甲醛辅助分离测定哺乳动物细胞染色质可及性的调控元素

本实验的总体目标是通过将 DNA 与相关蛋白质共价交联，然后纯化和定量游离 DNA 来确定遗传位点的染色质可及性。这种方法可以帮助回答染色质领域中的关键问题，因为可以确定 DNA 可及性，无论未处理细胞中的细胞类型如何，以及正在进行染色质重塑的细胞。该技术的主要优点是它不需要使用酶来切割 DNA 或抗体，而这些 DNA 或抗体需要针对每个实验设置进行滴定。

该协议还有一个额外的优点，即它不需要除 Sonicator 以外的任何特殊设备。演示该程序的是 Olesja Ritter 和 Tabea Riedlinger，他们是我实验室的博士生。要开始该方案，请将甲醛直接添加到前一天接种的细胞的生长培养基中，以达到 1% 体积的最终浓度。

在室温下孵育培养基 10 分钟，然后每 2 分钟手动旋转板。接下来，加入甘氨酸至终浓度为 0.125 摩尔以淬灭甲醛。在室温下孵育溶液 5 分钟，然后每 2 分钟旋转一次。

吸出培养基，然后小心地将冰冷的 PBS 添加到培养皿的侧面以洗涤细胞。吸出培养基并小心地重复洗涤两次。第三次洗涤后，将细胞重新悬浮在一毫升冰冷的 PBS 中，必要时使用细胞刮刀分离细胞。

将它们转移到冰上的 1.5 毫升反应管中。在冷却的台式离心机中以 300 g 和 4 摄氏度离心细胞 5 分钟。小心吸出并丢弃上清液。

小心地上下吹打数次，将细胞沉淀重悬于 1 mL FAIRE 裂解缓冲液中。将细胞在冰上孵育 20 分钟。孵育后，对交联 DNA 进行超声处理，使其共享为 200 至 300 个碱基对的平均大小，并在超声处理过程中冷却样品，以避免加热样品。

DNA 的片段化对于本实验至关重要，因为片段的大小会影响整个技术溶液的灵敏度，因此事先仔细建立超声处理条件并在每个实验中检查染色质片段的大小非常重要。将样品离心 15 分钟，然后在 4 摄氏度下离心 13， 000 g。然后，将上清液转移到新的反应管中。

将样品分成 100 微升等分试样。使用 100 μL 等分试样逆转交联，并用作总 DNA 的参考。加入 10 μL RNase A，并将样品在 37 摄氏度下孵育 1 小时。

接下来，加入 10 微升蛋白酶 K.使用可编程加热块将样品在 37 摄氏度下孵育 4 小时，然后在 65 摄氏度下孵育 6 小时，以切割蛋白质并逆转交联。获得新的 100 μL 等分试样，加入 10 μL RNase A，并在 37 °C 下孵育样品 1 小时。孵育后，平行处理上一节中的非去交联样品和去交联样品。

添加 H 2 O 以达到 300 微升的最终体积。然后，在通风橱中加入 300 微升苯酚氯仿异戊醇并剧烈涡旋。将样品在 13， 000 g 和 4 摄氏度下离心 10 分钟。

接下来，小心地将 280 μL 的上层水相转移到新的反应管中。确保不要从中间相中取出任何碎片，其中也含有蛋白质，并将剩余的下层固定相作为有机溶剂废液丢弃。重复处理并小心地将 270 μL 的上层水相转移到新的反应管中。

在通风橱中加入 270 微升氯仿并剧烈涡旋。离心样品。离心后，小心地将 250 μL 的上层水相转移到新的反应管中，注意不要携带任何来自界面的碎屑。

将剩余的样品作为有机溶剂废液丢弃。然后，加入 25 微升 5 摩尔氯化钠、250 微升异丙醇，并加入 5 微升糖原作为 DNA 载体。倒置试管并在室温下孵育。

孵育后，离心样品以沉淀 DNA。接下来，用 400 μL 70% 体积的乙醇洗涤 DNA 沉淀，并离心样品。小心吸出上清液，让沉淀在室温下干燥 10 分钟。

沉淀干燥后，将其重新悬浮在 100 微升 TE 缓冲液中。将未去交联的游离 DNA 样品在 65 摄氏度下孵育 4 小时，以去除 DNA 间交联。最后，使用分光光度计定量 DNA 的量，并运行小等分试样以检查 2% 重量比琼脂糖凝胶上的片段大小。

用 TNF 刺激 HeLA 细胞 1 小时，并通过 FAIRE 进行分析。确定了 ACTB 启动子、编码 β-肌动蛋白和阳性对照的基因、12 号染色体上的异染色质区域、阴性对照和 IL8 启动子的游离 DNA 与总 DNA 之间的比率。生成具有不同超声处理时间的溴化乙锭染色凝胶，表明超声处理 20 分钟后获得 200 至 300 个碱基对的最佳染色质大小。

一旦掌握，这项技术可以在两天内完成。按照此程序，可以执行其他方法，例如深度测序，以确定全基因组水平的染色质可及性。不要忘记，使用甲醛和苯酚氯仿可能非常危险，执行此程序应确保采取预防措施，例如在通风橱中工作、戴手套和适当处理废物。