下，约30%的细胞呈现绿色信号。表达NR1-GFP的细胞用于筛查人血浆样本中是否存在抗NMDA受体自身抗体。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page...

我们在人胚胎肾细胞（HEK293）中异位表达了绿色荧光蛋白标记的NMDA受体NR1亚基，作为抗原用于检测疑似自身免疫性脑炎患者血液中针对NMDA受体的自身抗体。这种简单的方法可能适用于临床环境中的筛查。

一种基于细胞的简单免疫荧光法检测血液中抗N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体自身抗体

抗NMDA受体自身抗体的存在可导致患者出现多种神经精神症状，称为抗NMDA受体自身免疫性...

本实验的总体目标是检测疑似自身免疫性脑炎患者血液中针对NMDA受体的自身抗体。该检测有助于解答在具有急性神经精神症状的患者中进行鉴别诊断的关键问题。该技术的主要优势在于其是一种简单且可靠的筛查方法。开始此操作前，需准备明胶包被的培养板。将200微升2%明胶溶液分装至48孔培养板的每孔中，并在37°C孵育至少30分钟。30分钟后，吸除各孔中的明胶溶液。在每孔中接种5 × 10⁴个HEK293细胞，加入200 µL含10% FBS的细胞培养基。将培养板置于37°C、含5% CO₂的湿润培养箱中过夜培养。次日，将每孔中的用过的培养基更换为200 µL含10% FBS的新鲜培养基。根据实验中孔板的总孔数进行放大，通过将NR1-GFP质粒与培养基混合来制备溶液A。通过将转染试剂与培养基混合来制备溶液B。通过将溶液A与溶液B混合，并在室温下孵育20至30分钟来制备溶液C。接下来，将40 µL溶液C分装至每个含有HEK293细胞的孔中。轻轻摇晃培养板，并将培养板置于37°C、含5% CO₂的湿润培养箱中过夜孵育。在进行基于细胞的免疫荧光检测之前，使用荧光显微镜在40至200倍放大倍数下观察宿主细胞中NR1-GFP重组蛋白的表达情况。开始本实验时，首先从培养板的各孔中吸除废弃培养基，然后每孔加入 200 微升 PBS 洗涤三次。每孔加入 200 微升 4% 多聚甲醛溶液，在室温下孵育 15 分钟。吸除各孔中的多聚甲醛溶液，再用 200 微升 PBS 每孔洗涤三次。接着，向每个孔中加入 200 µL 含 10% 脱脂奶粉的 PBST 溶液，室温下轻轻振荡孵育 1 小时。吸去各孔中的含 10% 脱脂奶粉的 PBST 溶液，用 200 µL PBST 洗涤各孔一次。将血浆用 PBST 按 1:100 稀释后作为一抗加入各孔中，室温下轻轻振荡孵育 1 小时。孵育一小时后，吸去各孔中的稀释血浆，每孔用 200 微升 PBST 洗涤三次。每孔加入 200 微升 Alexa Fluor 594 标记的羊抗人 IgG，将培养板在室温下轻轻振荡孵育一小时。随后，吸去 Alexa Fluor 594 标记的羊抗人 IgG 溶液，每孔用 200 微升 PBST 洗涤三次。第三次 PBST 洗涤后，向每个孔中加入 100 微升含 DAPI 的甘油溶液。使用荧光显微镜观察并拍摄细胞，根据每种染料选择正确的滤光片，并分别使用 4 倍、10 倍和 20 倍物镜配合 10 倍目镜进行成像。这些转染后 24 至 30 小时拍摄的代表性图像显示了表达 NR1-GFP 的 HEK293 细胞。在荧光显微镜下，约有30%的细胞显示出绿色信号。在相应的Alexa Fluor 594图像中，B图中的红色信号表明抗NMDA受体自身抗体与HEK293细胞中表达的NR1结合。E图中微弱的红色信号表示Alexa Fluor 594图像的背景噪声。表达NR1-GFP的细胞用于筛查人血浆样本中抗NMDA受体自身抗体的存在。在这些合并图像中，黄色表示NR1-GFP与抗NMDA受体自身抗体的共定位。箭头指示共定位明显的细胞示例。在此情况下，若血浆样本中绿色和红色信号的重叠面积超过30%，则判读为阳性。在阴性对照的合并图像中，绿色和红色信号几乎无重叠，这证实了抗NMDA受体自身抗体在该检测中对NR1-GFP的特异性结合。一旦掌握该技术，若操作得当，可在四小时内完成。在尝试该技术时，重要的是要记住这仅是一种筛查手段。在完成该操作后，可进一步采用其他方法，如蛋白质印迹分析和基于组织的分析，以回答更多问题，例如阳性病例的特异性。该技术的建立为精神病学领域的研究人员探索急性精神健康急症患者的鉴别诊断提供了新的途径。观看本视频后，您应能充分了解如何开展血液中抗NMDA受体自身抗体的筛查实验。

a-simple-cell-based-immunofluorescence-assay-to-detect-autoantibody

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

血液中 n-甲基-d-天门冬氨酸 (NMDA) 受体自身抗体的简易细胞免疫荧光检测

本视频演示了一种利用大鼠海马神经元培养物来鉴定样本中针对特定抗原的抗体的技术。通过将培养的神经元暴露于含有靶向N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDARs）自身抗体的患者样本中，可通过免疫染色揭示结合在神经元表面的自身抗体的存在。...

利用海马神经元培养检测人血清中自身抗体的实验方法

近年来，基于活细胞的检测方法已成功用于检测针对细胞表面和构象性抗原的抗体。本文介绍了一种利用高通量流式细胞术的方法，可实现对大规模患者队列的分析。新抗体的发现将有助于改善免疫介导性疾病的确诊与治疗。...

高通量流式细胞术细胞检测法用于检测人血清中抗N-甲基-D-天冬氨酸受体或抗多巴胺-2受体抗体

本文介绍一种可生成定制化抗原微阵列的方法，可用于同时检测人和小鼠血清中的IgG和IgM自身抗体。该阵列可实现针对任何目标抗原或表位的抗体高通量、定量检测。...

同时检测IgG和IgM自身抗体的双色抗原微阵列的制备

DFS70 自身抗体可模拟常见的疾病相关抗核抗体模式，导致在使用传统 HEp-2 底物时难以准确判读。本方案描述了新型工程化 HEp-2 底物相较于传统 HEp-2 底物在抗核抗体筛查中的优势，以及在单特异性和混合型抗核抗体阳性病例中高置信度区分 DFS70...

在ANA筛查中利用新型HEp-2 ELITE/DFS70基因敲除底物同时区分单特异性与混合型DFS70模式

本实验方案的目标是促进对NMDA受体（NMDAR）的大规模研究，并允许检测小分子的调节作用及其治疗应用。...

一种高通量钙流检测法，用于研究对甘氨酸/D-丝氨酸和谷氨酸敏感的NMDA受体

基于细胞的检测方法是一种广泛用于检测血清抗水通道蛋白-4免疫球蛋白G的常用技术。该方法可应用于视神经脊髓炎谱系障碍的临床诊断和科学研究。...

基于细胞法检测人血清抗水通道蛋白-4免疫球蛋白G

我们建立了一种简单的多重电化学发光（ECL）检测方法，可将7种自身抗体检测整合在一起。该检测能够同时筛查1型糖尿病（T1D）以及多种其他自身免疫性疾病，包括乳糜泻、自身免疫性甲状腺疾病和自身免疫性多腺体综合征1型。...

一种高通量电化学发光7重联检方法同步筛查1型糖尿病及多种自身免疫性疾病

自身免疫性脑炎是一类新型的中枢神经系统抗体介导性疾病。海马神经元可用于发现和鉴定这些抗体。本文提供了一种原代细胞培养和免疫染色的实验方案，用于检测患者血清和脑脊液中的自身抗体。...

用于检测和研究自身免疫性脑炎中新型致病性抗体的海马神经元培养

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种多发性硬化症（MS）的动物模型，与人类疾病相似，均具有强烈的体液自身免疫反应。本文报道一种简单且灵活的ELISA实验方案，用于定量检测EAE免疫小鼠血清中的自身抗体。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中自身反应性抗体的定量分析

我们提供一种用于检测抗MDA5抗体的逐步免疫细胞化学（ICC）方法。该方法包括细胞固定、通透化、抗体孵育和成像技术，可准确检测抗MDA5自身抗体，有助于诊断肌炎患者中快速进展的间质性肺病。...

利用HeLa细胞和光学显微镜免疫细胞化学法检测抗MDA5自身抗体

我们介绍一种基于无细胞合成生物学原理和点印迹技术的新型免疫检测平台，可用于定制化检测人和动物血清中的抗体反应。...

无细胞点印迹法作为一种实用且可灵活调整的免疫检测平台，用于检测人和动物血清中的抗体反应

学习使用HEK293细胞检测血液中NMDA受体自身抗体的简易细胞免疫荧光方法。该技术通过表达NR1-GFP重组蛋白，可在约四小时内完成筛查，为自身免疫性脑炎的鉴别诊断提供可靠工具。

一种基于细胞的简单免疫荧光法检测血液中抗N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体自身抗体

探索更多视频