使用单核苷酸延伸与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析进行校对与DNA修复检测

该方法有助于回答DNA聚合保真度和DNA修复领域的关键问题，例如校对方法与分析，以及DNA修复片段的界定。该技术的主要优势在于其具有高度特异性、操作简单、快速且易于实施。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为他们在DNA复制与修复领域可能尚不熟悉质谱仪器的操作及数据解读。

我认为最重要的是可视化演示，这一点非常关键，因为它可以展示我们为临床应用（如突变和去甲基化）开发的商品化质谱技术如何便捷地应用于DNA校对和修复研究。本实验操作将由我实验室的研究生Rong-Syuan和Kuei-Ching进行示范。首先按照文本方案中所述进行引物和模板的制备。

以底物P21与T28之间的TG错配为例进行校对。用去离子水将P21引物和T28模板稀释至每微升12.5皮摩尔。然后，取12微升稀释后的引物和12微升稀释后的模板，转移至一个1.5毫升的无菌微量离心管中。

将试管盖紧后，置于加盖的65 °C水浴中孵育30分钟。随后，在37 °C水浴中继续孵育30分钟。最后，将试管置于冰上，以确保充分退火。

向一个1.5毫升的灭菌微量离心管中加入8微升引物和模板混合物、2微升10x校读反应缓冲液、4微升4ddNTPs混合物，并加水至总体积为18微升。轻轻弹击管壁以混匀。将DNA聚合酶用预冷的1x校读反应缓冲液稀释至所需浓度。

始终将稀释后的酶置于冰上保存。将含有底物混合物的微量离心管预热至所需的反应温度。然后，取两微升稀释的DNA聚合酶加入预热的底物混合物中，并轻轻弹击管壁以混匀内容物。

将含有酶和底物的离心管在室温下以3200 × g离心数秒，使反应组分沉降至管底。立即把反应液转移至预设孵育温度的加热块或水浴中。为终止反应，加入等体积的缓冲酚溶液，并通过涡旋振荡数秒使反应充分混匀。

然后，在微型离心机中以3200 ×g的离心力在室温下离心反应物5分钟。将水相转移至一个新的洁净微型离心管中，并加入等体积的氯仿。涡旋振荡数秒以混匀，然后在微型离心机中以3200 ×g的离心力在室温下离心3分钟。

将水相转移至洁净的微量离心管中。在95摄氏度孵育反应5分钟后，将离心管置于冰上。接下来，按照文本方案中的说明，在384孔板中进行树脂添加，以去除盐类污染。

将样品板放入纳升级点样仪中。将基质芯片和制备好的384孔板放置到相应的托盘位置。操作纳升级点样仪，将反应产物点样至芯片上。

按下纳米分配器触摸屏上的运行按钮以开始。检查屏幕上自动捕获的样品点阵图像，该图像包含饱和度信息，以确保芯片上的总体点样体积约为5至10纳升。如果点样体积不足，请重复点样操作。

准备一个包含预期信号信息的 Excel 格式文件用于导入。在程序中，通过右键单击设计界面中的“导入检测方法组”并选择该 Excel 文件，创建并定义新的检测方法。在屏幕左侧的客户项目板选项树中，通过右键单击树状结构的顶部并为其指定文件名，建立目标检测板。

选择384孔板类型，然后点击“确定”。空白板将显示在界面上。在屏幕左侧选择相应的检测项目。通过点击高亮芯片上每个点样样本的位置，右键选择“添加多重检测”（add plex），为每个位置分配选定的检测项目。

接下来，在 Excel 格式中准备一份包含芯片上所有检测项目的无标题工作列表。通过“添加新样本项目”选项导入该工作列表。将检测项目和工作列表分配给 P21T28 检测的每个位置，并通过右键点击进行选择。

使用应用程序将质谱仪与芯片连接。在屏幕右侧选择默认设置。在芯片的角落处填写检测名称和芯片编号。

保存设置并启动质谱仪控制程序。按下进出按钮，取出定位板。将点样芯片放置到定位板上，然后按下进出按钮，使点样芯片进入质谱仪。

点击应用程序的采集按钮，启动质谱并获取数据。打开数据分析程序。浏览屏幕左上角数据库的树状结构，选择芯片ID。在屏幕右侧打开数据文件。

单击谱图图标以显示质谱图。若要裁剪特定的质荷比范围，可右键单击以选择自定义对话框。在新窗口中，单击x轴并设置所需的上限和下限，然后按“确定”以显示谱图的指定范围。

通过右键单击“导出”来导出光谱以供存档。选择 JPEG 文件类型，单击目标位置，选择浏览磁盘，输入文件名，然后单击导出。对于数据定量分析，使用光标单击峰，以在左上角显示峰高。

在MALDI-TOF质谱分析中，寡核苷酸质量与峰强度之间存在反比关系。对长度为17至24个核苷酸的寡核苷酸进行质谱分析，计算其相对信号强度，可用于校对或修复实验的定量分析。

在质谱中可同时检测到模板和引物的信号。由于大小差异，模板及其非特异性部分降解产物的信号与错配引物及校正产物的信号明显分离。此处展示的是对3'末端TG的校对过程。在5分钟时，校正产物为23%，而切除产物为17%。

这种差异持续增加，在20分钟时达到69%与14%。注意质谱（MS）具有高分辨率，能够清晰区分底物与产物信号，二者质量差仅为32。此外，对于末端TG校对切除反应，两种形式的切除产物也易于分辨。

单核苷酸切除中间产物和双核苷酸切除产物。对内部错配的校对结果显示出明显的校对效率趋势。如大量校对产物条带所示，当底物在3'端末端的最后一个、倒数第二个、第三个和第四个核苷酸位置存在错配时，其校对效率明显高于其他位置的错配。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在四小时内完成。通过此方法，还可开展聚合酶保真性筛选等其他应用，以推动药物研发中的新药发现与创制。该技术还为DNA复制与修复领域的研究人员提供了新的途径，有助于深入理解基因组医学及其在所有生物体中忠实复制的机制。

观看本视频后，您应充分了解如何进行DNA校对及利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）分析开展修复实验。请注意，使用苯酚-氯仿具有潜在危险性，操作过程中务必采取预防措施，例如佩戴个人防护装备。文中的替代方案可作为更安全的替代方法予以考虑。