Name: 头脊髓和薄片体外制备心律失常活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 学习啮齿动物脑干切片制备技术，用于电生理记录延髓呼吸神经网络。该方法可稳定捕获pre-Bötzinger复合体及节律性神经活动，助力研究呼吸控制的神经机制与病理模型。

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S.B.P 获得了洛马林达大学暑期本科生研究奖学金。

以下方案已获得洛马林达大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的接受和批准。实验室开展的所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于动物伦理待遇的指南。执行本方案的人员均严格遵守各项伦理标准。
1. 溶液
<ol>
	<li>制备人工脑脊液（aCSF）。
	<ol>
		<li>在实验前一晚，按以下配方配制1 L批次的新鲜aCSF：7.250 g NaCl（124 mM）、0.224 g KCl（3 mM）、2.100 g NaHCO3（25 mM）、0.069 g NaH2PO4 • H2O（0.5 mM）、0.247 g MgSO4 • 7H2O（1.0 mM）、5.410 g D-葡萄糖（30 mM）和0.221 g CaCl2 • 2H2O（1.5 mM）。CaCl2 • 2H2O必须最后加入。</li>
		<li>将各组分溶解于1 L去离子水中，搅拌20–30分钟。</li>
		<li>测量aCSF的pH值，并用少量稀释的NaOH、KOH或HCl（通常&#60;0.5 mL）调节至7.40 ± 0.02。 
		注意：配制好的aCSF可在冰箱中（4 °C，pH 7.40 ± 0.02）保存最多三天，超过此时间后细菌生长可能影响实验过程中组织的活性。使用0.2 µm滤器以减少实验室中真菌或细菌的污染，因为实验可能持续长达36小时。为提高效率，上述aCSF配方可按相同比例放大至4 L批次，该体积可满足最多三天的实验需求。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 解剖和振动切片机装置的准备
<ol>
	<li>安装刀片。
	<ol>
		<li>使用新的双刃剃须刀片在振动切片机上切割组织。在切割组织前，先用100%乙醇清洗刀片，并用去离子水冲洗，或先将刀片折断成两半，再将其插入振动切片机的夹具中。</li>
		<li>每次在振动切片机上安装新的组织样本进行切片时，或刀片在切片过程中接触到石蜡块时，均应更换刀片。任何残留的石蜡都会导致几乎无法干净地切开新生神经组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备石蜡块。
	<ol>
		<li>使用任意一种包埋用石蜡。取10 g包埋介质放入耐热玻璃烧杯中，用低温加热使石蜡颗粒完全融化为液体。</li>
		<li>加入约0.5 g石墨粉，并将溶液在液态石蜡中充分且均匀地混合。</li>
		<li>使用小块塑料片作为石蜡的基底。裁剪一小块塑料（厚度0.5–1 cm，面积约2 × 2 cm2）（也可使用聚碳酸酯或铝片）。使用机工锉在塑料表面划出凹槽，以确保石蜡能够牢固附着于塑料表面。 
		注意：也可使用加热的18号皮下注射针头在塑料片上打斜孔，以确保石蜡-石墨混合物牢固附着于塑料基底。</li>
		<li>使用棉签的尾端反复浸入熔融的石蜡-石墨混合液中，然后将混合物滴涂到塑料片上，逐层堆积，使石蜡-石墨层在塑料基底上达到约1.5 cm的厚度。</li>
		<li>当石蜡-石墨混合物在基底上沉积至足够厚度后，将其放置一旁冷却，随后修整形状以适配脑干-脊髓组织。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 神经轴的解剖与分离
<ol>
	<li>进行初步解剖和麻醉。 
	注意： 本研究中使用的动物包括小鼠的胚胎第18天（E18）至出生后第10至20天，或大鼠的胚胎第18天（E18）至出生后第5至6天。根据实验设计，可使用任意品系、处理方式或性别的大鼠或小鼠。由于使用异氟烷（在25 mL密闭室中加入0.25 mL），麻醉及初步解剖操作应在通风橱内进行。
	<ol>
		<li>称重幼鼠，然后将其放入麻醉室中，麻醉室内放置有 0.25 mL 异氟烷，置于一块 2 英寸 × 2 英寸的纱布上2 一块纱布。当动物达到手术麻醉深度（通过夹趾无回缩反射来确认）后，将其固定在盛有石蜡或硅橡胶的培养皿中。 
		注意： 新生啮齿类动物也可通过低温麻醉进行麻醉13,14异氟烷汽化15，或注射16 用氧气平衡。</li>
		<li>将动物腹侧朝下放置，使用10号或11号手术刀片或手术剪，从眼后方沿中线切至脊柱中腰段。分离皮肤，于顶骨/枕骨缝水平处去脑（见 图1）并从膈膜下方横切动物体表以去除皮肤。然后用剪刀或解剖刀在肩关节处切断以去除前肢。</li>
		<li>皮肤去除后，将动物转移至底部带有硅胶弹性体的灌流 chamber，用于进一步解剖并制备延髓-脊髓。</li>
		<li>用冷却的（4 °C，pH 7.40 ± 0.02）aCSF 持续鼓泡充注 aCSF 储液瓶（500 mL 侧口瓶），并以 95% O₂2 和 5% CO2 （也称为 &#34;碳合气&#34;在解剖过程中，使用预冷的aCSF定期冲洗灌流室，以在整个脑干-脊髓分离过程中提供新鲜的含氧aCSF。 
		注意： 在残留的动脉和静脉中可见红细胞，当氧合充分时，呈鲜红色。</li>
		<li>使用重力流灌注 通过 管路和止流夹，用于间歇或持续地向组织灌注含氧人工脑脊液（aCSF）（团注体积或 通过 使用活塞缓慢滴注（约0.5–1.0 mL/min），以氧合组织并维持清晰的手术视野。</li>
		<li>根据需要使用真空抽滤系统去除多余液体。</li>
		<li>使用解剖显微镜进行解剖操作。建议采用连续变倍型号，以便精细调节放大倍数，并在解剖的每一步骤中实现对目标区域的最佳观察。 
		注意： 推荐的显微外科手术工具包括各种有齿组织镊、钝头镊、#5 镊、角度组织镊、多种显微解剖剪（弹簧剪）以及常规昆虫针和显微解剖针。</li>
		<li>暴露大脑 通过 沿矢状缝对颅骨进行正中切开，然后用显微解剖针固定翻起的骨瓣，并使用27 G针头将尾端脊柱固定在灌注腔底部的硅胶层上。 
		注意： 其余解剖步骤需要使用解剖显微镜，以清晰观察组织及解剖标志，从而最大程度确保在脑干颅神经根丝和脊神经根丝上获得节律性拟态放电输出。使用中型弹簧剪或虹膜剪以及精细镊子进行这些解剖步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>迅速将分离出的动物躯干转移至充氧的解剖室中，将组织背侧朝上放置，头端（脑部）朝向解剖室前方。用固定针在肩部及脊髓最尾端处固定组织。
	<ol>
		<li>沿矢状缝做颅骨正中矢状切口，以避免损伤颅骨下方的皮层和脑干。 
		注意： 新生儿的骨组织尚未完全钙化，非常脆。骨/组织在一定程度上具有柔韧性，但比周围的结缔组织和肌肉组织更坚韧。</li>
		<li>使用中型弹簧剪或虹膜剪从矢状缝开始，向两侧剪开颅骨的枕部缝，从而形成 &#34;皮瓣&#34; 头骨部分可翻折并用针固定，以锚定头骨的吻侧部分，并为组织提供一定的稳定性（参见 图2A).</li>
		<li>翻转颅骨瓣后，切除其余的大脑皮层，保留小脑后部（蚓部）相对完整（图2B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行背侧椎板切除术。
	<ol>
		<li>使用显微弹簧剪和镊子去除颅骨和脊柱周围的肌肉组织。沿肋骨背面去除组织，保留肋骨完整，因后续腹侧椎板切除时需将肋骨固定以锚定组织，从而最大限度降低脊髓损伤的风险。</li>
		<li>使用中型弹簧剪刀或精细虹膜剪小心剪除椎板的侧突。剪除覆盖在脑桥和延髓上方的所有组织。此时小脑蚓部、小脑、脑桥以及脊髓起始部将清晰可见。图2C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行腹侧椎板切除术。
	<ol>
		<li>将组织背侧朝下，用大头针固定于肋骨和脊柱最尾端。用颅骨瓣固定组织的头侧部分图3A).</li>
		<li>使用相同的剪刀和镊子去除包括胸骨在内的肋骨腹侧半部以及所有腹腔器官。分离附着在肋骨上的软组织，暴露肋骨和脊髓。图3B).</li>
		<li>移除舌、食管、气管、喉以及覆盖在颅底和脊柱上方的所有其他软组织和肌肉（如图所示）。&#160;图3C).</li>
		<li>解剖覆盖在硬腭上的组织。通过在颅底找到一块具有V形凹陷的矩形骨板来确定硬腭的位置（图3C）。沿腭部正中线剪开，小心向上抬起，并作横向切割以移除腭部（图4A).</li>
		<li>从第一颈椎开始至大约第七胸椎（T7）水平，通过切除椎板进行腹侧椎板切除术，暴露脑干和脊髓的腹侧面，如图所示。 图4B.</li>
		<li>此时可见腹侧根丝。使用小型显微解剖剪或弹簧剪，应尽量靠近椎板并在远离脊髓根起源处进行切割；避免牵拉神经根。</li>
		<li>沿椎板两侧的脊柱剪取5-10毫米。切勿过于靠近脊髓或切入椎骨。此步骤可去除颈椎椎骨以暴露脊髓。避免切断根丝。</li>
		<li>沿脊柱（约T7水平）双侧剪断根丝，长度约为20–25 mm。操作过程中应避免损伤脊髓，并参照图示操作椎骨边缘 图4C.</li>
		<li>用镊子小心提起每节椎骨的颅侧边缘，在紧贴骨下方剪断，以去除 C1、C2 和 C3。剪切位置越靠近骨骼，根丝越长。剪切时可使用钩状或弯头镊子，以牢固夹持每节颈椎椎骨图4C).</li>
		<li>在分离并解剖出所需长度的脊髓后，进行横切以移除脊髓（图5A 和 图5B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除硬脑膜。 
	注意： 分离的脑干-脊髓可用于整体离体记录，方法如前所述。3,7脑干-脊髓从椎体中取出后，必须去除硬脑膜，以便吸吮电极能够充分接触并记录切断的颅神经根和脊神经根。此外，去除硬脑膜还可实现对脑干进行清晰切片，获得具有节律性活动的薄片，用于体外记录。
	<ol>
		<li>小心地将分离出的脑干-脊髓组织背侧朝上固定，以便接触环绕颅神经根的硬脑膜图5B。应将针头穿过脑干侧缘，位于第Ⅻ对根丝的头侧。</li>
		<li>用精细镊子（#5）夹住脑干背侧表面硬脑膜的背侧边缘，将硬脑膜提起，再用精细弹簧剪沿脑干长度方向从外侧向内侧剪开，以去除脑干背侧的硬脑膜。注意避免剪入脑干组织本身。轻轻提起脑干表面的血管并剪断，以防止在使用振动切片机切片时阻碍刀片。</li>
		<li>小心地从脑干的内侧和外侧分离硬脑膜，因为颅神经根丝会穿过硬脑膜，当抬起硬脑膜时容易被撕脱。使用小型弹簧剪在根丝周围轻轻剪开，以尽量减少根丝被拉脱的风险。</li>
		<li>将脑干-脊髓翻转，使腹侧朝上，颅根根丝清晰可见。从脑干背侧开始解剖硬脑膜，轻轻提起最后区正上方的硬脑膜，由头端向尾端剪开。由于该区域富含大量微毛细血管，最后区呈现轻微粉红色。</li>
		<li>使用细小的昆虫针轻轻剥离残留的硬脑膜，并清除靠近颅部和颈部根丝的残余血管。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 切片方案
<ol>
	<li>去除硬脑膜后，将脑干置于塑料包埋框上石蜡平台的中央（下文简称 &#34;切割块&#34;）。使用已修剪至长度不超过1厘米的精细昆虫针，如图所示，从远端脊髓处固定脑干的尾端 图5C.</li>
	<li>将包埋石蜡的切块与振动切片机样品架中固定针固定的脑干对齐，使刀片切割方向垂直于脑干头端表面。</li>
	<li>在脑干最前端进行初次切割，以去除不平整的多余组织。初次切割的厚度通常为200–300 µm，但需小心避免损伤第IX、X和XII对脑神经根丝。此步骤通常可暴露面神经核（VII）的尾端范围以及舌咽神经（IX）根丝，从而便于调整脑干方向，使其切面与振动切片机刀片保持平行。根据需要进行微调以确保切面平行，并进行少量修切以去除不平整的组织。 
	注意： 舌咽神经（IX）根丝将在每次连续切片的脑干侧缘可见，这些根丝可作为确定脑干节律产生神经回路所需头尾方向距离的解剖标志。在脑干腹侧，稍偏尾侧的切面后方应可见舌下神经根丝（XII），其位置略尾于IX根丝出现的切面。第三个标志为延髓背侧面上的闩（obex），即人类脑中第四脑室变窄并延续为脊髓中央管的部位。当上述三个参考点均可见时，即确立了正确的切片平面（参见 图6A可稳定获得具有节律性活动的脑片。</li>
	<li>继续从头侧向尾侧切割，直至第Ⅸ对脑神经根丝接近脑干切面表面。</li>
	<li>参见 图6 用于定位标志和正确方向。调整振动切片机夹具中的石蜡块，使下一切面角度产生极轻微的倾斜 &#34;楔形&#34; 将切片修整成适当形状，并继续切割厚度约为100–200 µm的切片，直至能够清晰看到所述解剖标志图6A). 
	注意： 切取这一微小楔形组织可增加脑片中捕获的舌下神经（XII）运动神经元数量，并最大限度地提高记录过程中获得节律性活动的可能性。利用所述解剖标志（来自舌咽神经束的吻侧根丝、来自舌下神经束的根丝、闩部）可确保脑片可重复地包含至少大部分前包钦格复合体（pBC）。图6B).</li>
	<li>从这些吻侧神经解剖标志处切取300–500 µm厚的脑干切片，以获取面旁核（pBC）及其相关传导通路。 
	注意： 一个 &#34;理想&#34; 切片将包含舌下神经根束最吻侧的根丝，以可靠地获得吸气活动，而无需使用吸电极在脑干的节律产生/传导区域进行表面记录。</li>
</ol>
5. 记录步骤
<ol>
	<li>将脑片置于记录室中，以人工脑脊液（aCSF）持续灌流（0.5 - 1.0 mL/min），并使用负压吸引电极或细胞外电极记录舌下神经根丝、前包钦格复合体（pBC）、舌下神经前运动神经元（XII PMNs）或舌下运动神经元的群体电活动。有关详细的记录步骤，请参见既往关于脑干-脊髓电生理及膜片钳技术的文献10,11。</li>
</ol>

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<li>Ruangkittisakul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Sensitivity+to+Neuromodulator-Activated+Signaling+Pathways+at+Physiological+%5BK%2B%5D+of+Confocally+Imaged+Respiratory+Center+Neurons+in+On-Line-Calibrated+Newborn+Rat+Brainstem+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices.</a> Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).</li>
<li>Rybak, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+ponto-medullary+respiratory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Physiology+%26+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Modeling the ponto-medullary respiratory network.</a> Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).</li>
<li>Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+pre-B%C3%B6tzinger+complex+inspiratory+center+in+calibrated+%27sandwich%27+slices+from+newborn+mice+with+fluorescent+Dbx1+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated 'sandwich' slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons.</a> Physiological Reports. 2, (2014).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press, Inc. (1997).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press, Inc. (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

将本文所述方案调整为整体组织块（en bloc）或脑片工作流程，对于希望采用整体脑干-脊髓组织块和/或薄切片制备进行电生理记录的实验室和研究而言具有显著优势。本研究所展示的解剖与切片方法，结合先前其他研究者已报道的方法17,18,19，可实现稳定、活性良好且可重复的组织制备，广泛适用于利用啮齿类动物后脑或脊髓开展的多种实验。本文提供的解剖方法极为详尽，包括背侧和腹侧椎板切除术，并详细说明了在进行切片前脑干-脊髓组织的定位方向。该详细的解剖与切片方案使研究人员能够保留生成和传递吸气节律所必需的全部神经环路。使用本方法可涵盖的主要神经元群/结构包括：舌下神经前运动神经元、舌下神经运动核以及preBötzinger复合体。需注意的是，本方案所述制备过程不包含脑干中存在中枢CO2感受器或呼气节律产生回路（RTN/pFRG）的区域20,...

脑干呼吸神经网络为理解节律性神经网络的一般特性提供了丰富的研究领域。特别是，研究关注新生啮齿类动物呼吸的发育过程，以及呼吸节律是如何形成的。可通过多层次方法开展此类研究，包括在体全动物体积描记法、离体脑干-脊髓标本神经记录，以及包含呼吸节律发生器的离体脑片记录。在探究发育中啮齿类动物脑干-脊髓区域呼吸节律发生机制及神经环路时，简化式的离体脑干-脊髓标本和脑片记录是一种优势方法。发育中的呼吸系统包含约40种细胞类型，这些细胞类型可根据其放电模式进行表征，其中包括中枢呼吸相关细胞1,2中枢呼吸网络包含一组位于延髓腹外侧头端的节律性活跃神经元1,3哺乳动物呼吸节律的产生源于一个被称为preBötzinger复合体（pBC）的自主节律性中间神经元网络，该结构已通过实验手段实现定位。 通过 新生哺乳动物脑干-脊髓的切片及整块标本制备3,4,5,6,7,8该区域在功能上类似于心脏的窦房结（SA），可产生呼吸节律以驱动呼吸活动。从脑桥呼吸群（pBC）发出的吸气节律会传递至脑干其他区域（包括舌下运动核）以及脊髓的运动神经元池（例如支配膈肌的膈运动神经元）9.
可利用脑干-脊髓整体标本或脑片从多种细胞群中获得节律性活动，这些细胞群包括C3-C5神经根丝、舌下神经（XII）根丝、舌下运动核（XII MN）、舌下神经前运动神经元（XII pMN）以及先博特复合体（pBC）3,10,11,12。尽管这些数据采集方法已在少数实验室中取得成功，但许多实验方案并未以充分可重复的方式呈现，使得新进入该领域的研究人员难以复现。获得具有活性且呈现节律性活动的整体标本或脑片制备物，要求在解剖和切片全过程中的每一步都极为注重细节。以往的实验方案虽已详尽描述了各种记录方法和电生理技术，但在获取可行组织制备物最关键的步骤——脑干-脊髓解剖与切片操作方面，却缺乏足够的细节说明。
高效获得具有节律性活动且存活的脑干-脊髓整体或脑片标本，用于电生理记录，要求所有步骤均正确、仔细且迅速地完成（通常，此处所述的整个操作过程可在约30分钟内完成）。脑干-脊髓电生理实验方案中一些此前未被充分描述的关键环节，包括神经根丝的解剖以及在振动切片机上的切片过程。本方案首次以逐步可视化的方式，向该领域的初学者和专家全面展示了脑干-脊髓的解剖过程。本方案还详细说明了手术技术、解剖标志及其他相关操作，以帮助未来的研究人员标准化脑片和en bloc标本的制备，确保每次实验所获得的标本均包含所需的确切神经环路。本文所述的操作方法适用于新生大鼠和小鼠幼崽。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-1</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;bull;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638-25G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7774-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>冷光源卤素灯 150 W</td><td>AmScope</td><td>H2L50-AY</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>M-60</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome 1000 Plus</td><td>Vibratome</td><td>W3 69-0353</td><td></td></tr><tr><td>磁性底座</td><td>Kanetic</td><td>MB-B-DG6C</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷，USP</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC 14043-704-06</td><td></td></tr><tr><td>Sword Classic 双刃刀片</td><td>Wilkinson</td><td>97573</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2779</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片 #10</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄 #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>直头弹簧剪&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>窄齿直头有齿镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 微型解剖弹簧剪；直头</td><td>Roboz</td><td>RS-5650</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 剪刀 3&quot; 弯头</td><td>Roboz</td><td>RS-5621</td><td></td></tr><tr><td>昆虫针，0号</td><td>Fine Science Tools/8840604</td><td>26000-35&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>昆虫针，0号，不锈钢</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-35</td><td></td></tr><tr><td>昆虫针，00号</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-30</td><td></td></tr><tr><td>昆虫针，00号，不锈钢</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-30</td><td></td></tr><tr><td>昆虫针，000号</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>昆虫针，000号，不锈钢</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-25</td><td></td></tr><tr><td>显微针，0.10 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>显微针，0.15 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>显微针，0.2 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Fisher 组织处理石蜡&amp;nbsp;</td><td>fisher</td><td>T56-5</td><td></td></tr><tr><td>石墨&amp;nbsp;</td><td>fisher&amp;nbsp;</td><td>G67-500</td><td></td></tr><tr><td>Delrin 塑料&amp;nbsp;</td><td>Grainger</td><td>3HMT2</td><td></td></tr><tr><td>18 号皮下注射针头</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr></tbody></table>

新生啮齿类动物脑干-脊髓节律性活动体外制备及薄片制备

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

哺乳动物的吸气节律由延髓一个称为前包钦格复合体（pBC）的神经元网络产生，该网络发出信号驱动吸气肌的节律性收缩。可通过多种方法研究pBC产生的节律性神经活动及其向其他神经元群传递以支配呼吸肌的过程，包括整体神经记录和横切脑片记录。然而，以往发表的方法并未以透明且可重复的方式充分描述脑干-脊髓的解剖过程，不利于后续研究。本文详细介绍了一种可重复制备具有节律活性的脑干脑片的方法，该脑片包含生成和传递吸气驱动所必需且充分的神经环路。本研究在既往脑干-脊髓电生理实验方案的基础上进行了优化，提高了稳定获得可用于记录的、具有节律活性且状态良好的脑片的可能性，以便记录来自前包钦格复合体（pBC）、舌下神经前运动神经元（XII pMN）以及舌下神经运动神经元（XII MN）的神经输出信号。本工作在以往已发表方法的基础上进一步拓展，提供了从完整新生大鼠幼崽到包含舌下神经根丝的体外脑片的详细分步解剖图示。

本文介绍的方法可帮助研究人员稳定、可靠地制备具有节律性活性的脑干切片，获得可长期记录“拟态”运动输出的健康、功能完整的薄切片。使用该方法可在薄切片中包含生成和传递吸气节律所需的全部基本神经回路元件。这些元件包括：前包钦格复合体（preBötzinger Complex）、投射至舌下神经运动神经元（pXII MNs）的中间神经元、舌下神经运动神经元（XII MNs）以及舌下神经根丝。前包钦格复合体（pBC）、舌下神经（XIIn）和C4神经根丝常用于吸气节律记录，如图7所示。
成功实施本方案可在10至15分钟内获得具有活性且节律性活动良好的整体标本，或获得具有节律性活动的脑片 &lt;30 分钟。在分离出整体脑干-脊髓或薄片后，标本在记录 chamber 中平衡 15 分钟即可产生稳定的拟态运动输出。对于脑片而言，将细胞外 [K+] 提高至约 8–9 mM，根据本实验室经验，可产生强健的神经驱动，...

本方案以可视化方式展示了脑干-脊髓制备过程，并全面、分步详解了脑干横切片的制备方法。该方案旨在提高实验可重复性，并增加成功获取存活时间长、具有节律性活性、可用于记录脑干呼吸区神经输出信号的脑片的可能性。

哺乳动物的吸气节律由延髓一个称为preBötzinger复合体（pBC）的区域中的神经元网络产生，该网络可生成一种……

该方法可实现对啮齿类动物脑干的可重复性分离与切片，用于捕获分析弥散性延髓呼吸网络。该技术具有高度的实验灵活性，可制备离体延髓块或脑片标本用于记录。该方法可用于电生理学实验，以探究产生呼吸节律的神经调控回路，并研究基因修饰啮齿类动物中呼吸功能的病理机制及调节异常。解剖神经轴后，迅速将分离出的动物躯干转移至解剖显微镜下的充氧解剖皿中，将组织背侧朝上放置，头端朝向解剖皿前方。用固定针在肩部及脊髓最尾端处固定组织，沿顶骨缝在颅骨上做正中矢状切口，以避免损伤颅骨下方的大脑皮层和脑干。从矢状缝开始，向两侧剪开枕骨缝，形成骨瓣，将其翻折并用针固定，以锚定和稳定颅骨的头端部分。将两侧颅骨瓣翻折后，切除其余的大脑皮层，保留小脑后部相对完整，以便进行背侧椎板切除术。使用微型弹簧剪和镊子去除颅骨及脊柱周围的肌肉组织。去除肋笼背侧的组织，保留肋骨完整，并小心剪除外侧的椎弓突起。切除覆盖在脑桥和延髓上方的所有组织后，小脑蚓部、小脑、脑桥以及脊髓起始部分将清晰可见。进行腹侧椎板切除时，将组织背侧朝下放置，并在肋骨和脊柱最尾端处用针固定。利用颅骨瓣将组织的头端固定住，随后去除肋骨的腹侧一半，包括胸骨及所有腹腔器官。剥离附着在肋骨上的软组织，以暴露肋骨和脊髓，并移除舌、食管、气管、喉以及覆盖在颅底和脊柱上方的所有其他软组织和肌肉。为辨认硬腭，请解剖覆盖在颅底这块矩形骨板上的组织，该骨板包含一个V形凹陷。然后沿硬腭中线切开，小心向上提起组织，并进行横向切割以将其移除。开始腹侧椎板切除术时，先去除椎板，暴露从第一颈椎至大约第七胸椎水平的脑干腹侧表面及脊髓。沿椎板两侧的脊柱剪开5至10毫米。当脊髓暴露后，沿脊柱向大约T7水平，在两侧各剪断约20至25毫米长的根丝。用钩状或弯头镊子小心提起C1、C2和C3的头侧边缘，以便在骨下方进行剪切，从而移除这三个椎骨。当所需长度的脊髓已从椎管中分离后，进行横向切断，以取下脊髓组织。去除硬脑膜后，将脑干置于塑料切块上石蜡平台的中央，使用长度不超过一厘米的细昆虫针，从脑干尾端经远端脊髓将其固定。然后将带有固定脑干的石蜡包埋切块对准振动切片机（Vibratome）切块架，使刀片切割方向垂直于脑干的头端表面。接下来，先进行一次初步切片，去除组织最前端200至300微米的不平整多余组织，并根据需要进行微调，以确保PARP线性对齐，并进行小范围修切以去除任何不平整的组织。舌咽神经根丝将在脑干的外侧边缘变得可见，从这些吻侧神经解剖标志处切取一块300至500微米厚的脑干组织，以包含前包钦格复合体及其相关传导通路。切片过程中的所有步骤对于制备出可重复且具有活性的脑片至关重要，必须确保所有必要的神经环路结构处于正确方向，以产生稳定的节律。采用此方法可在薄切片中完整保留生成和传递吸气节律所必需的最简神经环路元件。包括前包钦格复合体、投射至舌下神经运动神经元的前运动神经元以及舌下神经根丝。前包钦格复合体、舌下神经（第12对脑神经）根丝和C4神经根丝可用于记录吸气相活动。该操作的关键在于仔细分离根丝，并在切出最后一片脑片前确认脑干未受损伤。采用此方案后，可使用膜片钳技术、细胞外记录或吸电极来记录神经网络产生的电活动。以往发表的实验方案很少提供详细的逐步操作说明，导致新研究人员难以直接应用该方法，往往需要前往其他实验室，跟随经验丰富的研究人员学习一段时间才能掌握。

preparation-rhythmically-active-vitro-neonatal-rodent-brainstem

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

头脊髓和薄片体外制备心律失常活性

来自胚胎啮齿类动物大脑的器官型脑片培养被广泛用于研究大脑发育。尽管在体系统常常具有一些优势，……...

E18 大鼠脑组织器官型切片培养

本方案描述了一种针对出生后大脑优化的器官型脑片实验方法，可用于对嗅束迁移流中神经母细胞迁移进行高分辨率的时间推移成像。...

一种用于出生后大脑神经元迁移高分辨率延时成像的器官型脑片实验方法

本实验方案旨在建立并维持一种新皮层脑片的器官型培养体系，以便对锥体神经元进行电生理记录。...

从新皮层脑片培养标本进行全细胞记录

介绍了一种从E12.5小鼠胚胎中脑制备器官型脑片的方法。这些器官型脑片培养物可用于观察多巴胺能神经元或其他腹侧中脑神经元的行为。...

胚胎腹侧中脑组织切片培养：一种体外研究多巴胺能神经元发育的体系 in vitro

本视频演示了对新生啮齿类动物离体脑干-脊髓标本进行的电生理记录。将标本置于记录槽中，在含氧和缺氧条件下，通过脊髓的第四腹根记录来自脑干的吸气爆发活动。...

新生啮齿类动物脑干-脊髓标本的电生理记录

中枢呼吸驱动位于脑干。通过在第四腹根放置电极，可记录离体脑干-脊髓自发产生的呼吸运动输出。该实验方法对于研究药物作用、评估呼吸挑战以及遗传操作对节律性运动行为的影响具有重要价值。...

对新生啮齿类动物离体脑干-脊髓标本进行电生理记录可实现神经呼吸网络输出信号的监测

我们展示了如何制备幼鼠脊髓的斜切片。该制备方法可用于刺激腹根。...

斜向脊髓切片的制备用于腹根刺激

在此，我们描述了在 substantia gelatinosa (SG) 神经元中进行全细胞膜片钳记录的关键步骤 体外...

脊髓胶状质神经元全细胞膜片钳记录用急性脊髓切片的制备

整合神经元对多种突触输入的响应，最佳方法是采用一种能够保留所有突触前核团、以维持自然时序和环路可塑性的实验体系；然而，脑片通常会切断大量连接。我们开发了一种改良的脑片制备方法，可在保持体外实验可行性的同时，模拟体内环路的活动状态。...

体外楔形脑片制备以模拟体内神经元环路连接

本文介绍了一种获取鸡胚非冠状位听觉脑干切片的实验方案，用于在单个脑干切片中研究听觉频率拓扑特性（tonotopic...

切片胚胎鸡听觉脑干以评估音调拓扑梯度与微环路

学习啮齿动物脑干切片制备技术，用于电生理记录延髓呼吸神经网络。该方法可稳定捕获pre-Bötzinger复合体及节律性神经活动，助力研究呼吸控制的神经机制与病理模型。

新生啮齿类动物脑干-脊髓节律性活动体外制备及薄片制备

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