Name: 小鼠视网膜色素上皮细胞的原代培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学习小鼠视网膜色素上皮细胞的原代培养方法，掌握从眼球分离RPE细胞的解剖技术。该方案操作简便可行，有助于研究人员在体外培养中保持细胞原有特性，为视网膜生物学研究提供可靠的细胞模型。

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本研究部分由 BrightFocus 基金会资助（资助对象：DS）。

涉及动物实验的程序已获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准&#160;匹兹堡大学
1. 准备溶液
<ol>
	<li>通过在高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素/链霉素、2.5 mM L-谷氨酰胺和 1× MEM 非必需氨基酸来制备生长培养基。使用前将培养基置于 37 °C 培养箱中预热。</li>
	<li>制备 2%（wt/vol）dispase II 工作液：
	<ol>
		<li>通过将 30 mg dispase II 溶解于 300 µL HEPES 缓冲盐溶液（50 mM HEPES/KOH，pH 7.4，150 mM NaCl）中，配制 100 mg/mL dispase II 储存液。此体积适用于 3–4 只小鼠，可根据实验所需小鼠数量按比例放大或缩小。该储存液可在 4 °C 下保存至少 1 周。</li>
		<li>将 300 µL 的 100 mg/mL dispase II 储存液加入 1.2 mL 无菌高糖 DMEM 中，配制成 2% dispase 工作液，并通过 0.22 µm 滤器过滤。此步骤应在超净台内无菌条件下进行。使用前将配制好的 dispase II 置于 37 °C 培养箱中预热。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 获取小鼠眼球
<ol>
	<li>采用任何经批准的方法处死小鼠，并将其放置在吸水垫上。</li>
	<li>佩戴手套，用拇指和食指环绕眼睛周围，轻轻推动皮肤使眼球突出。</li>
	<li>将弯头剪刀的尖端插入皮肤与眼球之间，小心剪下眼球。为避免污染，将眼球短暂浸入70%乙醇中。</li>
	<li>立即将眼球放入盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。</li>
	<li>重复步骤2.2至2.4以摘除第二只眼球。</li>
</ol>
3. 眼球解剖
<ol>
	<li>在解剖显微镜下仔细去除眼球周围的结缔组织。此步骤可在 PBS 中或干燥的培养皿中进行。
	<ol>
		<li>使用缝合镊子提起眼球上的结缔组织，并用Vannas剪刀将其剪除。切勿剪破巩膜，因为一旦巩膜被剪破，几乎无法获得完整的后极部眼杯。</li>
		<li>清除结缔组织后，将处理后的眼球置于PBS中，以进行下一步洗涤。 
		注意：以下所有步骤均应在超净工作台内无菌条件下操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用预热至37 °C的DMEM（高糖）培养基洗涤眼球两次。使用镊子小心地将眼球转移至预热至37 °C的DMEM（高糖）培养基中。吸去旧培养基，将眼球转移至新培养皿中的新鲜培养基内。</li>
	<li>吸去DMEM（高糖）培养基，将眼球置于预热的2%（wt/vol）dispase II工作液中，在37 °C培养箱中孵育45分钟。 
	注意：在后续所有步骤中，应将眼球或眼杯放置并操作于生长培养基中，以保护组织并为解剖提供适宜环境。</li>
	<li>移除dispase II溶液，并用生长培养基洗涤眼球两次：吸去旧培养基，加入预热至37 °C的新鲜生长培养基（图1a）。 
	注意：经dispase II消化后，眼球会变得柔软。</li>
	<li>用镊子夹住眼球，在置于超净工作台内的解剖显微镜下，使用Vannas剪刀沿每只眼球的锯齿缘做环形切口。
	<ol>
		<li>保持眼球处于液体环境中，沿锯齿缘完整切开后，轻轻向外牵拉，将前段角膜完整去除。</li>
		<li>用齿镊轻柔地将晶状体囊及相关的虹膜色素上皮从眼杯中拉出（图1b，1c）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将获得的后极部眼杯置于生长培养基中，在37 °C孵育20分钟，以促进神经视网膜与视网膜色素上皮（RPE）的分离。</li>
	<li>在置于超净工作台内的解剖显微镜下，将后极部眼杯切成4个瓣状。切口应足够长以展平眼杯，但又不宜过长，以保持各瓣之间仍相连（图1d）。
	<ol>
		<li>展平眼杯后，用另一把镊子固定剩余的RPE-脉络膜-巩膜复合体，同时用镊子极其轻柔地从边缘开始牵拉神经视网膜，将其剥离（图1e）。应从边缘开始牵拉，避免从中心开始。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将所有四等分的组织转移至一个新的无菌培养皿中，该培养皿内已加入预热至37 °C的生长培养基。</li>
</ol>
4. 原代RPE细胞的分离
<ol>
	<li>用超细镊子夹住四分之一的视网膜色素上皮-脉络膜-巩膜复合体的一片花瓣状组织，在层流柜内的解剖显微镜下，使用显微外科半月形刀轻轻将完整的视网膜色素上皮（RPE）细胞层从其下方的基底膜（Bruch膜）上剥离下来（图1f）。
	<ol>
		<li>使用P200移液器将RPE细胞片转移至含有培养基的新无菌培养皿中。转移RPE细胞片时，需先用培养基反复吹打润湿移液器吸头数次，以防止组织黏附在吸头内部。RPE组织与脉络膜可明显区分：RPE颜色偏棕褐色，而脉络膜颜色更深，外观呈黏稠且蓬松状。</li>
		<li>或者，可采用酶消化法并结合轻柔解离，无需使用镊子即可将RPE从脉络膜上分离14。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在无菌培养皿中用预热至37 °C的培养基清洗RPE细胞片2–3次。每次清洗后，小心收集RPE细胞片，避免混入视网膜碎片或其他组织如脉络膜。最后一次清洗结束后，用P200移液器收集RPE细胞片，并转移至新的1.5 mL微量离心管中。 
	注意：无需离心RPE细胞片：它们将在1分钟内依靠重力自然沉降。</li>
	<li>用P200移液器吸除多余的培养基。将细胞重悬于新鲜预热的培养基中，并使用P200移液器轻柔吹打混匀。避免产生气泡。理想状态为单细胞悬液，但切勿过度吹打，否则RPE细胞将无法存活。建议非常轻柔地吹打40–50次。</li>
</ol>
5. 培养RPE细胞
<ol>
	<li>将细胞接种于培养板中。
	<ol>
		<li>如果下游应用需要维持RPE细胞的极性，则将来自2只小鼠的RPE细胞&#160;接种至一个预先置于12孔培养板中的12 mm聚酯膜插入式培养小室中。建议以高密度接种细胞，因为在此条件下RPE细胞能够保持其原有特性，如六边形形态和色素沉着。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养的前72小时内不要移动培养板或更换培养基。3天后，用新鲜预热的生长培养基替换旧培养基。此后每隔一天更换一次培养基。一旦RPE细胞达到汇合状态，将生长培养基中的FBS浓度降低至2%。 
	注意：可使用0.25%胰蛋白酶对细胞进行传代。然而，传代后细胞可能在后续培养中失去六边形形态和色素沉着。我们不建议对细胞进行传代，但如果下游实验确实需要，请注意原代细胞无法无限传代：已知其在5–7&#160;次传代后会发生去分化。</li>
</ol>

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</ol>

DS 已获得德国拜耳医药保健公司和瑞士罗氏公司的研究资助。其余作者声明不存在竞争性经济利益。&#160;本研究由“预防失明研究”组织提供支持（向威尔默眼科研究所和匹兹堡大学提供的无限制拨款）。&#160; 本研究还获得了匹兹堡大学眼科为 DS 提供的启动资金支持。

本详细方案可稳定建立小鼠原代RPE细胞培养体系，细胞在培养1周后达到汇合状态，并在2周后表现出RPE细胞的主要特征，如六边形形态和色素沉着。所获得的RPE细胞可用于多种后续实验应用，包括维生素A代谢9、光感受器外节段的吞噬作用10、离子转运11、上皮细胞极性2、溶酶体稳态以及自噬12,13。根据不同的下游应用需求，可通过透射和扫描电子显微镜对所获得的细胞培养物形态进行验证，具体方法已在其他文献中详细描述14。为进一步证明培养细胞的成熟状态，还可进行跨上皮电阻（TEER）检测以评估RPE细胞的极性，以及通透性实验4,22、功能检测（如吞噬作用<sup class="xre...

视网膜色素上皮（RPE）是位于神经视网膜与脉络膜之间的一层极性上皮细胞。RPE细胞的功能及其单层结构的完整性对视觉至关重要，因为RPE在多种生理过程中发挥重要作用，包括维持外层血-视网膜屏障、介导视网膜与脉络膜之间的水和离子转运、光吸收、抵御氧化应激、调控视黄醇代谢以及吞噬光感受器外节段1,2。由于RPE位于眼球后部，且其屏障功能可阻止经全身给药的药物从血液进入玻璃体，因此在体内（in vivo）研究RPE功能的复杂性十分困难。因此，建立RPE细胞培养体系以在灵活且可控的环境中研究RPE细胞具有重要意义3,4。
目前已建立多种成熟的RPE细胞系，为细胞的获取和保存提供了简便途径；然而，与原代细胞相比，传代细胞存在一些缺点2,3,4。首先，这些细胞常表现出细胞形态的改变。例如，由于细胞极性表型的丧失以及紧密连接的部分消失，现有细胞系均不适合用于RPE屏障特性的可靠研究4。除了极性的丧失和细胞间连接的异常外，RPE细胞系还会因成年RPE中关键黑色素生成酶的缺失而迅速失去色素沉着5。虽然色素沉着可以恢复，但迄今尚未开展对复色素化机制的全面分析，此类分析应结合透射电子显微镜、基因表达分析和化学检测以确认黑色素的存在6。另一个局限性在于，RPE细胞系具有延长的细胞寿命（有时为永生化），在特定条件下可转化为自我更新的多能干细胞，这些细胞会从基质上脱落并形成悬浮集落7,8。这一局限性使得这些细胞系无法用于移植实验3。
鉴于已建立的RPE细胞系存在诸多缺点，从新鲜组织获取的原代RPE细胞培养物可能是研究RPE更为生物学相关的模型。原代RPE细胞不仅已被用于研究RPE特异性功能，如维生素A代谢9、光感受器外节的吞噬作用10以及离子转运11，还被用于研究上皮细胞极性2、溶酶体稳态和自噬12,13等基础细胞生物学过程。
近年来，已有多篇关于建立原代RPE细胞培养的文献发表，表明该研究领域日益受到关注3,14,15。已有大量针对人RPE细胞以及非人RPE细胞（如牛和猪RPE细胞）的实验方案被报道16,17,18,19。然而，由于小鼠RPE细胞体积更小，其操作难度相对更高。尽管已有不少文献描述了从小鼠眼组织中分离RPE细胞的方法14,20,21，但仍有许多研究人员在分离过程中难以避免脉络膜细胞或神经视网膜碎片的污染。本文提供了建立原代小鼠RPE细胞培养的完整实验方案，包括从小鼠获取眼球、眼球解剖以及分离RPE细胞层以获得可用于培养的细胞。本视频方案特别适用于刚开始从事小鼠原代RPE细胞培养的研究人员，为其提供解剖技术方面的指导。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;动物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2~3周龄野生型小鼠</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），高糖</td><td>GIBCO</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液（100X）</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），1X，pH 7.4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro</td><td>61-034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Ambion</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>RPE65抗体</td><td>由Michael Redmond博士惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光素鬼笔环肽&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>F432</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（H+L），Alexa Fluor 568&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11011&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00380</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1多克隆抗体</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器与设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>层流柜</td><td>Baker</td><td>SterilGARD SG403A</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜（变倍体视显微镜）</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>带热空气灭菌功能的CO2培养箱</td><td>Binder</td><td>C150</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>12 mm聚酯膜细胞培养小室，预装于12孔板中，孔径：0.4 &amp;micro;m，无菌</td><td>Corning Incorporated</td><td>COR-3460</td><td></td></tr><tr><td>Westcott肌腱剪，标准刀片，尖头</td><td>STEPHENS instruments</td><td>S7-1320</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo缝合镊，0.12 mm</td><td>Stroz Ophthalmic Instruments</td><td>E1796</td><td></td></tr><tr><td>弯月形直刀</td><td>Beaver-Visitec International</td><td>373808</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5镊子，11 cm，直头，尖端尺寸0.1×0.06 mm，Dumostar</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>Vannas剪刀，8 cm，45&amp;deg;角，标准型</td><td>World Precision Instruments</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS针头式滤器，0.22 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>SLGL0250S</td><td></td></tr><tr><td>注射器，5 mL</td><td>BD</td><td>309632</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜&amp;nbsp;Leica DM IL LED</td><td>&amp;nbsp;Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带滤芯和无滤芯移液器吸头</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠视网膜色素上皮原代细胞培养

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

视网膜色素上皮（RPE）是一种高度极化的多功能上皮组织，位于眼球的神经视网膜与脉络膜之间。它由一层单层的色素细胞构成，细胞呈六边形紧密排列，并通过紧密连接相互连接。RPE的主要功能包括光吸收、吞噬脱落的光感受器外节段、离子的空间缓冲、营养物质、离子和水的转运，以及积极参与视觉循环。由于其功能重要且多样，研究RPE细胞的生物学特性至关重要。目前已建立多种RPE细胞系；然而，传代和永生化细胞已知会迅速丧失天然RPE细胞的部分形态和生理特征。因此，原代细胞更适合用于研究RPE细胞生物学和功能的各个方面。小鼠原代RPE细胞培养对研究人员非常有用，因为小鼠模型在生物学研究中被广泛使用，但由于小鼠眼球体积小，从中获取RPE细胞也极具挑战性。本文介绍一种建立小鼠原代RPE细胞培养的实验方案，包括眼球摘除、解剖分离以及RPE细胞层的提取，以获得可用于培养的细胞。该方法可实现高效的细胞回收。来自两只小鼠&#160;的RPE细胞在培养一周后即可在培养板中预装的12 mm聚酯膜插入物上达到汇合状态，并在培养两周后表现出某些真实RPE细胞的原有特性，如六边形形态和色素沉着。

由2只小鼠的RPE组织建立的原代培养物，在12 mm聚酯膜插入式培养皿中培养1周后，细胞融合度可达90 - 95%。培养2周后，细胞达到100%融合，并开始形成由六边形、含色素且双核的细胞组成的镶嵌状结构。培养至3周时，细胞继续维持该形态和色素沉积特征，但在培养4周后，部分细胞出现过度色素化（图2）。
可通过使用RPE65抗体（视黄醇异构水解酶，一种在脊椎动物视觉循环中起关键作用的酶，可在光转导过程中将全反式视黄酯转化为11-顺式视黄醇）进行免疫染色来评估原代RPE细胞培养的纯度（图3，红色）。通过鬼笔环肽染色可显示细胞间连接的完整性以及六边形形态的存在（图3，绿色）。此外，可利用Western blotting（图4</strong...

视网膜色素上皮（RPE）是眼部一种具有多种功能的上皮组织。本文介绍一种从小鼠RPE中建立原代细胞培养的实验方案。

视网膜色素上皮（RPE）是一种高度极化的多功能上皮，位于神经视网膜与脉络膜之间。

本实验的总体目标是展示一种从鼠眼获取视网膜色素上皮细胞的可行方法，并在体外培养这些细胞的同时保持其原有特性。该方法将帮助RPE研究人员掌握建立小鼠RPE细胞培养所必需的解剖技能，并演示如何以简便的方式完成这一过程。该方法的主要优势在于其简单性和可行性。唯一需要的是练习，而视网膜色素上皮（RPE）分离操作的可视化演示则直观地展示了如何获得所需技能。为分离小鼠眼球，首先采用任一经批准的方法处死两只小鼠，并戴上手套将其置于吸水垫上。用拇指和食指固定眼睛周围，轻轻推动皮肤使眼球向外突出。当眼球突出后，将一对弯头剪刀的尖端插入皮肤与眼球之间，小心剪开眼周组织，直至眼球完全分离。随后，将分离的眼球短暂浸入70%乙醇中，再放入培养皿的PBS溶液中。待每只小鼠的双眼均收集完毕后，继续进行解剖操作。在解剖显微镜下，仔细去除眼球周围大部分的结缔组织。此步骤无需将眼球保持在液体中。操作时，使用缝合镊轻轻提起眼球表面的结缔组织，再用Vannas剪刀将其剪除。不要切割巩膜，因为一旦巩膜被切开，几乎无法获得完整的后部眼杯。清除结缔组织后，将眼球浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中，并转移至超净工作台内，在无菌条件下进行操作。接着，使用镊子将眼球转移至含有高浓度葡萄糖的温热DMEM培养基的培养皿中。孵育20至30秒后，通过抽吸更换洗涤液，进行第二次洗涤。将眼球转移至含有预热的2% Dispase II工作液的15 mL离心管中，于37摄氏度孵育45分钟以实现组织解离。孵育结束后，眼球应变得柔软。接下来，用预热的生长培养基在同一容器中清洗眼睛两次。第二次清洗后，更换为新鲜培养基，并将眼球及培养基转移至新的培养皿中以继续解剖操作。在超净工作台中，借助解剖显微镜继续操作。用镊子固定眼球，使用Vannas剪刀在锯齿缘周围做切口，开始解剖。保持眼球处于溶液中，沿锯齿缘周长延伸切口，小心移除前部角膜。完成切口后，取下前部角膜。接下来，使用有齿镊子轻轻将晶状体囊及其相关的虹膜色素上皮从眼球杯中拉出并移除。然后，对剩余的眼球重复解剖操作，并将后部眼球杯置于培养基中，在37摄氏度下孵育20分钟，以促进神经视网膜与视网膜色素上皮（RPE）的分离。20分钟后，将后部眼球杯切成四个瓣状。切口需足够长以展平眼杯，但又不能过长，需保持花瓣状结构相互连接。接着，将眼杯展平以去除神经视网膜。用非惯用手固定剩余的视网膜色素上皮层、脉络膜和巩膜复合物，并从边缘非常轻柔地牵拉移除视网膜。去除神经视网膜后，将四等分的视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜-巩膜复合体转移至一个新的无菌培养皿中，培养皿内盛有温热的生长培养基。在培养皿中，用超细镊子固定四等分RPE-脉络膜-巩膜复合体的一瓣，然后使用显微外科半月刀，从下方的基底膜上轻轻剥离完整的RPE细胞层。棕褐色的RPE应与深色、黏稠且呈绒毛状的脉络膜明显区分开来。然后，用培养基润湿一支p200移液枪头，用该枪头将RPE细胞片转移至含有预温培养基的新培养皿中。接着，用预温的培养基清洗RPE细胞片三次。每次清洗步骤后，小心收集RPE细胞片，避免混入其他组织，例如视网膜或脉络膜的碎片。最后一次洗涤后，将RPE细胞片转移至1.5 mL离心管中，静置使其自然沉降。随后，在超净工作台内吸去多余的培养基，并用新配制的预温培养基重悬细胞。接着，使用200 µL移液枪轻柔吹打组织，避免产生气泡。吹打40至50次，直至形成单细胞悬液即可。注意吹打过度可能造成细胞死亡。现在，将从两只小鼠收集的视网膜色素上皮（RPE）细胞接种至一个12孔培养板的孔中，每孔使用一个12 mL聚酯膜插入式培养插件。需要高细胞密度，以使视网膜色素上皮（RPE）细胞保持其六边形形态和色素沉着。利用两只小鼠的组织在12 mm聚酯膜插入式培养皿中建立的小鼠原代RPE细胞培养，培养一周后达到90%至95%的融合度。培养两周后，细胞达到100%融合，并开始形成由色素化的六边形双核细胞组成的镶嵌状结构。到第三周时，细胞的形态和色素继续发生变化。然而，四周后部分细胞出现色素过度沉着。通过RPE65抗体对原代RPE细胞培养物的纯度进行评估，该抗体可标记视黄醇异构水解酶（retinoid isomerohydrolase），这是一种在脊椎动物视觉循环中起关键作用的酶。通过鬼笔环肽染色可证明细胞间连接的完整性和六边形细胞形态。紧密连接通过分析ZO-1蛋白的表达来观察，该蛋白可使用氨基染色法显示，并通过Western印迹法验证。总体而言，这些培养的细胞能够增殖，保持色素沉着和六边形形态，同时形成紧密连接并表达功能性标志物（如RPE65）。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从小鼠眼球中分离视网膜色素上皮（RPE）细胞，并在体外对其进行适当的培养。一旦熟练掌握，若操作得当，该技术可在三小时内完成。在进行该实验过程中，务必始终注意保持眼球湿润，并尽可能快速地进行操作。

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科研

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生物学

小鼠视网膜色素上皮细胞的原代培养

我们提供一种可重复的方法，用于培养人胎儿视网膜色素上皮细胞（hfRPE），使其形成融合的单层细胞，具有成年天然组织的形态学、生理学、极性以及蛋白质和基因表达特征。该研究已拓展至多种眼病的动物模型。...

研究视网膜色素上皮生理学与病理生理学的实验模型

在本视频中，我们将演示如何从小鼠眼球的睫状上皮中分离视网膜干细胞，并在体外培养以形成克隆性视网膜球体。所获得的球状细胞集落具有干细胞的核心特性：自我更新能力与多向分化潜能。...

从小鼠眼球中分离视网膜干细胞

将一只8天大的小鼠的神经视网膜置于4%明胶块上。通过振动切片机分离出200...

使用振动切片机切分小鼠视网膜以制备感光细胞培养物

该方案描述了小鼠器官型外植体的制备方法 神经视网膜，与视网膜色素上皮（RPE）共同培养于R16定义培养基中，该培养基不含血清和抗生素。与传统方法相比，该方法操作相对简便、成本较低且耗时较少。 体内...

长期无血清培养具有完整视网膜色素上皮的小鼠视网膜组织外植体

本方案最初由 Fernandez-Godino 等人于 2016 年报道1，描述了一种高效分离和培养小鼠 RPE 细胞的方法，这些细胞在 Transwell 培养板上一周内即可形成具有功能性和极性的 RPE 单层。该操作过程约需 3...

高效分离与原代培养小鼠视网膜色素上皮细胞

本文描述了一种从小鼠眼球中逐步分离视网膜色素上皮（RPE）细胞的简化方案。该方案包括小鼠眼球的摘除与解剖，随后进行RPE细胞的分离、接种与培养。...

原代小鼠视网膜色素上皮细胞的分离

一种易于操作的原代猪视网膜色素上皮细胞培养方法 体外 被展示。...

猪视网膜色素上皮细胞的原代培养

我们介绍一种从年轻有色豚鼠眼球中分离视网膜色素上皮（RPE）细胞的简单高效方法。该方法可用于对分离的RPE细胞进行后续分子生物学研究，包括基因表达分析。...

从豚鼠眼睛中分离视网膜色素上皮细胞

本方案概述了从本地获取的猪眼分离和培养原代视网膜色素上皮（RPE）细胞的步骤。这些细胞可作为干细胞的高质量替代物，适用于 体外...

分离原代猪视网膜色素上皮细胞用于 体外 建模

本文描述了一种从小鼠眼球中分离视网膜胶质穆勒细胞的详细实验方案。该方案从小鼠眼球的摘除和解剖开始，随后进行穆勒细胞的分离、接种和培养。...

原代小鼠视网膜胶质穆勒细胞的分离

视网膜色素上皮（RPE）在脉络膜和视网膜之间起着至关重要的屏障作用，有助于维持视网膜细胞类型（如光感受器细胞）的健康与功能。本文中，我们描述了一种简单且有效的成年小鼠RPE分离与培养方案。...

一种简化的小鼠成年视网膜色素上皮细胞分离与培养方法

学习小鼠视网膜色素上皮细胞的原代培养方法，掌握从眼球分离RPE细胞的解剖技术。该方案操作简便可行，有助于研究人员在体外培养中保持细胞原有特性，为视网膜生物学研究提供可靠的细胞模型。

小鼠视网膜色素上皮原代细胞培养

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