利用HiBiT CRISPR细胞系进行靶向蛋白降解化合物的高通量细胞谱型分析

该方法可用于细胞内蛋白质降解的监测以及降解剂化合物的快速筛选。可在细胞环境中以高度灵敏且定量的方式监测降解动力学，从而准确确定关键的降解参数。这些方法支持对降解剂化合物活性进行高通量筛选分析，有助于在早期治疗发现阶段进行化合物的优先级筛选。

它们还为希望研究内源性靶标水平调节（无论是上调还是下调）的人员提供了重要参考。本实验操作将由我实验室的研究科学家 Celia Bisbach 演示。首先准备并接种哺乳动物贴壁细胞或悬浮细胞。

将细胞密度调整至每毫升2.22 × 10⁵个细胞，并将细胞接种至培养板中，每种实验组和对照组条件至少设置三个孔。用100% DMSO配制系列稀释的PROTAC或降解剂测试化合物板，浓度为1000倍储备液。然后用细胞培养基将其稀释至10倍终浓度。

向培养基中加入等体积的DMSO，以制备无化合物的DMSO对照。将适量的10倍浓度化合物或对照溶液加入板中的细胞，于37°C、5%二氧化碳条件下孵育培养板。为检测终点荧光信号，按每1毫升裂解缓冲液中加入20微升裂解底物和10微升LgBiT蛋白的比例配制2倍浓度的裂解检测试剂。

为所有待检测的孔准备足够的试剂，并额外增加一定体积以弥补移液误差。将制备好的裂解检测试剂加入细胞中，然后在微量板涡旋混合器上以350 RPM的速度振荡混匀10至20分钟。使用能够读取96孔或384孔板的发光仪检测发光信号。

若使用细胞活力多重检测，应在加入裂解试剂之前进行。在预定终点测量前 30 至 40 分钟，通过将 10 微升底物加入 2 毫升检测缓冲液中，配制 6 倍浓度的细胞活力检测试剂溶液。将配制好的试剂加入孔板中，并在微量板涡旋混合器上短暂混匀。

然后将培养板置于37摄氏度培养箱中孵育30分钟。在预期的时间点，使用能够检测96孔或384孔板荧光信号的仪器测定荧光值。按照前述方法配制2倍裂解试剂。

然后将试剂加入孔板中，并在微量孔板涡旋混合器上混匀10至20分钟。混匀后，使用化学发光仪测量发光信号。为展示单浓度终点裂解降解分析，将多种CDK靶蛋白通过内源性标记HiBiT，并用基于cereblon的广谱激酶PROTAC TL12-186进行处理。

在不同时间点检测了CDK蛋白水平，并确定了相对荧光素酶单位（RLU）的分数值。为了了解CDK蛋白在蛋白降解程度上的直接比较情况，将相对荧光素酶单位（RLU）分数值计算为总降解百分比。通过在内源性位点对BET家族成员蛋白进行HiBiT标记，并在稳定表达LgBiT蛋白的HEK293细胞中进行动力学降解分析。

随后用三种不同浓度的广谱BET PROTACs处理细胞，包括基于cereblon的dBET6和基于VHL的ARV-771。此处显示的是稳定表达LgBiT蛋白的Ikaros IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat细胞在四种不同分子胶化合物处理下的动力学剂量反应降解曲线。

不同化合物之间以及不同浓度系列之间的降解反应存在显著差异。为定量评估降解效果并对化合物进行排序，利用剂量反应曲线计算了关键的降解参数，包括降解速率、最大降解程度（degradation maximum）和 Dmax50 值。细胞活力多重检测结果显示，在所测试的浓度下，细胞活力未见下降。

本方案中最关键的步骤是通过归一化至DMSO对照来确定相对发光单位（RLU）的分数值或降解百分比。按照本方案，可进一步开展表型检测，以研究特定蛋白质的缺失如何影响细胞健康或功能。此外，这些HiBiT细胞系还可结合NanoBRET技术用于研究蛋白质相互作用或小分子结合。