Name: 单核苷酸延长和 MALDI 质谱分析校对及 DNA 修复方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 学习使用高分辨率MALDI-TOF质谱技术进行DNA聚合酶校对和DNA修复检测的单核苷酸延伸方法。该技术具有特异性强、操作简便、快速高效的特点，适用于分析少于9个核苷酸的修复片段，为遗传完整性研究提供了有力工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

感谢中国台湾台北市国家核心设施平台功能基因组学整合核心设施和中国台湾台北市国家研究促进生物医学药物基因组学实验室提供的技术支持。本研究工作得到了台湾健康基金会（L-I.L.）以及中国台湾台北市科技部 [MOST 105-2320-B-002-047] 对方维鸿（Woei-horng Fang）的支持，[MOST 105-2628-B-002 -051-MY3] 对苏康毅（Kang-Yi Su）的支持，以及 [MOST-105-2320-B-002-051-MY3] 对林亮印（Liang-In Lin）的支持。

1. 引物/模板制备
<ol>
	<li>设计引物/模板时，G+C含量应平衡，保持在40%至60%之间，如同测序或PCR引物设计。使用18至21个核苷酸长度的引物，以获得适当的退火效果和更佳的质谱信号。</li>
	<li>设计模板时，双链区的最低熔解温度设为50 °C，并确保具有至少7个核苷酸的5'-突出端，以分离引物与模板之间的信号。 
	注意：例如，在表1中的底物P21/T28，21-nt引物与28-nt模板配对。可选方案：可使用如核酸酶抗性的硫代磷酸酯键替代模板3'端最后4个磷酸二酯键，以防止模板可能发生非特异性3'端降解（例如，表1中的T28S4），尽管这将增加模板制备的部分成本。</li>
	<li>本研究中使用标准脱盐寡核苷酸且无需进一步纯化即可满足要求。将寡核苷酸引物/模板配制成100 pmol/µL的H2O溶液作为储备液，并于-20 °C保存。通过MALDI-TOF质谱分析（步骤4–7）检测引物和模板的质量与纯度，确保其具有单一峰信号及良好的信噪比。</li>
	<li>测定反应中相关序列等摩尔引物的相对MALDI-TOF质谱信号强度（步骤7），用于校准和浓度归一化（图2）。</li>
</ol>
2. 校对反应
注意：相同的校对反应条件和方案适用于A-I、G-I、C-I和T-I的DNA修复。
<ol>
	<li>以 表1 中用于校对的底物 P21/T28 的 T-G 错配为例，用 H2O 将引物 P21 和模板 T28 稀释至 12.5 pmol/µL；然后将 12 µL 稀释后的引物和 12 µL 稀释后的模板转移至一个 1.5-mL 无菌微量离心管中。 
	注意：模板/引物混合物的量足够进行 2 次反应；若需进行多次反应，请按比例相应增加试剂体积。</li>
	<li>盖紧管盖。将管子置于加盖的 65-°C 水浴中孵育 30 分钟，随后在 37-°C 水浴中孵育 30 分钟，最后置于冰上，以确保充分退火。</li>
	<li>向一个 1.5-mL 无菌微量离心管中加入 8 µL 引物和模板混合物（50 pmol）、2 µL 10x 校对反应缓冲液、4 µL 4 种 ddNTP 混合物（每种 dNTP 为 2 mM），并用 H2O 补充至 18 µL。轻弹管壁以混匀。 
	注意：1x 校对反应缓冲液包含 50 mM NaCl、10 mM MgCl2、1 mM 二硫苏糖醇和 10 mM Tris-HCl（25 °C 时 pH 7.9）。有关 10x 校对反应缓冲液的商业来源，请参见 材料表。反应中每种 ddNTP 的终浓度为 0.1 mM。</li>
	<li>用预冷的 1x 校对反应缓冲液将 DNA 聚合酶稀释至所需浓度 [例如，向一个 1.5-mL 无菌微量离心管中加入 4 µL 1x 校对反应缓冲液和 1 µL 来自商业来源的 5-U Klenow 聚合酶（材料表）]。稀释后的酶应始终保存在冰上。 
	注意：稀释后的 DNA 聚合酶量足够进行 2 次反应；若需进行多次反应，请按比例相应增加酶的体积。2.0 µL 含 2.0 单位 Klenow 聚合酶的溶液可在 5 分钟内校对超过一半的 50 pmol T-G 末端错配 P21/T28。</li>
	<li>将步骤 2.3 中含有底物混合物的微量离心管预热至所需的反应温度（例如，Klenow 聚合酶通常为 37 °C，T4 DNA 聚合酶为 25 °C）。然后将步骤 2.4 中稀释的 DNA 聚合酶 2.0 µL 转移至预热的底物混合物中，并轻弹管壁以混匀内容物。</li>
	<li>在室温下以 3,200 x g 离心数秒，使酶和底物管中的反应组分沉至管底。立即把反应体系转移至设定好孵育温度的加热块或水浴中，如步骤 2.5 所述。</li>
	<li>终止反应
	<ol>
		<li>加入等体积的缓冲酚，涡旋混合数秒，然后在微量离心机中于室温下以 3,200 x g 离心 5 分钟。
		<ol>
			<li>将水相转移至洁净的微量离心管中，加入等体积的氯仿，涡旋混合数秒，然后在微量离心机中于室温下以 3,200 x g 离心 3 分钟。将水相转移至另一洁净的微量离心管中，在 95 °C 孵育 5 分钟，然后置于冰上。 
			警告：酚和氯仿为危险化学品，操作及废液处理应遵循机构相关规定。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>或者采用酸淬灭法。向反应体系中加入 2 µL 1 M HCl，在冰上终止反应 6 分钟，然后加入 0.64 µL 1 M 二乙醇胺（DEA）以中和反应混合物的 pH，并在 95 °C 孵育 5 分钟；随后置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 添加树脂以去除盐类污染
<ol>
	<li>使用商业脱盐试剂盒中的树脂勺（参见材料表），取足量树脂以覆盖384孔、每孔6 mg的树脂凹板上的所有凹孔。</li>
	<li>通过刮过板面顶部，将树脂均匀分布至所有凹孔中（每孔6 mg）。回收多余的树脂并放回瓶中。</li>
	<li>将步骤2.7中的最终反应产物从微量离心管转移至384孔板中。向每孔加入16 µL H2O以稀释最终反应产物，然后密封该板并离心以去除任何气泡。</li>
	<li>移除密封膜，将含有反应产物的384孔板倒置，覆盖在装有树脂的凹板上。</li>
	<li>翻转孔板与凹板的夹心结构，小心使树脂落入384孔板中（确保384孔板紧贴于装有树脂的凹板上的金属定位销）。</li>
	<li>移除顶部的凹板，密封含有反应产物与树脂混合物的384孔板，短暂在3,200 × g下离心以去除气泡，并将其置于旋转器上，在室温下旋转至少15分钟以完成脱盐处理。</li>
	<li>树脂纯化完成后，在3,200 × g下离心384孔板5分钟，使树脂紧实沉淀至孔底。</li>
</ol>
4. 将反应产物转移至基质芯片
<ol>
	<li>将样品板放入纳升级分液仪中（nanodispenser，参见材料表）。</li>
	<li>将基质芯片（参见材料表）和第3.7节中的384孔板放入相应的托盘中。</li>
	<li>操作纳升级分液仪将反应产物点样至芯片；按下分液仪触摸屏上的RUN按钮以开始运行。</li>
	<li>检查屏幕上自动捕获的样品点图像，确认其包含饱和信息，确保芯片上的总点样体积约为5 - 10 nL。如果体积不足，请重复点样操作。</li>
</ol>
5. 在质谱仪上设置检测信息
<ol>
	<li>准备一个以 .xls 格式存储的文件，其中包含用于导入的预期信号信息。例如，使用以下设置： &#34;P21_T28.xls&#34; (表2) 用于步骤 2、3 和 4 中 P21/T28 的校对反应。</li>
	<li>在应用程序中创建并定义一种新检测方法（参见 材料表) 通过右键单击 设计师格式中的导入检测组 并选择 .xls 文件（例如, &#34;P21_T28.xls&#34; 来自步骤 5.1）。</li>
	<li>建立目标检测板 通过 的 客户：项目：平板 通过右键单击屏幕左侧选项树的顶部并为其指定文件名例如, &#34;CTT20171201&#34; 代表检测代码和日期。</li>
	<li>选择384孔板类型并按下 好的；将出现一个空白板。</li>
	<li>选择合适的检测方法（例如，P21_T28）位于屏幕左侧。</li>
	<li>分配选定的检测方法（例如，芯片上每个点样样本位置（P21_T28）通过高亮显示孔位并右键点击来选择 添加 Plex.</li>
	<li>准备一份包含芯片上所有检测项目的 .xlsx 格式工作列表，且不设表头例如，1201.xlsx 的 表3）。导入工作列表 通过 这 添加新样本项目 选项。</li>
	<li>在工作列表中分配测试任务（例如，从1201.xlsx中）分配至P21_T28检测的每个位置，并通过右键点击进行选择。</li>
</ol>
6. MALDI-TOF 质谱仪操作
<ol>
	<li>使用应用程序将质谱仪与芯片连接（参见材料表）。</li>
	<li>选择屏幕右侧的默认设置。</li>
	<li>填写第5.3步中的检测名称（例如，CTT20171201）、芯片角落处的芯片编号，并保存设置。</li>
	<li>启动质谱控制程序（参见材料表）。</li>
	<li>按下进出按钮，取出定位板。将第4.4步中点样的芯片放置在定位板上，然后再次按下进出按钮，使点样芯片进入质谱仪。</li>
	<li>点击应用程序中的采集按钮（参见材料表），启动质谱分析并采集数据。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>打开数据分析程序（参见材料表）。</li>
	<li>浏览屏幕左上角的数据库树状结构，选择步骤6.3中的芯片ID。在屏幕右侧打开数据文件。</li>
	<li>点击光谱图标以显示质谱图。如需裁剪特定的m/z范围，可右键单击选择自定义对话框，在新窗口中点击X轴，设置所需的上下限，然后点击确定以显示指定范围的光谱。</li>
	<li>通过右键单击选择导出来导出光谱以供存档。 
	注意：在计算机屏幕上查看数据时，采用1,600宽度/1,200单位的比例是较为合适的尺寸。
	<ol>
		<li>选择JPEG文件类型，点击目标位置，选择浏览磁盘（例如，U盘E:），输入文件名（例如，1201-1.jpg），然后点击导出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行数据定量时，使用光标点击峰以在屏幕左上角显示峰高。
	<ol>
		<li>或者，打印导出的JPEG文件，并用直尺手动测量峰高。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Loeb, L. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fidelity+of+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fidelity of DNA synthesis.</a> Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).</li>
<li>Kornberg, A., Baker, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKornberg%2C+A+%22DNA+replication%22">DNA replication</a>. , W.H. Freeman. Oxford, UK. (1992).</li>
<li>Carroll, S. S., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cr00105a011">Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm.</a> Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).</li>
<li>Echols, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1883202">Fidelity Mechanisms in DNA Replication.</a> Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetic+and+chemical+mechanism+of+high-fidelity+DNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).</li>
<li>Reha-Krantz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+proofreading%3A+Multiple+roles+maintain+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).</li>
<li>Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+proofreading%3A+active+site+switching+catalyzed+by+the+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).</li>
<li>Petruska, J., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+neighboring+bases+on+DNA+polymerase+insertion+and+proofreading+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).</li>
<li>Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+mispair+extension+kinetics.+Comparison+of+DNA+polymerase+%CE%B1+and+reverse+transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).</li>
<li>Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10373598">An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases.</a> Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).</li>
<li>Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+2-aminopurine+fluorescence+to+measure+incorporation+of+incorrect+nucleotides+by+wild+type+and+mutant+bacteriophage+T4+DNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).</li>
<li>Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+analog+2-aminopurine+as+a+spectroscopic+probe+of+nucleotide+incorporation+by+the+Klenow+fragment+of+Escherichia+coli+polymerase+I+and+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Biochemistry. 34 (28), 9185-9192 (1995).</li>
<li>Leung, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+G-quadruplex-based+luminescent+switch-on+probe+for+the+detection+of+polymerase+3%27-5%27+proofreading+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3'-5' proofreading activity.</a> Methods. 64 (3), 224-228 (2013).</li>
<li>Song, C., Zhang, C., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+DNA+polymerase+fidelity+by+singly+labeled+smart+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes.</a> Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).</li>
<li>Haff, L. A., Smirnov, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphism+identification+assays+using+a+thermostable+DNA+polymerase+and+delayed+extraction+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).</li>
<li>Haff, L. A., Smirnov, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genotyping+of+PCR+products+with+MassTag-labeled+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers.</a> Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).</li>
<li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+MALDI-TOF+based+methodology+for+genotyping+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms.</a> Nucleic Acids Research. 31 (24), e155(2003).</li>
<li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+%28EGFR%29+T790M+mutation+predicts+shorter+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+response+duration+in+patients+with+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).</li>
<li>Lee, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease+V-mediated+deoxyinosine+excision+repair+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro.</a> DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).</li>
<li>Lee, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+excision+of+3%27+penultimate+errors+by+DNA+polymerase+I+and+its+role+in+endonuclease+V-mediated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">The excision of 3' penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair.</a> DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).</li>
<li>Kucera, R. B., Nichols, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Dependent+DNA+Polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA-Dependent DNA Polymerases.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).</li>
<li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li>
<li>Weiss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+deoxyinosine+from+the+Escherichia+coli+chromosome+as+studied+by+oligonucleotide+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation.</a> DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).</li>
<li>Cao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease+V%3A+an+unusual+enzyme+for+repair+of+DNA+deamination%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).</li>
<li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+single+nucleotide+extension+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+proofreading+and+DNA+repair+assay%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay.</a> DNA Repair. 61, 63-75 (2018).</li>
<li>Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proofreading+DNA%3A+recognition+of+aberrant+DNA+termini+by+the+Klenow+fragment+of+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).</li>
<li>Santa Lucia, J. Jr, Hicks, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thermodynamics+of+DNA+structural+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">The thermodynamics of DNA structural motifs.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).</li>
<li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+I+proofreading+exonuclease+activity+is+required+for+endonuclease+V+repair+pathway+both+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo.</a> DNA Repair. 64, 59-67 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究描述了一种使用 MALDI-TOF 质谱法，通过选定的商用仪器（参见材料表）进行逐步分析的校对活性检测方法。该方法的主要优点在于引物和模板无需标记且操作简便，从而在实验设计上具有更高的灵活性。对30个校对测试进行流水线式完整处理需要4小时，其中包括3小时的人工完成校对反应及其纯化步骤，而使用上述方案的 MALDI-TOF 质谱分析则需1小时完成。该方法的主要缺点是检测所需的底物用量较大。为了获得强信号和一致的结果，我们在20 µL反应体系中使用了50 pmol的DNA底物；因此，DNA用量远高于放射性标记DNA实验8,9,10。通过减小反应体积和样品量，并对质谱操作进行精细优化，可降低所需底物的用量。
从商业来源获得的合成寡核苷酸可直接用于校对研究，无需进一步纯化或处理。然而，建议通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）检测DNA的纯...

DNA聚合酶在DNA复制过程中的校对功能对于确保遗传信息高保真地传递给子代至关重要1,2,3,4,5,6,7。能够评估聚合酶校对外切核酸酶的贡献，将有助于阐明维持遗传稳定性的机制。
放射性同位素标记结合基于凝胶的检测方法，以及对放射自显影图像或磷屏成像进行的密度测定分析8,9,10 传统上，检测DNA聚合酶的校对活性一直采用此类方法。尽管这些方法具有功能可行性，但操作繁琐、成本高昂，且难以适用于高通量实验模式。此外，放射性同位素的使用存在安全问题，包括放射性废物的处理。作为替代方案，已有研究采用荧光检测技术分析校对活性。例如，2-氨基嘌呤（2-AP）可在延伸产物合成过程中被掺入 体外 聚合酶校对活性检测以产生荧光信号11,12遗憾的是，这些方法的特异性较低，因为2-AP既可以与胸腺嘧啶配对，也可以与胞嘧啶配对。较新的方法包括一种基于G-四链体的高灵敏度发光开启型探针，用于聚合酶3'-5'外切酶活性检测13 以及一种单标记荧光探针，用于聚合酶校对活性检测，可克服上述部分局限性14由于需要对DNA底物进行特异性标记，人们对这些荧光测定方法的热情有所降低。
相比之下，用于DNA分析的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）已被应用于PinPoint检测中，该方法通过使用未标记的4种ddNTP进行引物延伸反应，可识别特定位点的多态性15,16,17 并已广泛应用于临床中的突变检测和癌症诊断18基于这些基本原理，我们建立了一种无标记检测方法用于 体外 利用MALDI-TOF质谱技术的高分辨率、高特异性和高通量潜力测定DNA聚合酶的校对活性。使用 E. coli DNA聚合酶I的Klenow片段作为模式酶，双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTPs）作为底物可参与 &#34;快照&#34; 单核苷酸延伸后校对产物的分析 通过 MALDI-TOF 质谱（图1).
同样，该方法也开发用于一种DNA修复检测，其中含有3'倒数第二个脱氧次黄苷（dI）损伤的引物经受一种模拟内切酶V切口修复中间体的pol I修复检测。尽管该机制尚未完全阐明，但内切酶V修复途径是目前已知唯一利用pol I校对外切酶活性进行损伤切除的修复系统19,20。通过MALDI-TOF质谱分析，我们观察到明确的修复片段：当dI位于引物末端前两个核苷酸内时，pol I可将其切除，随后加入正确的互补核苷酸。
在研究校对和DNA修复时，该方法比以往的方法更快且更省力，并能提供有关其机制和功能的额外信息。

<table><tbody><tr><td>寡核苷酸</td><td>Mission Biotech (中国台湾)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫代磷酸酯修饰寡核苷酸</td><td>Integrated DNA Technologies (中国台湾)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Klenow片段（3&#039;&amp;rarr;5' exo-）</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1 (10X)</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddATP</td><td>Trilink Biotechnologies, CA</td><td>N4001</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddGTP</td><td>Trilink Biotechnologies, CA</td><td>N4002</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddTTP</td><td>Trilink Biotechnologies, CA</td><td>N4004</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddCTP</td><td>Trilink Biotechnologies, CA</td><td>N4005</td><td></td></tr><tr><td>dATP、dGTP、dCTP、dTTP混合物</td><td>Clubio, 中国台湾</td><td>CB-R0315</td><td></td></tr><tr><td>SpectroCHIP芯片阵列</td><td>Agena Bioscience, CA</td><td>#01509</td><td></td></tr><tr><td>MassARRAY</td><td>Agena Bioscience, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typer 4.0软件</td><td>Agena Bioscience, CA</td><td>#10145</td><td></td></tr><tr><td>Clean Resin工具试剂盒</td><td>Agena Bioscience, CA</td><td>#08040</td><td></td></tr></tbody></table>

使用单核苷酸延伸与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析进行校对与dna修复检测

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

基因组的维持及其精确复制对于遗传信息的保存至关重要。为了评估高保真复制，我们开发了一种简单、无标记且非放射性同位素的方法，结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析，用于校对功能的研究。此处，使用一种DNA聚合酶［例如， 大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段（KF） 大肠杆菌 本研究中使用DNA聚合酶I（pol I）在存在四种双脱氧核糖核苷三磷酸的条件下处理错配的引物-模板双链。随后对该错配引物进行校读/延伸，并进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析。通过引物质量的变化，可区分出单核苷酸水平的差异。重要的是，该方法也可用于检测内部单个错配的校读，尽管其效率有所不同。位于引物3'端2–4个核苷酸（nt）处的错配可被pol I高效校读，而位于5 nt处的错配仅表现出部分校正。对于位于引物3'端6–9 nt处的内部错配，则未观察到校读现象。该方法亦可应用于DNA修复检测分析。例如， 评估内切酶V修复途径底物的碱基损伤修复。含有3'倒数第二个脱氧肌苷（dI）损伤的引物可被pol I修复。事实上，pol I能够切除倒数第二个T-I、G-I和A-I底物中最后两个含dI的核苷酸，随后加入正确的ddN 5'-单磷酸（ddNMP）；而倒数第二个C-I错配则被pol I耐受，使引物在未修复的情况下得以延伸，从而证明了质谱分析法在检测DNA修复时具有高灵敏度和分辨能力。

模板与引物：
采用本方案，对从商业来源获得的等摩尔合成寡核苷酸模板和相应序列引物进行了纯度和质量检测（图 3A；注意信号与指定质量相符且背景信号较低），同时也检测了峰强度与分析物质量之间的关系（图 2A）。对质谱数据的峰高进行了测量和计算（图 2B），以进行归一化处理。
反应条件和质谱：
已有研究证明，将单碱基引物延伸反应与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-...

采用高分辨率基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）结合单核苷酸延伸策略，建立了一种无需标记和放射性同位素的DNA聚合酶校对及DNA修复检测方法。该检测方法在检测长度短于9个核苷酸的校对和修复片段时，表现出高度特异性、操作简便、快速且易于实施的特点。

使用单核苷酸延伸与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析进行校对与DNA修复检测

基因组的维持及其精确复制对于遗传信息的保存至关重要。为了评估高保真复制，我们已经……

该方法有助于回答DNA聚合保真度和DNA修复领域的关键问题，例如校对方法与分析，以及DNA修复片段的界定。该技术的主要优势在于其具有高度特异性、操作简单、快速且易于实施。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为他们在DNA复制与修复领域可能尚不熟悉质谱仪器的操作及数据解读。我认为最重要的是可视化演示，这一点非常关键，因为它可以展示我们为临床应用（如突变和去甲基化）开发的商品化质谱技术如何便捷地应用于DNA校对和修复研究。本实验操作将由我实验室的研究生Rong-Syuan和Kuei-Ching进行示范。首先按照文本方案中所述进行引物和模板的制备。 以底物P21与T28之间的TG错配为例进行校对。用去离子水将P21引物和T28模板稀释至每微升12.5皮摩尔。然后，取12微升稀释后的引物和12微升稀释后的模板，转移至一个1.5毫升的无菌微量离心管中。将试管盖紧后，置于加盖的65 °C水浴中孵育30分钟。随后，在37 °C水浴中继续孵育30分钟。最后，将试管置于冰上，以确保充分退火。向一个1.5毫升的灭菌微量离心管中加入8微升引物和模板混合物、2微升10x校读反应缓冲液、4微升4ddNTPs混合物，并加水至总体积为18微升。轻轻弹击管壁以混匀。将DNA聚合酶用预冷的1x校读反应缓冲液稀释至所需浓度。始终将稀释后的酶置于冰上保存。将含有底物混合物的微量离心管预热至所需的反应温度。然后，取两微升稀释的DNA聚合酶加入预热的底物混合物中，并轻轻弹击管壁以混匀内容物。将含有酶和底物的离心管在室温下以3200 × g离心数秒，使反应组分沉降至管底。立即把反应液转移至预设孵育温度的加热块或水浴中。为终止反应，加入等体积的缓冲酚溶液，并通过涡旋振荡数秒使反应充分混匀。然后，在微型离心机中以3200 ×g的离心力在室温下离心反应物5分钟。将水相转移至一个新的洁净微型离心管中，并加入等体积的氯仿。涡旋振荡数秒以混匀，然后在微型离心机中以3200 ×g的离心力在室温下离心3分钟。将水相转移至洁净的微量离心管中。在95摄氏度孵育反应5分钟后，将离心管置于冰上。接下来，按照文本方案中的说明，在384孔板中进行树脂添加，以去除盐类污染。将样品板放入纳升级点样仪中。将基质芯片和制备好的384孔板放置到相应的托盘位置。操作纳升级点样仪，将反应产物点样至芯片上。按下纳米分配器触摸屏上的运行按钮以开始。检查屏幕上自动捕获的样品点阵图像，该图像包含饱和度信息，以确保芯片上的总体点样体积约为5至10纳升。如果点样体积不足，请重复点样操作。准备一个包含预期信号信息的 Excel 格式文件用于导入。在程序中，通过右键单击设计界面中的“导入检测方法组”并选择该 Excel 文件，创建并定义新的检测方法。在屏幕左侧的客户项目板选项树中，通过右键单击树状结构的顶部并为其指定文件名，建立目标检测板。选择3

proofreading-dna-repair-assay-using-single-nucleotide-extension-maldi

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

单核苷酸延长和 MALDI 质谱分析校对及 DNA 修复方法

我们描述了一种用于定量、实时测量细胞核裂解液中DNA糖基化酶和AP内切核酸酶活性的方法。该检测方法可获得适用于动力学分析的DNA修复活性速率，并可适用于组织和肿瘤裂解液或纯化蛋白中DNA修复活性的定量分析。...

利用损伤特异性分子信标对细胞裂解液中碱基切除修复活性进行定量实时分析

电子能谱成像能够在纳米级分辨率下对核酸与蛋白质进行成像并加以区分。该技术可与miniSOG系统结合使用，后者能够在透射电子显微镜样品中特异性地标记目标蛋白。本文以双链断裂修复灶为例，说明这些技术的应用。...

miniSOG标记的DNA修复蛋白与电子光谱成像（ESI）联合可视化

此处研究不同的DNA损伤识别方法 通过...

原子力显微镜研究核苷酸切除修复中的DNA损伤识别

在此演示了如何 原位 邻近连接实验（Proximity Ligation Assay, PLA）可用于检测和可视化在基因毒性应激条件下悬浮培养细胞中ATM与p53之间的直接蛋白质-蛋白质相互作用。...

利用邻位连接技术在悬浮细胞培养物中检测和可视化DNA损伤诱导的蛋白质复合物

开发了一种非标记、非放射性同位素的检测方法，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）直接分析含有无嘌呤/无嘧啶位点的产物，以测定尿嘧啶-DNA糖基化酶活性。该方法被证明在DNA糖基化酶活性检测中具有操作简便、特异性强、快速且易于使用的特点。...

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性

本文介绍了DNA纤维实验的两种改进方法，用于在诱导损伤后研究复制DNA中的单链DNA缺口。S1纤维实验利用特异性识别单链DNA的S1核酸内切酶来检测复制后缺口，而缺口填补实验则可用于可视化并定量分析缺口修复过程。...

利用DNA纤维实验检测人细胞中复制后缺口的积累与修复

采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）对氧化RNA与外切核糖核酸酶Xrn-1反应产生的片段进行表征。本方案所描述的方法可应用于涉及RNA和/或DNA的其他过程。...

利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定酶降解产生的RNA片段

本方案描述了一种用于定量HEK-293T细胞中非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）效率的染色体外非同源末端连接（NHEJ）检测方法和同源重组（HR）检测方法。...

利用基于GFP的报告系统分析HEK-293T细胞中非同源末端连接和同源重组效率

我们介绍了利用基于发光的染色体外报告底物体系来评估细胞中双链断裂修复通路功能完整性的实验方案。...

基于高通量定量发光报告系统的DNA双链断裂修复活性评估

构象柔性在蛋白质功能中起着关键作用。本文介绍了将时间分辨电喷雾电离质谱与氢-氘交换相结合，用于研究有序和无序蛋白质中驱动功能的快速结构变化。...

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱法用于研究蛋白质结构与动力学

学习使用高分辨率MALDI-TOF质谱技术进行DNA聚合酶校对和DNA修复检测的单核苷酸延伸方法。该技术具有特异性强、操作简便、快速高效的特点，适用于分析少于9个核苷酸的修复片段，为遗传完整性研究提供了有力工具。

使用单核苷酸延伸与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析进行校对与DNA修复检测

探索更多视频