Name: 甲醛辅助分离测定哺乳动物细胞染色质可及性的调控元素 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学习使用甲醛辅助分离调控元件（FAIRE）方法测定哺乳动物细胞染色质可及性。该技术无需特殊设备，通过甲醛交联、超声破碎和酚氯仿抽提分离游离DNA，适用于HeLa细胞等样本的基因调控研究。

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作者谨此感谢吉森大学的 Tilman Borggrefe 慷慨提供超声破碎仪。M.L.S. 的工作得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，项目号 SCHM 1417/8-3）、SFB/TRR81、SFB1021、SFB1213、卓越集群心血管-肺系统（ECCPS，EXC 147/2）、德国癌症援助基金会（Deutsche Krebshilfe，项目号 111447）以及马克斯·普朗克学会 IMPRS-HLR 项目的支持。

1. 第1天：细胞培养
<ol>
	<li>将待分析的细胞培养至所需数量。细胞培养条件和培养基取决于所研究的细胞类型。 
	注意：原则上，任何真核细胞均可采用FAIRE方法进行染色质可及性分析。本实验中，在含10%（v/v）胎牛血清和1%（w/v）青霉素/链霉素的DMEM培养基中，于10 cm培养皿中接种4 × 106个HEK-293T细胞，在5% CO2、37 °C条件下培养24小时，直至细胞融合度达到70–80%（约每皿8 × 106个细胞）。</li>
</ol>
2. 第2天：甲醛交联与细胞收集
警告：甲醛具有高毒性，必须始终在通风橱中使用。穿戴防护服（手套和实验服）。妥善处理废弃物。
<ol>
	<li>在通风橱中，将甲醛直接加入细胞培养基中，使其终浓度为1%（v/v）（向10 mL细胞培养基中加入270 µL的37%（v/v）甲醛）。在室温（20 - 25 °C）孵育10分钟，每2分钟手动轻摇培养板一次。 
	注意：交联时间可根据细胞类型进行调整。大多数细胞系交联10分钟已足够。对于组织样本，可能需要更长的孵育时间，以确保所有细胞均被固定。</li>
	<li>加入甘氨酸至终浓度0.125 M以淬灭甲醛（向10 mL培养基中加入500 µL的2.5 M甘氨酸储备液）。在室温下孵育5分钟，每2分钟轻摇一次。</li>
	<li>用预冷的PBS（8 g/L NaCl，0.2 g/L KCl，1.44 g/L Na2HPO4 · 2H2O，0.24 g/L KH2PO4，用HCl或NaOH调节pH至7.4）洗涤细胞3次。吸去培养基后，在细胞培养皿或培养瓶中直接加入10 mL PBS进行洗涤。重复此步骤两次，对于贴壁较松的细胞（如HEK-293T细胞）需格外小心。应将PBS沿皿壁缓慢加入，避免细胞脱落。</li>
	<li>第三次洗涤后，将细胞重悬于1 mL预冷的PBS中，并转移至冰上的1.5 mL离心管中。必要时使用细胞刮刀刮下细胞。 
	注意：当起始材料有限时，建议使用低DNA结合力的离心管，以避免样品在操作过程中损失。</li>
	<li>在4 °C下，使用预冷的台式离心机以300 × g离心5分钟。小心吸去上清液。</li>
</ol>
3. 细胞裂解与染色质片段化
<ol>
	<li>用 1 mL FAIRE 裂解缓冲液（1% (w/v) SDS，10 mM EDTA，50 mM Tris HCl pH 8.1，10 µg/mL 亮抑蛋白酶肽，10 µg/mL 抑肽酶，2 mM PMSF）重悬细胞沉淀，通过轻柔吹打数次使细胞充分重悬。冰上孵育 20 分钟。如需暂停，可将样品在此步骤储存于 -80 °C。</li>
	<li>对交联的 DNA 进行超声处理，使其剪切至平均长度为 200 - 300 bp。超声仪的具体参数需根据样品来源及所用超声设备进行优化。务必确保 DNA 被有效剪切。DNA 剪切的优化步骤详见第 5.14 步。超声过程中应将样品置于冰上冷却，避免过热。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 13,000 × g 离心 15 分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的反应管中，分装为每份 100 µL。如需暂停，可将样品储存于 -80 °C。 
	注意：本方案可在该步骤中断。</li>
</ol>
4. 对照 DNA 的去交联
<ol>
	<li>从步骤 3.4 中取 100 µL 等分试样，用于逆转交联并作为总 DNA 的参照。加入 10 µL RNase-A（10 mg/mL），在 37 °C 下孵育 1 小时。</li>
	<li>加入 10 µL 蛋白酶 K（20 mg/mL）。使用可编程温控模块，在 37 °C 下孵育 4 小时，随后在 65 °C 下孵育 6 小时，以切割蛋白质并逆转交联。最后，将样品置于 4 °C 保存，待继续执行本方案时进入步骤 5。 
	注意：其他 FAIRE 方案使用未交联细胞的染色质样品作为参照，从而无需进行去交联11。由于这些样品未交联，可能导致超声处理效率或 DNA 稳定性存在差异，因此使用与测试样品经历相同处理过程的总 DNA 参照样品更为准确。</li>
</ol>
5. 第3天：DNA的苯酚:氯仿纯化
<ol>
	<li>取第 3.4 步中未去交联的等分试样，加入 10 µL RNase-A（10 mg/mL），在 37 °C 下孵育 1 小时。</li>
	<li>取第 5.1 步中未去交联的等分试样和第 4.2 步中去交联的样品，平行操作。加入 H2O 使最终体积达到 300 µL。</li>
	<li>在通风橱中加入 300 µL 苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），剧烈涡旋振荡。 
	注意：苯酚具有腐蚀性和毒性，必须始终在通风橱中操作。穿戴防护服（手套和实验服），确保反应管盖紧，妥善处理废弃物。</li>
	<li>在 4 °C 下以 13,000 x g 离心 10 分钟。</li>
	<li>小心将上层水相 280 µL 转移至新的反应管中。注意避免吸取中间相中的任何碎片（其中含有蛋白质）。将剩余的下层有机相作为有机溶剂废物丢弃。</li>
	<li>重复步骤 5.3 至 5.5，小心将 270 µL 上层水相转移至新的反应管中。</li>
	<li>在通风橱中加入 270 µL 氯仿，剧烈涡旋振荡。 
	备注：此步骤用于去除样品中残留的苯酚。</li>
	<li>在 4 °C 下以 13,000 x g 离心 10 分钟。</li>
	<li>小心将 250 µL 上层水相转移至新的反应管中，注意避免带入中间相中的任何碎片。将剩余样品作为有机溶剂废物丢弃。</li>
	<li>加入 25 µL 5 M NaCl 和 250 µL 异丙醇。加入 5 µL 甘油原（20 mg/mL）作为 DNA 载体。通过反复倒置混匀，室温孵育 20 分钟。在 4 °C 下以 13,000 x g 离心 10 分钟以沉淀 DNA。</li>
	<li>用 400 µL 70%（v/v）乙醇洗涤 DNA 沉淀。在 4 °C 下以 13,000 x g 离心 10 分钟。</li>
	<li>小心吸去上清液，将沉淀在室温下干燥 10 分钟。用 100 µL TE 缓冲液（10 mM Tris pH 8，1 mM EDTA）重悬。</li>
	<li>将未去交联的游离 DNA 样品在 65 °C 下孵育 4 小时，以去除 DNA 间的交联。将样品储存于 -20 °C。</li>
	<li>使用分光光度计测定 DNA 含量，并取部分样品在 2%（w/v）琼脂糖凝胶上检测片段大小。根据琼脂糖凝胶电泳的 DNA 大小分析结果，调整剪切时间和强度，以获得平均大小为 200–300 bp 的 DNA 片段。</li>
</ol>
6. 通过定量实时 PCR（qRT-PCR）测定游离 DNA 与总 DNA
<ol>
	<li>通过qRT-PCR测定无核小体DNA（以下简称游离DNA）与总DNA的比值17,18。也可通过微阵列杂交或深度测序对样本进行定量分析，以实现全基因组范围的检测。</li>
	<li>为待检测区域以及阳性和阴性对照设计qPCR引物。 
	注：合适的阳性对照为位于活跃转录管家基因（如ACTB、GAPDH、TPI1或TUBA1A，分别编码β-Actin、GAPDH、TPI或α-Tubulin）启动子区的引物。合适的阴性对照位于异染色质区域或基因沙漠区域。也可在所研究的动态调控位点邻近的基因组区域设计其他合适的阴性对照，以校正局部拷贝数差异（Table 1）。</li>
	<li>用TE缓冲液将DNA样本稀释至终浓度为10 ng/µL，并在最终计算中考虑稀释倍数（见步骤6.5）。</li>
	<li>在96孔板中设置三复孔的qPCR反应，每孔反应体系如下：模板DNA：20 ng（2 µL），正向引物200 nM（0.4 µL的5 µM储备液），反向引物200 nM（0.4 µL的5 µM储备液），含绿色染料的商用预混反应液（来自2x储备液的5 µL），H2O补足至10 µL。</li>
	<li>在实时qPCR仪中运行反应，使用绝对定量模式，测定各样本在不同引物组合下的Ct值。根据以下公式计算每个引物对应的游离DNA与总DNA的回收率比值，并计入步骤6.3中的稀释倍数： 
	<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/57272/57272eq1.jpg" /> 
	代表性结果及示例计算见Table 2。</li>
	<li>为校正样本间的差异，以阳性对照的回收率比值进行归一化处理： 
	<img alt="公式 2" src="/files/ftp_upload/57272/57272eq2.jpg" /></li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

FAIRE 是一种稳健且经济的方法，可用于鉴定无核小体区域。该方法基于以下原理：缠绕在核小体上的 DNA 能够轻易与组蛋白发生交联。通过苯酚:氯仿抽提，可将未交联且无蛋白质结合的 DNA 片段与蛋白质结合的 DNA 分离开来，后者主要存在于下层的苯酚相中，部分位于中间相（图1）。因此，在水相的游离 DNA 组分中，无核小体区域的 DNA 会显著富集。已有大量文献描述了 FAIRE 方法的详细实验方案23,24,25,26，可供参考以补充本文所述的操作流程。
与其他用于确定染色质结构的方法类似，FAIRE 方法也高度依赖于 DNA 的最佳片段化。如果片段过长，任何无核小体的区域都可能被相邻的染色质结合 DNA 所掩盖；如果片段过小，则通过 qPCR 或深度测序进行检测将变得非常困难。因此，DNA 的超声处理是一个关键参数，必须加以控制和优化，以获得约 200 - 300 bp 长度的片段，对应于 1 - 2 个核小体（图 4）。
另一个可能影响最终结果的参数是样品的交联。尽管此处描述的固定方法适用于大多数细胞系，但研究人员必须针对所研究的特定样品仔细评估此步骤，尤其是在使用组织时，可能需要更长的固定时间，以使甲醛渗透到组织样品中的所有细胞。
与其他方法（如DNase I或微球菌核酸酶敏感性实验、ChIP或ATAC）不同，FAIRE不依赖酶活性或特异性抗体，因此无需对反应条件进行滴定或优化。这使得FAIRE成为染色质研究经验较少的实验室测量染色质可及性的理想方法。此外，仅需进行预实验以优化DNA片段化步骤以及在必要时优化交联时间。
该方法最初在酵母中开发6，但现已扩展至哺乳动物细胞。通过FAIRE方法纯化的DNA可用于深度测序，从而实现对染色质状态的全基因组范围表征。这一技术已在多项研究中被证明具有重要价值8,9,10,11,12,13,19,27,28。
FAIRE-seq 实验结果与其他方法（如 DNase I-seq14）获得的结果显示出较大的重叠，尽管也存在一些差异。这源于方法学上的不同，例如，松弛或重塑的核小体可能仍会阻碍 DNase I 的切割，而这些 DNA 区域在 FAIRE 中由于较不易形成 DNA/蛋白质交联，因而会被判定为无核小体区域9。此外，非组蛋白（如 RNA 聚合酶或识别表观遗传修饰的“reader”蛋白）的存在也可能导致 DNA/蛋白质交联，从而在 FAIRE 实验中被解释为蛋白质富集区域。这些局限性是所有用于染色质状态分析方法所固有的，因此有必要结合多种不同方法，以获得更全面的认识。

真核细胞的基因组DNA被紧密地包装成核小体结构，而其他蛋白质若要与DNA相互作用，则必须先移除或重塑这些结构。基因的转录激活通常会导致其核小体结构变得更加开放，尤其是在+1核小体1区域，以促进RNA聚合酶的转录过程。此外，启动子和增强子等调控区域也会发生染色质可及性的动态变化，以便与染色质修饰因子或转录因子相互作用2。目前已开发出多种方法用于鉴定这些无核小体区域。其中包括利用DNase I3或微球菌核酸酶（micrococcal nuclease）4对核小体未紧密包裹的DNA区域的敏感性。其他用于识别开放染色质或游离DNA的方法还包括转座酶介导的逆转座元件整合（转座酶可及性染色质检测，Assay for Transposase-Accessible Chromatin, ATAC）5，或使用组蛋白抗体进行的染色质免疫沉淀（ChIP）。FAIRE方法并不依赖于酶对DNA的可及性或抗体对特定蛋白的结合能力，而是通过苯酚:氯仿抽提来纯化无核小体的DNA区域6,7。在该方法中，DNA首先通过交联剂甲醛与染色质蛋白共价结合，随后通过超声处理将其打断为小片段。紧密包装的染色质区域含有大量DNA/蛋白交联产物，而缺乏或仅有少量核小体的DNA区域则几乎不形成交联的DNA/蛋白复合物。通过苯酚:氯仿抽提，未交联的游离DNA保留在水相中得以纯化，而与蛋白质交联的DNA则与蛋白质一起被保留在有机苯酚相或水-有机两相界面。将该游离DNA的含量与总DNA样本的参考值进行比较，即可鉴定出染色质开放区域。FAIRE方法可用于对单个基因组区域进行表征（如本文所述），也可与深度测序联用，用于全基因组范围内染色质可及性的鉴定，已在多种模型中得到应用8,9,10,11,12,13。FAIRE-seq与其他方法（如ATAC-seq）所得结果具有高度重叠性14。FAIRE方法是一种非常稳健、成本低廉且操作简便的无核小体区域鉴定技术。与其他方法不同，它无需进行预实验来确定核酸酶（如DNase-seq、MNase-seq）或转座酶（如ATAC-seq）所需的合适消化程度，这一点已在近期综述中有详细讨论15。该方法仅需优化的参数是超声处理条件，在某些情况下还需调整交联时间。本文描述了一种简明的实验流程，其示意图见图1，除超声仪外无需任何特殊设备。该流程可在较短时间内完成，使得FAIRE成为检测多种不同类型细胞中染色质可及性的简便且可靠的方法，适用细胞类型范围广泛，包括肺细胞11以及从小鼠肝脏中分离的原代细胞16。

<table><tbody><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇 25:24:1</td><td>Carl Roth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>糖原，20 mg/ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>ABsolute QPCR Mix，SYBR-Green，Rox</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB1162B</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K，20 mg/ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>RNase A，10 mg/ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽（Leupeptin）</td><td>Sigma</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶（Aprotinin）</td><td>Sigma</td><td>A1603</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>milliTUBE 1 ml AFA 纤维管</td><td>Covaris</td><td>520130</td><td></td></tr><tr><td>1 ml milliTUBE 支架</td><td>Covaris</td><td>500371</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 聚焦式超声破碎仪</td><td>Covaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Applied Biosistems</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

甲醛交联辅助的调控元件分离法用于检测哺乳动物细胞中的染色质可及性

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

响应胞外信号的适当基因表达，即组织和谱系特异性基因转录，高度依赖于明确定义的染色质组织状态。细胞核的动态结构受多种机制调控，并决定转录输出程序。因此，以可靠的方式确定位点特异性染色质可及性至关重要，理想情况下应不依赖抗体，因为抗体可能成为实验变异性的潜在干扰因素。染色质可及性可通过多种方法测定，包括甲醛辅助调控元件分离法（Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements, FAIRE）检测，该方法可在相对较少数量的细胞中测定总体染色质可及性。本文描述了一种FAIRE实验方案，可简单、可靠且快速地鉴定蛋白质占据率较低的基因组区域。在该方法中，使用甲醛作为交联剂将DNA共价结合至染色质蛋白，并将染色质剪切为小片段。随后通过苯酚:氯仿抽提富集游离DNA。通过定量聚合酶链式反应（qPCR）或DNA测序（DNA-seq）将游离DNA的比例与代表总DNA的对照样本进行比较。染色质结构较松散的区域在游离DNA样本中得到富集，从而可识别染色质压缩程度较低的基因组区域。

我们已采用FAIRE方法检测MHC II类基因在HEK293T细胞中染色质可及性的差异，该方法此前已有报道19。编码MHC II类分子的基因在抗原呈递细胞（APC）中表达，其表达可为组成型，也可由细胞因子信号诱导20。MHC II类基因的表达由一种激活复合物驱动，该复合物可结合于这些基因启动子和增强子区域内的特定DNA元件，即所谓的XY框21,22。我们的FAIRE分析针对MHC II类基因HLA-DPB1和HLA-DMA的特定区域进行，结果显示在包含XY框的区域染色质呈开放状态，而在基因体区域则更为致密（图2）。
以本实验为例，在计算中我们将总DNA样本稀释了10倍（稀释倍数为10），而游离DNA样本未稀释（稀释倍数为1），用于qRT-PCR检测。不同检测区域获得的Ct值以及最终回收率和相对回收率的计算结果见表2。这些相对回收率是使用ACTB启动子作为阳性对照计算得出的。请注意，这些计算基于用于生成图2所示结果的一个重复实验。
在另一项研究中，采用可诱导基因表达模型检测了染色质可及性。在此情况下，测量了染色质压缩状态在促炎刺激——肿瘤坏死因子（TNF）作用下发生的快速变化。HeLa细胞未经处理或经TNF刺激1小时后，进行FAIRE实验，以检测调控TNF响应性细胞因子白细胞介素8（IL8）基因表达的启动子区域的染色质压缩程度。结果显示，在TNF刺激的细胞中，IL8启动子区域的染色质可及性显著增强（图3）。IL-8启动子在TNF刺激后的可及性甚至高于ACTB启动子，表明该调控区域发生了显著的染色质重塑。由于本实验中获得的回收率高于作为阳性对照区域（ACTB启动子）的回收率，因此相对回收率大于1。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig1.jpg" /> 
图1：FAIRE 实验流程图。 在细胞培养皿或培养瓶中直接加入甲醛对细胞进行交联（A）。甲醛淬灭后，细胞用冰预冷的 PBS 洗涤三次（B），然后转移至反应管中，重悬于 FAIRE 裂解缓冲液中，并进行超声处理以剪切 DNA（C）。取一部分提取的染色质样品在 65 °C 加热去交联，以获得总 DNA 参考样本（D）；随后，分别从交联和去交联的样品中使用苯酚:氯仿法提取游离 DNA（E）。最后，对 DNA 进行定量，并计算游离 DNA 与总 DNA 的比值（F）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig2.jpg" /> 
图2：HEK293T细胞中MHC II类基因簇染色质可及性的测定 HEK293T 细胞通过 FAIRE 进行分析。游离 DNA 与总 DNA 的比值（即.，以ACTB基因的启动子作为阳性对照，12号染色体上的异染色质区域作为阴性对照，以及MHC II类基因HLA-DMA和HLA-DPB1的调控区域和基因体，分别测定其相对回收率。上图显示了该基因座的示意图及引物位置。误差线表示来自两个生物学重复、每个重复三次技术重复所测得数据的标准差。该图改编自已发表的研究报告19. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig3.jpg" /> 
图3：TNF处理后IL8启动子区域DNA可及性的变化。 HeLa细胞经TNF（20 ng/mL）刺激1小时后，采用FAIRE方法进行分析。测定ACTB启动子（阳性对照）、12号染色体上的异染色质区域（阴性对照）以及IL8启动子区域的游离DNA与总DNA的比值。误差线表示三次生物学重复实验（每样本设两个技术重复）的平均值标准误（SEM）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig4.jpg" /> 
图4：超声处理条件的优化。 从293T细胞中提取的染色质使用聚焦式超声仪及适配的超声管（材料表）进行超声处理。染色质按照所示时间进行超声，每个循环包含30秒处理时间，参数设置如下：峰值功率150，占空比15，每脉冲周期500次；随后30秒设置为：峰值功率2.5，占空比15，每脉冲周期500次。超声后的染色质经去交联处理，通过苯酚:氯仿抽提纯化，并上样至2%琼脂糖凝胶。图中显示溴化乙锭染色的凝胶结果，分子量标记物的位置以bp表示。本实验中，经20分钟超声处理后获得了理想的染色质片段大小（200 - 300 bp）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>引物</td>
			<td>序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB-Promoter-F</td>
			<td>AAAGGCAACTTTCGGAACGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB-Promoter-R</td>
			<td>TTCCTCAATCTCGCTCTCGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chr. 12 negative control-F</td>
			<td>ATGGTTGCCACTGGGGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chr. 12 negative control- R</td>
			<td>TGCCAAAGCCTAGGGGAAGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DMA-XY-Box-F</td>
			<td>CATCAGTCACTGGGGAGACG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DMA-XY-Box-R</td>
			<td>GCTTCCCAGCCCAGTTACAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DMA-5’-F</td>
			<td>GGAGAGAACAATCTCCGCTTCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DMA-5’-R</td>
			<td>AGCTGCTATGTGTGGTTGGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DMA-3’-F</td>
			<td>TGGGGACCTAGTTAGGGAGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DMA-3’-R</td>
			<td>AGATCCATGGGAGGAGGCTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DPB1-XY-Box-F</td>
			<td>GTCCAATCCCAGGGTCACAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DPB1-XY-Box-R</td>
			<td>TGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DPB1-5’-F</td>
			<td>GCGTGTTCATGTCTGCATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DPB1-5’-R</td>
			<td>TGATCCTCAGAGCCTGGACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DPB1-3’-F</td>
			<td>CCAGCCTAGGGTGAATGTTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DPB1-3’-R</td>
			<td>GCCTGGGTAGAAATCCGTCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL8 Promoter-F</td>
			<td>GTGATGACTCAGGTTTGCCCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL8 Promoter-R</td>
			<td>CTTATGGAGTGCTCCGGTGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：qPCR引物。
<img alt="表 2" src="/files/ftp_upload/57272/57272table2.jpg" /> 
表 2：FAIRE 相对回收率比值的计算示例。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/Table_2.xlsx">请点击此处下载该文件。</a>

核结构的可塑性受到多种动态表观遗传机制的调控，包括非编码RNA、DNA甲基化、核小体重定位以及组蛋白组成和修饰。本文介绍一种甲醛辅助分离调控元件（FAIRE）实验方案，可重复、经济且简便地检测染色质的可及性。

适当基因表达以响应细胞外信号，即组织和谱系特异性基因转录，关键依赖于高度...

本实验的总体目标是通过将DNA与其相关蛋白共价交联，随后纯化并定量游离DNA，从而确定特定基因位点的染色质可及性。该方法有助于解答染色质研究领域的关键问题，因为无论在未经处理的细胞中，还是在正在进行染色质重塑的细胞中，均可测定DNA的可及性。该技术的主要优势在于无需使用酶来切割DNA，也无需针对每种实验条件进行滴定的抗体。该方案的额外优势在于，除超声波破碎仪外，无需任何特殊设备。本实验操作将由本实验室的博士研究生 Olesja Ritter 和 Tabea Riedlinger 演示。开始实验时，将甲醛直接加入前一天接种的细胞培养基中，使其终浓度达到1%（体积分数）。将培养基在室温下孵育10分钟，每2分钟手动摇动培养板一次。随后，加入甘氨酸至终浓度为0.125摩尔，以淬灭甲醛。将溶液在室温下孵育5分钟，每2分钟摇动一次。吸弃培养基，然后沿培养皿壁小心加入预冷的PBS以洗涤细胞。吸弃PBS，重复洗涤两次。第三次洗涤后，将细胞重悬于1毫升预冷的PBS中，必要时使用细胞刮刮下细胞。将它们转移至预冷的1.5毫升离心管中，置于冰上。在4°C条件下，于预冷的台式离心机中以300×g离心5分钟。小心吸除并弃去上清液。用一毫升 FAIRE 裂解缓冲液重悬细胞沉淀，轻轻吹打数次。将细胞在冰上孵育 20 分钟。孵育结束后，对交联的 DNA 进行超声处理，使其片段化至平均长度为 200 至 300 个碱基对，并在超声过程中冷却样品，以避免样品过热。DNA 的片段化对本实验至关重要，因为片段大小会影响整个技术方案的灵敏度，因此必须在实验前仔细确定超声处理条件，并在每次实验中检测染色质片段的大小。在 4 摄氏度下以 13,000g 离心样品 15 分钟。然后，将上清液转移至新的反应管中。将样品分装为100微升的等份。取一份100微升的等份用于逆转交联，并作为总DNA的参照。加入10微升RNase A，37摄氏度孵育一小时。接下来，加入10 µL蛋白酶K。使用可编程恒温金属浴，将样品在37°C孵育4小时，随后在65°C孵育6小时，以切割蛋白质并逆转交联。取一个新的100 µL等分试样，加入10 µL RNase A，并在37°C孵育1小时。孵育结束后，将此前步骤中获得的未去交联样品与去交联样品平行进行后续操作。加入 H2O 至终体积为 300 微升。然后在通风橱中加入 300 微升苯酚-氯仿-异戊醇，剧烈涡旋振荡。将样品在 4 摄氏度、13,000g 条件下离心 10 分钟。接下来，小心地将上层水相的 280 微升转移至新的反应管中。注意不要吸取位于中间相的任何杂质，因为其中含有蛋白质，剩余的下层相应作为有机溶剂废弃物丢弃。重复上述处理步骤，并小心地将上层水相的 270 微升转移至新的反应管中。在通风橱中加入 270 微升氯仿，并剧烈涡旋。离心样品。离心后，小心转移 250 微升上层水相至新的反应管中，注意避免带入任何中间相的杂质。将剩余样品作为有机溶剂废弃物丢弃。然后加入25 µL 5 M氯化钠、250 µL异丙醇，并加入5 µL作为DNA载体的糖原。倒置离心管并在室温下孵育。孵育后，离心样品以沉淀DNA。接着，用400 µL体积分数为70%的乙醇洗涤DNA沉淀，并再次离心样品。小心吸除上清液，将沉淀在室温下干燥10分钟。待沉淀干燥后，将其重悬于100微升TE缓冲液中。将未去交联的游离DNA样本在65摄氏度下孵育4小时，以去除DNA间的交联。最后，使用分光光度计定量DNA含量，并取少量等分试样在2%（质量/体积）琼脂糖凝胶上电泳，以检测片段大小。将HeLA细胞用TNF刺激一小时后进行FAIRE分析。测定ACTB基因（编码β-肌动蛋白的基因，作为阳性对照）、12号染色体上的异染色质区域（作为阴性对照）以及IL8启动子区域的游离DNA与总DNA的比值。通过溴化乙锭染色凝胶显示不同超声处理时间的结果，表明经过20分钟超声处理后，染色质片段大小达到最佳，为200至300个碱基对。一旦掌握，该技术可在两天内完成。通过此操作步骤，还可进一步开展深度测序等其他方法，以在全基因组水平上确定染色质的可及性。切勿忘记，甲醛和苯酚-氯仿的使用具有极高的危险性，操作时必须采取预防措施，例如在通风橱中操作、佩戴手套，并妥善处理废弃物。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

甲醛辅助分离测定哺乳动物细胞染色质可及性的调控元素

染色体高度凝缩的有丝分裂染色质去凝缩的分子机制尚不明确。我们提出一种基于从HeLa细胞分离的有丝分裂染色质簇建立的无细胞检测方法 Xenopus laevis 能够真实重建解凝过程的卵提取物 体外.

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通过enChIP技术分离特定基因组区域及鉴定其相关分子

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用于分析染色质修饰复合物整体染色质结合特性的连续盐抽提法

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小鼠T细胞系中的染色质免疫沉淀（ChIP）

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神经前体细胞的分离与培养及组蛋白3赖氨酸79二甲基化标记的染色质免疫沉淀

该方法通过特异性序列捕获交联的染色质，进而进行蛋白质组学分析，从而在特定靶位点鉴定新的DNA相互作用蛋白。该方法无需预先了解潜在的结合蛋白，也无需对细胞进行修饰。该技术最初为酵母开发，现已适用于哺乳动物细胞。...

染色质相关蛋白杂交捕获技术在哺乳动物细胞蛋白质组学中的应用优化

染色质环境的调控是实现基因正常表达所必需的重要过程。本文中，我们描述了一种通过在特定基因位点可逆性地招募染色质修饰机器来控制基因表达的方法。...

利用化学表观遗传修饰剂重定向细胞机制以抑制基因转录

染色质免疫沉淀（ChIP）是研究基因调控分子机制的有力工具。然而，该方法在通过机械剪切获得可重复的染色质片段化方面存在困难。在此，我们提供一种利用酶解消化的ChIP检测的改进方案。...

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本方案重点介绍从速冻组织中制备染色质的方法，适用于交联染色质免疫沉淀（X-ChIP）后续进行定量PCR分析（X-ChIP-qPCR）或高通量测序（X-ChIP-seq）。...

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完整 Caenorhabditis elegans L4 幼虫中的染色质可及性分析

学习使用甲醛辅助分离调控元件（FAIRE）方法测定哺乳动物细胞染色质可及性。该技术无需特殊设备，通过甲醛交联、超声破碎和酚氯仿抽提分离游离DNA，适用于HeLa细胞等样本的基因调控研究。

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