使用 HiBiT CRISPR 细胞系对靶向蛋白质降解化合物进行高通量细胞分析

这种方法允许对蛋白质降解进行细胞监测和快速筛选降解剂化合物。可以在细胞环境中以高度灵敏和定量的方式监测降解动力学，从而准确测定关键降解参数。这些方法允许对降解剂化合物活性进行 HTS 分析，从而在早期治疗发现阶段进行分类。

它们还为任何想要研究内源性靶标水平调节（无论是增加还是减少）的人提供见解。演示该程序的是我实验室的研究科学家 Celia Bisbach。首先准备和接种哺乳动物贴壁或悬浮细胞。

将细胞密度调整为每毫升 10 至第 5 个细胞的 2.22 倍，并将它们分配到每个实验和对照条件下至少三个孔的板中。在 100% DMSO 中以 1000x 浓度制备连续稀释的 PROTAC 或降解剂测试化合物板。然后在细胞培养基中将其稀释至 10 倍终浓度。

向培养基中加入等体积的 DMSO，以制备无化合物 DMSO 对照。向板中的细胞中加入适量的 10x 化合物或对照溶液，并在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中孵育板。为了测量终点发光信号，通过为每 1 毫升裂解缓冲液添加 20 μL 裂解底物和 10 μL LgBiT 蛋白来制备 2x 裂解检测试剂。

为所有要检测的孔准备足够的试剂，包括额外的体积以解决移液误差。将制备好的裂解检测试剂添加到细胞中，并在微孔板涡旋混合器上以 350 RPM 的速度混合板 10 至 20 分钟。在能够读取 96 或 384 孔板的发光仪上测量发光。

如果使用细胞活力多路检测，请在添加裂解试剂之前进行。在所需终点测量前 30 至 40 分钟，将 10 μL 底物添加到 2 mL 检测缓冲液中，制备 6x 细胞活力检测试剂溶液。将制备的试剂加入孔中，并在微孔板涡旋混合器上短暂混合。

然后将板在 30 摄氏度的培养箱中孵育 37 分钟。在所需的终点，在能够读取 96 或 384 孔荧光的仪器上测量荧光。如前所述准备 2x 裂解试剂。

然后将试剂加入孔中，并在微孔板涡旋混合器上混合板 10 至 20 分钟。混合后，使用发光计测量发光。为了证明单浓度终点裂解降解分析，用 HiBiT 内源性标记了几种 CDK 靶蛋白，并用基于泛激酶脑的 PROTAC TL12-186 处理。

在不同时间点测量 CDK 蛋白水平，测定分数 RLU。为了了解 CDK 蛋白在蛋白质损失方面如何直接相互比较，将分数 RLU 计算为总降解百分比。通过用稳定表达 LgBiT 蛋白的 HiBiT 和 HEK293 细胞内源性标记 BET 家族成员蛋白进行动力学降解分析。

然后用三种不同浓度的 pan-BET PROTAC 处理细胞。基于 cereblon 的 dBET6 和基于 VHL 的 ARV-771。这里显示了用四种不同分子胶化合物处理稳定表达 LgBiT 蛋白的 Ikaros IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat 细胞的动力学剂量反应降解曲线。

观察到化合物之间以及整个浓度系列的降解响应存在显著差异。为了定量评估化合物的降解和排名顺序，使用剂量反应曲线来计算关键降解参数，包括降解速率、降解最大值和 Dmax50 值。细胞活力多重检测显示，在测试的浓度下，细胞活力没有损失。

该协议中最重要的步骤是通过归一化到 DMSO 对照来确定分数 RLU 或降解百分比。按照此方案，可以进行表型测定以了解特定蛋白质的丢失如何影响细胞健康或功能。此外，这些 HiBiT 细胞系还可用于使用 NanoBRET 技术研究蛋白质相互作用或小分子结合。