小鼠视网膜色素上皮细胞的原代培养

该程序的总体目标是展示一种从小鼠眼睛获得视网膜色素上皮细胞的可行方法，并在保留其原始特性的同时在体外培养它们。这种方法将帮助 RPE 研究人员获得建立小鼠 RPE 细胞培养物所需的解剖技能，并演示如何以简单的方式做到这一点。该程序的主要优点是简单可行。

唯一需要的是练习，RPE 分离和显微镜的视觉演示从字面上展示了如何获得所需的技能。为了隔离小鼠眼球，首先使用任何批准的方法对两只小鼠实施安乐死，然后戴上手套将其放在吸收垫上。用拇指和食指在眼睛周围，轻轻推动皮肤，使眼球凸出。

球突出后，将一把斜剪刀的尖端塞在皮肤和眼球之间，小心地剪开眼睛周围的组织，直到它被释放。然后，将分离的眼睛短暂浸入 70% 乙醇中，并将其浸入培养皿中的 PBS 中。从每只小鼠身上收集双眼后，继续进行解剖。

在解剖显微镜下，小心地去除眼睛周围的大部分结缔组织。在此步骤中，没有必要将眼睛浸没在水中。为此，请使用缝合钳将结缔组织从眼球上提起，然后用 Vannas 剪刀将其剪出。

不要切割巩膜，因为如果巩膜被切割，几乎不可能获得完整的后眼罩。清洁结缔组织后，将眼球浸入 PBS 中，并在无菌条件下切换到层流柜中工作。现在，使用镊子将眼睛转移到含有高浓度葡萄糖的温暖 DMEM 培养皿中。

20 到 30 秒后，使用抽吸更换洗涤液进行第二次洗涤。将眼球转移到 15 mL 试管中加热的 2% 分散酶 II 工作溶液中，让眼睛在 37 摄氏度下孵育 45 分钟以解离。孵育后，眼球应该是柔软的。

接下来，在装有加热生长培养基的同一容器中清洗眼睛两次。第二次洗涤后，用新鲜培养基更换生长培养基，并将眼球和培养基转移到新培养皿中以继续解剖。在解剖显微镜的帮助下，在干净的工作台上继续工作。

用镊子固定眼睛开始解剖，并使用 Vannas 剪刀在 ora serrata 周围切开。将眼球保持在溶液中，通过在 ora serrata 圆周周围扩展切口来小心地去除前角膜。完成切割后，拉出前角膜。

接下来，使用齿镊轻轻地将晶状体囊和相关的虹膜色素上皮从眼罩中拉出，将其取出。然后，对剩余的眼睛重复解剖，并将后眼罩在生长培养基中于 37 摄氏度孵育 20 分钟，以促进神经视网膜与 RPE 的分离。20 分钟后，将后眼罩切成四个花瓣。

将切口剪得足够长以使眼罩变平，但又要足够短以保持花瓣连接。接下来，将眼罩压平以去除神经视网膜。用非惯用手固定剩余的 RPE 脉络膜巩膜复合物，然后非常轻柔地从边缘拉开视网膜。

去除神经视网膜后，将四分之一的 RPE 脉络膜巩膜复合物转移到装满温热生长培养基的新无菌培养皿中。在培养皿中，用超细镊子固定四分之一的 RPE 脉络膜巩膜复合物的一个花瓣，并使用显微外科新月刀，轻轻地从下面的基底膜上剥离完整的 RPE 片。褐色的 RPE 应与深色、粘稠、蓬松的脉络膜明显区分开来。

然后，用生长培养基润湿 p200 微量移液器吸头，并使用吸头将 RPE 片转移到含有加热生长培养基的新培养皿中。现在，在加热的生长培养基中洗涤 RPE 片材 3 次。在每个洗涤步骤之后，小心收集 RPE 片材，同时避免其他组织，例如来自视网膜或脉络膜的碎屑。

最后一次洗涤后，将 RPE 片材转移到 1.5 mL 试管中，并让它们在重力作用下沉淀。然后，在层流柜中去除多余的生长培养基，并将细胞重新悬浮在新鲜制备的温热生长培养基中。现在，使用 p200 微量移液器轻轻研磨组织，不要产生气泡。

研磨 40 到 50 次，刚好足以制成单细胞悬液。要小心，因为过多的研磨可能是致命的。现在，将从两只小鼠收集的 RPE 细胞接种在 12 孔培养板孔中的一个 12 mL 聚酯膜插入

需要高细胞密度，以便 RPE 细胞保持其六边形形状和色素沉着。培养一周后，从 12 mm 聚酯膜插入物中的两只小鼠建立的小鼠原代 RPE 培养物达到 90% 至 95% 的汇合度。培养两周后，细胞 100% 汇合，并开始形成六边形色素细胞和双核细胞的马赛克。

到第 3 周，细胞的形状和色素沉着继续发生变化。然而，4 周后，部分细胞变得色素沉着过度。使用 RPE65 抗体评估原代 RPE 细胞培养物的纯度，RPE65 抗体标记类视黄醇异构水解酶，这是一种对脊椎动物视觉周期至关重要的酶。

通过用鬼笔环肽染色来证明细胞间连接和六边形细胞形状的完整性。通过分析 ZO-1 蛋白表达来观察紧密连接，这可以使用氨基染色进行可视化，并通过 western blotting 进行验证。总体而言，培养物能够增殖、保留色素沉着及其六边形形状，同时形成紧密连接并表达功能性标志物，例如 RPE65。

看完这个视频，你应该对如何从小鼠眼睛中分离 RPE 细胞并在体外正确培养它们有一个很好的了解。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三个小时内完成。在尝试此过程时，重要的是要记住始终保持眼睛湿润并尝试尽快作。