使用 HiBiT CRISPR 细胞系对靶向蛋白质降解化合物进行高通量细胞分析
November 9th, 2020
该协议描述了活细胞中蛋白质降解动力学的定量发光检测，这些活细胞已使用CRISPR / Cas9进行工程设计，以表达融合到目标蛋白质的无抗体内源性蛋白质检测标签。包括计算和获取定量降解参数、速率、Dmax、DC 50 和 Dmax50 的详细说明。
这种方法允许对蛋白质降解进行细胞监测和快速筛选降解剂化合物。可以在细胞环境中以高度灵敏和定量的方式监测降解动力学，从而准确测定关键降解参数。这些方法允许对降解剂化合物活性进行 HTS 分析，从而在早期治疗发现阶段进行分类。
它们还为任何想要研究内源性靶标水平调节（无论是增加还是减少）的人提供见解。演示该程序的是我实验室的研究科学家 Celia Bisbach。首先准备和接种哺乳动物贴壁或悬浮细胞。
将细胞密度调整为每毫升 10 至第 5 个细胞的 2.22 倍，并将它们分配到每个实验和对照条件下至少三个孔的板中。在 100% DMSO 中以 1000x 浓度制备连续稀释的 PROTAC 或降解剂测试化合物板。然后在细胞培养基中将其稀释至 10 倍终浓度。
向培养基中加入等体积的 DMSO，以制备无化合物 DMSO 对照。向板中的细胞中加入适量的 10x 化合物或对照溶液，并在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中孵育板。为了测量终点发光信号，通过为每 1 毫升裂解缓冲液添加 20 μL 裂解底物和 10 μL LgBiT 蛋白来制备 2x 裂解检测试剂。
为所有要检测的孔准备足够的试剂，包括额外的体积以解决移液误差。将制备好的裂解检测试剂添加到细胞中，并在微孔板涡旋混合器上以 350 RPM 的速度混合板 10 至 20 分钟。在能够读取 96 或 384 孔板的发光仪上测量发光。
如果使用细胞活力多路检测，请在添加裂解试剂之前进行。在所需终点测量前 30 至 40 分钟，将 10 μL 底物添加到 2 mL 检测缓冲液中，制备 6x 细胞活力检测试剂溶液。将制备的试剂加入孔中，并在微孔板涡旋混合器上短暂混合。
然后将板在 30 摄氏度的培养箱中孵育 37 分钟。在所需的终点，在能够读取 96 或 384 孔荧光的仪器上测量荧光。如前所述准备 2x 裂解试剂。
然后将试剂加入孔中，并在微孔板涡旋混合器上混合板 10 至 20 分钟。混合后，使用发光计测量发光。为了证明单浓度终点裂解降解分析，用 HiBiT 内源性标记了几种 CDK 靶蛋白，并用基于泛激酶脑的 PROTAC TL12-186 处理。
在不同时间点测量 CDK 蛋白水平，测定分数 RLU。为了了解 CDK 蛋白在蛋白质损失方面如何直接相互比较，将分数 RLU 计算为总降解百分比。通过用稳定表达 LgBiT 蛋白的 HiBiT 和 HEK293 细胞内源性标记 BET 家族成员蛋白进行动力学降解分析。
然后用三种不同浓度的 pan-BET PROTAC 处理细胞。基于 cereblon 的 dBET6 和基于 VHL 的 ARV-771。这里显示了用四种不同分子胶化合物处理稳定表达 LgBiT 蛋白的 Ikaros IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat 细胞的动力学剂量反应降解曲线。
观察到化合物之间以及整个浓度系列的降解响应存在显著差异。为了定量评估化合物的降解和排名顺序，使用剂量反应曲线来计算关键降解参数，包括降解速率、降解最大值和 Dmax50 值。细胞活力多重检测显示，在测试的浓度下，细胞活力没有损失。
该协议中最重要的步骤是通过归一化到 DMSO 对照来确定分数 RLU 或降解百分比。按照此方案，可以进行表型测定以了解特定蛋白质的丢失如何影响细胞健康或功能。此外，这些 HiBiT 细胞系还可用于使用 NanoBRET 技术研究蛋白质相互作用或小分子结合。
概述
该协议概述了一种使用CRISPR/Cas9技术定量检测活细胞中蛋白质降解动力学的方法。它提供了计算降解参数（如速率和Dmax）的详细说明。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 蛋白质降解
- CRISPR/Cas9技术
背景
- 了解蛋白质降解对细胞健康至关重要。
- CRISPR/Cas9允许精确的基因修饰。
- 监测降解可以帮助发现治疗方法。
- 定量方法提高了降解研究的准确性。
研究目的
- 开发一种监测活细胞中蛋白质降解的协议。
- 实现降解化合物的高通量筛选。
- 提供对内源性蛋白质水平调节的见解。
使用的方法
- 在特定密度下准备和培养哺乳动物细胞。
- 对PROTAC化合物进行串行稀释以进行测试。
- 使用发光检测试剂来测量降解。
- 从发光数据计算降解参数。
主要结果
- 成功监测了活细胞中蛋白质降解动力学。
- 识别了化合物间降解反应的显著差异。
- 定量评估了降解率和最大降解值。
- 在实验过程中未观察到细胞活力的损失。
结论
- 该协议促进了蛋白质降解动力学的研究。
- 它可以用于评估蛋白质丧失对细胞功能的影响。
- HiBiT标记的细胞系对于研究蛋白质相互作用很有用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantitative, high-throughput assessment of targeted protein degradation in physiologically relevant cellular contexts, supporting early triage of degrader compounds. By maintaining endogenous expression and regulation of target proteins, it provides predictive confidence in lead optimization and reduces mechanistic ambiguity in discovery pipelines. The approach directly informs go/no-go decisions by linking compound-induced target degradation to measurable phenotypic outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of target protein loss in native cellular environments.
- Operational Value: Supports functional target validation by quantifying degradation kinetics and potency under physiological regulation.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating degradation rate, Dmax, and DC50 parameters for lead prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: CRISPR-engineered HiBiT cell lines provide standardized, reproducible systems for luminescent readout of target degradation.
- Multiplexing Capability: Compatible with cell viability assays to distinguish specific target effects from cytotoxicity during screening.
- Scalability: Luminescent signal detection in 96- or 384-well formats enables high-throughput profiling of degrader compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains endogenous protein expression and regulation, improving relevance to in vivo disease models.
- Mechanistic De-risking: Allows correlation of target degradation with functional cellular phenotypes, supporting biomarker-aligned advancement decisions.
- Predictive Confidence: Quantitative degradation profiling reduces late-stage failure risk by confirming target engagement in relevant cellular backgrounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows following target identification and preceding lead optimization, providing degradation-competent cellular systems for compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling real-time or endpoint measurement of target protein degradation in live cells.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (rate, Dmax, DC50) for high-throughput evaluation of degrader compound libraries.
- Analytics: Generates normalized degradation metrics that allow cross-compound comparison and rank-ordering based on target engagement.
- Translational Research: Connects target degradation to functional outcomes via multiplexed viability assays, informing risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: HiBiT-tagged cell lines serve as reusable assets across multiple projects targeting different proteins or degradation mechanisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target modulation, reduces mechanistic ambiguity, and enables functional target validation.
- Operational Value: Ensures assay standardization, reproducibility, and scalability across screening campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, enhances capital efficiency, and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of degrader leads based on quantitative degradation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR/Cas9 genome editing and clonal cell line development.
- Dependent on luminescent plate readers capable of 96- or 384-well format detection.
- Necessitates standardization of cell plating density and reagent preparation across wells.
- Adaptation considerations include varying endogenous expression levels and subcellular localization of target proteins.
- Practical limitations include signal dynamic range constraints in highly abundant or rapidly turning over target proteins.
