Name: 中子晶体学数据收集和处理，用于蛋白质结构中氢原子的建模 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 了解中子蛋白质晶体学技术，用于精确定位蛋白质中的氢原子并揭示质子化状态和水分子取向。该方法结合X射线数据进行联合精修，为研究蛋白质反应机制和结合相互作用提供独特的结构生物学见解。

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蛋白质表达、纯化和结晶实验在美国橡树岭国家实验室能源部生物与环境研究用户设施——结构分子生物学中心（CSMB）进行。中子衍射数据在美国橡树岭国家实验室散裂中子源（SNS）的BL-11B MaNDi束线上收集，该设施由美国能源部基础能源科学办公室科学用户设施部门资助。作者感谢Brendan Sullivan在数据处理方面的协助。X射线衍射数据在北卡罗来纳州立大学分子教育、技术与研究创新中心（METRIC）的设施上收集，该中心由北卡罗来纳州政府支持。GCS部分得到了南非国家研究基金会（NRF）以及橡树岭国家实验室研究生机会（GO!）项目的资助。FM得到了美国农业部NIFA哈奇基金211001的资助。

作者无任何利益冲突需要披露。

中子蛋白质晶体学是一种高度敏感的技术，可用于探测蛋白质中的质子化状态和水分子的取向。这些信息有助于阐明蛋白质的催化机制，因为质子化状态的变化以及氢键相互作用通常在酶促化学反应中起核心作用10。尽管中子蛋白质晶体学是一种信息丰富的技术，但在计划开展中子衍射实验之前，仍需考虑若干因素，即：
<ol>
	<li>数据收集对大尺寸蛋白质晶体的需求。</li>
	<li>氢及其他元素（如金属离子）的散射特性。</li>
	<li>使用氘代样品时，结构精修和模型构建软件的局限性。</li>
</ol>
中子蛋白质晶体学是一种受通量限制的技术。与X射线衍射数据相比，由于该技术固有的限制（通量受限、准拉乌埃法、波长较长），中子数据集通常表现出较高的R因子以及较低的完整性、冗余度和信噪比。单帧数据的采集通常需要12–18小时。实验的成功在很大程度上取决于样品的尺寸和质量，晶体尺寸一般需达到0.1 mm3 通常是最低要求3中子衍射需要制备大量蛋白质，以设置体积范围为10至800 μL的结晶液滴。根据晶体和样品参数，可使用体积计算器估算生长足够大晶体所需的最小体积（https://neutrons.ornl.gov/imagine）。目前最常用的方法是通过蒸汽扩散法生长大型晶体。3悬滴结晶法可在10–25 μL的大液滴中促进晶体生长，而使用市售的坐滴结晶装置可设置体积更大、最大约达50 μL的液滴。14,54硅化九孔玻璃板可用于制备体积高达800 μL的较大液滴。这些玻璃板可置于Hampton Research公司提供的商用“三明治盒”中。其他结晶技术包括批量结晶，其液滴尺寸受限于容器的容量。批量结晶实验的设置体积可从微升级别至毫升级别。55也可采用透析法进行结晶，其中蛋白质与沉淀剂通过透析达到平衡。 通过 透析膜，或沿沉淀剂浓度梯度进行对流扩散，或通过多孔塞（如琼脂糖）56,57接种是获得所需体积晶体的另一种替代方法。微接种和宏接种已成功用于大晶体的生长，包括大体积晶体的生长。 NcLPMO9D45了解蛋白质相图的一些知识，包括温度对溶解度的影响，有助于大晶体的生长。
在规划中子衍射实验时，优化蛋白质制备以在衍射数据收集中最大化信噪比至关重要7。为避免氢原子（H）引起的密度抵消和高强度非相干散射，可通过将H原子替换为其同位素氘（D）来改善中子散射长度密度（SLD）图谱，因为D具有正的相干散射长度和较低的非相干散射长度。为此，需将氢化蛋白质晶体与氘代结晶缓冲液进行气相交换，从而实现溶剂分子以及蛋白质中可交换、可滴定的H原子的H/D交换23。气相交换操作是将氢化晶体置于石英毛细管中，并加入基于D2O的&#160;氘代结晶缓冲液“塞段”，该方法是一种高效且温和的技术，应用最为广泛14,23,35。该交换过程可能需要数周时间，且最好定期更换氘代缓冲液，以确保最大程度的H/D交换。此外，也可通过将晶体直接浸泡于氘代缓冲液中实现H/D交换。为避免晶体因暴露于D2O而受到应力影响，应逐步提高D2O:H2O比例完成浸泡过程58。除此之外，也可在氘代缓冲液中对氢化蛋白质进行结晶，以实现可交换H位点的H/D交换22,59。然而需要注意的是，基于D2O的缓冲液会影响蛋白质的溶解度，因此需要对已知的H2O体系条件进行进一步调整3,59。在某些情况下，基于D2O的缓冲液还可能导致晶体尺寸减小59。通过在氘代培养基中表达蛋白质，可实现可滴定H原子及碳键合H原子完全被D取代，从而获得全氘代样品20。全氘代样品所得的中子SLD图谱将显著改善，不再出现氢化样品对应的密度抵消现象。这对于表征蛋白质或辅因子中非可交换位点上的H/D分布具有重要意义。然而，全氘代蛋白质的表达成本高且产率低60。美国橡树岭国家实验室（ORNL）结构分子生物学中心（CSMB）为需要制备全氘代样品的用户提供氘代设施（https://www.ornl.gov/facility/csmb）。全氘代表达通常在1升规模的生物反应器中进行，可获得约50毫克纯化蛋白61。
在收集完中子衍射数据后，需进行精修和交互式模型构建。精修可使用多种软件套件完成，包括 phenix.refine、nCNS 或 SHELXL28,31,32,33。其中，Phenix 套件是最常用于中子衍射数据精修的软件，通常与 Coot 联合使用，后者用于根据中子散射长度密度（SLD）图手动构建模型34。尽管 Phenix 和 Coot 均支持中子衍射数据的处理，但它们可能缺乏处理中子数据特有特征及氘代样品所需的部分功能。例如，Coot 不包含针对氘代残基的几何优化参数，这可能导致模型构建过程中出现困难，因为“实空间精修”功能会导致残基结构“爆炸”（补充图26）62。该问题可通过为所有氘代残基生成约束文件来解决，但这一过程极为繁琐，且目前尚无公开可用的此类参数库。在 Phenix 中进行精修时，可交换的 H/D 位点初始占据率通常设为 H 和 D 各占 0.50。随着精修的进行，H 和 D 的占据率将根据中子 SLD 图进行优化。在交互式模型构建过程中，差值密度 Fo-Fc 图对于评估 H/D 占据率具有重要参考价值。这些图可用于判断哪些位点具有较高的 D 占据率，这在活性位点尤其重要，因为其质子化状态与催化功能密切相关63。然而，当 H:D 占据率接近 0.70:0.30 时，会出现难以判断的情况，此时中子 SLD 图中信号完全抵消64。还应注意，准劳厄中子数据集的完整性通常约为 80%，低于 X 射线衍射数据中常见的 ≥ 98%。因此，在 Phenix 中精修中子衍射数据时，缺失的观测振幅（Fo）会由模型计算补充，以完成反射列表，但这可能引入模型偏差。为避免此类潜在偏差，在交互式模型构建过程中应查看“无填充”（no_fill）图，而非“已填充”（filled）图。
用户可以选择对结构进行联合X射线/中子数据精修，或仅使用中子数据进行精修。观察中子散射长度密度（SLD）图时，特别是在较低分辨率下，可能会感到困惑，尤其是对于氢化蛋白质而言，尽管经过H/D气相交换，非可交换位点上的氢（H）仍然存在。这会导致中子密度图出现抵消现象，从而呈现出不连续的图谱假象。65,66收集相应的X射线数据集有利于在联合精修中补充这些抵消效应图13A 和 图13B通常采用联合精修策略，即利用X射线数据精修蛋白质主链坐标，同时利用中子衍射数据精修可交换位点上氢/氘原子的位置和占据率28由于在可交换位点引入H/D占据会增加精修参数的数量，因此与X射线数据联合精修也会提高数据点与参数的比例。联合精修需要在同一晶体或相同条件下培养的晶体上，在相同温度下收集相应的X射线数据集。对于在室温（300 K）下收集的中子衍射数据，应采用低剂量数据收集策略在室温下收集相应的X射线数据集，以限制辐射损伤。相比之下，全氘代样品由于不存在同等程度的H/D信号抵消，可提供更优且连续的中子散射长度密度（SLD）图。然而，某些元素（包括金属和硫）的中子散射长度导致它们在中子SLD图中可见性较差，即使蛋白质已经实现全氘代图13C-F)18如果需要对金属进行表征，最好采用X射线衍射进行联合精修，或结合光谱学技术以补充衍射实验。当中子数据集具有高分辨率，或使用了全氘代蛋白质时，通常可进行仅基于中子数据的精修。此外，若研究的蛋白质对辐射损伤高度敏感，则仅使用中子数据精修尤为有利，因为X射线解析的结构可能包含辐射诱导的人工假象。如果计划仅基于中子数据进行精修，必须确认相应的中子数据集具备足够的完整性和分辨率。
ORNL 提供两个用于收集中子衍射数据的设施：位于 HFIR 的 IMAGINE 光束线以及位于 SNS 的 MaNDi 光束线36,67。尽管这两种仪器均基于相似原理有效收集中子衍射数据集，但在申请机时前，应考虑每种仪器独特的技术参数。IMAGINE 收集准劳厄（quasi-Laue）数据，专为在晶胞尺寸达约 100 Å 的晶体上进行室温数据收集而优化。MaNDi 可用于在晶胞尺寸达约 300 Å 的晶体上，采用飞行时间-劳厄（TOF-Laue）方法收集室温和低温数据。在收集完整数据集之前，需对晶体进行测试，以评估所获得衍射图样的质量，该测试中晶体仅暴露于中子束下采集单帧数据。若晶体质量足够好，则将收集完整的中子衍射数据集，并进行指标化、积分、标度校正与合并，此过程类似于X射线数据处理。IMAGINE 使用 Lauegen 和 Lscale 软件，而 MaNDi 则采用 Mantid 软件包并应用三维轮廓拟合技术48,50,51,68,69,70。在任一设施注册成为用户的科研人员，最终将获得以 MTZ 或 HKL 格式提供的数据集，用于后续分析。
中子衍射是一种非破坏性、高灵敏度的技术，可用于探测生物大分子的质子化状态及氢键相互作用，尤其适用于光敏感蛋白和金属蛋白的研究。在应用该技术及处理数据时，需考虑若干关键因素。&#160;在开展实验之前，其结果可能为理解目标蛋白的催化机制提供有价值的见解。中子蛋白晶体学可与计算、结构、生物化学及光谱学研究相互补充，成为生物学家表征生物大分子所用技术工具箱中有价值的工具。

中子大分子晶体学是一种能够揭示蛋白质结构及其内在化学特性的独特技术。该技术在概念上与X射线衍射相似，中子衍射同样可提供大分子结构的原子级细节；然而，中子与原子核的相互作用使得轻元素原子（通常在X射线衍射中难以检测）得以精确定位1。在X射线衍射过程中，X射线由电子云散射，导致氢（H）等轻原子在分辨率未接近亚埃级（sub-Ångström）的电子密度图中难以清晰显现2。相比之下，中子的散射强度取决于其与原子核之间复杂的相互作用，同一元素的不同同位素具有不同的散射长度。因此，在中子散射长度密度（SLD）图中，轻原子及其同位素（如氢（1H）和氘（2H 或 D））的可见性与蛋白质骨架中的碳、氮和氧原子相当。此外，由于中子散射强度与电子数目无关，当轻元素与重元素彼此靠近时，其散射信号不会像X射线散射那样被重元素掩盖。利用中子衍射时，氢（H）及其同位素氘（D）的可见性显著增强，这为了解催化关键残基、辅因子和配体的质子化状态提供了重要信息，同时有助于确定水分子的取向，从而揭示催化机制和蛋白质化学的关键细节3。中子衍射还具有一项优势，即它是一种非破坏性技术，特别适用于对电离敏感的生物样品，例如含有金属中心或光敏氧化还原辅因子的蛋白质2。本文的主要目的是概述获得高质量中子蛋白质晶体&#160;结构的完整工作流程&#160;。我们建议感兴趣的读者参考 Podjarny 等人4、 Blakeley5、 Blakeley 等人6 以及 O‘Dell 等人3 关于中子蛋白质衍射的优秀综述，以及 Ashkar 等人7 关于中子散射进一步应用的文献。
中子主要通过核反应中的两种过程产生：反应堆源中的核裂变或加速器源中的散裂反应8。反应堆源通过235U同位素的核裂变产生连续中子束，而散裂中子源则通过质子轰击靶材（例如液态金属汞）产生脉冲中子束9。位于美国田纳西州橡树岭的橡树岭国家实验室（ORNL）同时拥有一个稳态中子源——高通量同位素反应堆（HFIR），以及一个60 Hz脉冲中子源&#160;——散裂中子源（SNS）。位于HFIR的IMAGINE光束线是一种专为生物大分子优化的中子衍射仪（补充图1）10。IMAGINE采用中子成像板探测器，利用2.8–4.5 Å范围内的窄带通，测量晶胞边长&#60;150 Å的单晶的准劳厄衍射数据。位于SNS的Macromolecular Neutron Diffractometer（MaNDi）是一种飞行时间（TOF）劳厄中子衍射仪，配备球形探测器阵列框架（DAF）（补充图2）11。MaNDi通过在2.0–6.0 Å范围内调节2 Å的波长带宽，测量晶胞边长为10–300 Å的单晶衍射数据12。
中子的产生过程需要极高的能量，因此与同步辐射源的X射线束流相比，中子束流的通量相对较低13。为了在数据收集中获得足够的信噪比，必须生长出尺寸和质量均合适的晶体14。通常，晶体体积需大于&#62; 0.1 mm3，才能获得具有足够统计精度的数据15。除了通量较低之外，还需考虑中子与样品原子核相互作用的固有特性16。同一种元素的不同同位素对中子的散射长度不同，这一特性可在小角中子散射（SANS）中被有效利用，以屏蔽或突出样品的特定区域，该过程称为反差匹配17。在衍射实验中，氢（1H的相干中子散射长度为-3.741 fm）的负相干散射长度可能导致中子散射密度图中的特征相互抵消，因为其他生物学相关原子的相干中子散射长度均为正值，包括碳（12C为6.6511 fm）、氮（14N为9.37 fm）、氧（16O为5.803 fm）、磷（31P为5.13 fm）和硫（32S为2.804 fm）（表1）12,14。此外，氢的非相干散射长度较大（25.274 fm），会增加数据收集过程中的背景信号，从而影响数据集的质量并降低分辨率7。为克服氢带来的这些限制，在中子衍射实验中必须将氢替换为其同位素氘（2H，D），后者具有正的相干中子散射长度（6.671 fm）和显著更低的非相干散射长度（4.04 fm）19。这一替换可通过全氘代实现，即在完全氘代的培养基中培养表达蛋白的生物体，从而确保氘在所有氢位点上的完全掺入20。也可以仅在可交换位点（可滴定基团）将氢部分替换为氘，而碳键合的不可交换位点仍保留氢21。这可通过在氘代母液中培养含氢的蛋白质晶体来实现22。然而更常见的方法是，在H2O缓冲液中生长出足够大的晶体后，通过气相交换进行H/D交换23。在此类情况下，晶体被安装在石英毛细管中，并与基于D2O的&#160;母液进行气相平衡。
中子源的中子通量有限，导致数据收集时间较长，通常从数天到数周不等24。在橡树岭国家实验室（ORNL），IMAGINE 和 MaNDi 均采用 2–6 Å 范围内的窄波长带通，以优化数据收集25。数据可在室温&#160;或低温条件下收集。低温数据收集有可能&#160;提高数据质量，并为捕获催化中间体的冻结状态提供可能。在完成中子衍射数据收集后，通常会在同一晶体上、在相同温度下，或在相同条件下生长的另一晶体上收集一套X射线数据集26。在相同温度下进行数据收集，可使结构精修同时基于X射线和中子数据进行，从而避免因温度变化可能引起的假象，例如水分子可见性与位置的变化，或具有交替构象的残基占据率的变化27。联合X射线与中子数据精修可提高数据与参数的比例，并具有如下优势：利用X射线数据精修蛋白质主链坐标，同时利用中子衍射数据精修氢/氘（H/D）原子的位置28。当使用部分氘代样品时，这种方法尤为有用，因为此时蛋白质非可交换位点上的氢原子会导致散射密度抵消现象&#160;。尽管蛋白质数据库（PDB）中收录的X射线结构数量远超中子结构，但最初为X射线数据精修设计的软件包现已扩展支持中子数据的处理3,29,30。数据收集完成后，可使用如 phenix.refine、CNSsolve（nCNS）或 SHELXL 等精修程序对模型进行精修28,31,32,33。在精修过程中，可使用 COOT 手动拟合中子散射密度图34。结构解析完成后，坐标文件以及中子和/或X射线衍射&#160;数据文件可提交至PDB，由其进行验证并存档，供公众访问18,29,30。
蛋白质的结构分析是一种多层面的方法，其中采用多种技术来探究其功能与作用机制35中子蛋白质晶体学可提供有价值的化学信息，以拓展和补充来自X射线等其他研究的发现&#160;衍射，光谱学，核磁共振（NMR）或微晶电子衍射（microED）36中子蛋白质衍射技术在揭示酶促反应机制方面具有独特优势，因为氢原子在其化学过程中起着核心作用。中子不会引起辐射损伤，因此特别适用于金属蛋白的研究。37. 本文展示了一个从样品制备到数据收集、精修与分析的中子蛋白质衍射过程的代表性实例（图1已培养出尺寸足以进行中子衍射实验的金属蛋白晶体 Neurospora crassa LPMO9DNcLPMO9D NcLPMO9D 是一种含铜的金属蛋白，通过在糖苷键处插入氧原子来参与难降解纤维素的降解过程38,39。该 NcLPMO9D 活性位点包含一个单核铜中心，该中心位于特征性的“组氨酸支架”结构中，由N端组氨酸和另一个保守的组氨酸组成补充图3)40真菌LPMO的N端会发生甲基化，但这种翻译后修饰在酵母中进行重组表达时不会发生。在 NcLPMO9D 静息态中，铜中心以 Cu 形式存在2+ 氧化态，并通过单电子还原激活为 Cu1+，使分子氧能够结合并被快速还原为超氧物种而得以活化41,42整体 NcLPMO9D 反应需要进一步添加一个电子和两个质子，以形成羟基化的多糖产物43负责从多糖底物中夺取氢原子（HAA）的活性氧物种的身份尚未确定，目前正在进行深入的结构与计算研究。44,45. 鉴于该处的氧化还原化学反应 NcLPMO9D 活性位点，减轻辐射损伤尤为关键。本文展示了室温与低温条件下的数据收集 NcLPMO9D 晶体以确定 NcLPMO9D&#160;静息状态和活动状态下的结构&#160;活化的还原形式，分别46重点将放在蛋白质晶体安装、用于数据收集的线站仪器设置、数据和坐标文件的准备，以及构建全原子中子结构模型所必需的精修步骤。

<table><tbody><tr><td>吸水纸尖，规格 #30-#40，长度 60 mm</td><td>DiaDent/DiaVet</td><td>218-292</td><td></td></tr><tr><td>毛细管蜡</td><td>Hampton</td><td>HR4-328</td><td></td></tr><tr><td>CCP4</td><td></td><td>版本 7.0.077</td><td></td></tr><tr><td>锥形离心管（15 mL）</td><td>Corning</td><td>CLS430790</td><td></td></tr><tr><td>锥形离心管（50 mL）</td><td>Corning</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>Coot</td><td></td><td>版本 0.8.9.2</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap ALS</td><td>Hampton</td><td>HR4-779</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Mitegen</td><td>TW-CTF-1</td><td></td></tr><tr><td>氯化氘溶液，35 wt. % 溶于 D2O，&amp;ge;99 atom % D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>543047</td><td></td></tr><tr><td>重水，99.9 atom % D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>双厚度 MicroLoops 1000 &amp;micro;m</td><td>Mitegen</td><td>M5-L18SP-1000</td><td></td></tr><tr><td>FiveEasy pH 计 F20-Std-Kit</td><td>Mettler Toledo</td><td>30266626</td><td></td></tr><tr><td>泡沫杜瓦瓶标准容器 800 ml</td><td>Spearlab</td><td>M-FD-800</td><td></td></tr><tr><td>四色固定用黏土</td><td>Hampton</td><td>HR4-326</td><td></td></tr><tr><td>HEPES，BioUltra 级，分子生物学用，&amp;ge;99.5% (T)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>配备 EIGER 4M 探测器的高通量旋转阳极 X 射线衍射仪</td><td>Rigaku, Oxford Cryostream 和 Dectris</td><td>XtaLAB Synergy-R</td><td>实验室用 X 射线衍射仪</td></tr><tr><td>直型磁力棒</td><td>Mitegen</td><td>M-R-1013198</td><td></td></tr><tr><td>微量加样器吸头，用于填充 Femtotips 及其他玻璃毛细管（仅供研究使用），0.5 &amp;ndash; 20 &amp;micro;L，100 mm，浅灰色，192 个（2 架 &amp;times; 96 个）</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，容积 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>Z606340</td><td></td></tr><tr><td>带透明盖的培养皿，直径 100 mm</td><td>Fischerbrand</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Phenix</td><td></td><td>版本 1.14-3260</td><td></td></tr><tr><td>夹针钳，18 mm</td><td>Mitegen</td><td>M-R-1013196</td><td></td></tr><tr><td>移液器，容积 0.1–2.5 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf Research</td><td>Z683779</td><td></td></tr><tr><td>移液器，容积 100–1000 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf Research</td><td>Z683825</td><td></td></tr><tr><td>移液器，容积 10–100 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf Research</td><td>Z683809</td><td></td></tr><tr><td>移液器，容积 20–200 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf Research</td><td>Z683817</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇 BioXtra 级，平均分子量 3,350，粉末状</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4338</td><td></td></tr><tr><td>石英毛细管，内径 1.00 mm，长度 80 mm</td><td>Hampton</td><td>HR6-146</td><td>薄壁毛细管</td></tr><tr><td>研究用体视显微镜系统</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>可重复使用 B3 型（SSRL/SAM 风格）测角仪底座</td><td>Mitegen</td><td>GB-B3-R</td><td></td></tr><tr><td>圆形微型中空玻璃管（VitroTubes），透明熔融石英，内径 1.00 mm，长度 100 mm</td><td>VitroCom</td><td>CV1012</td><td>厚壁毛细管</td></tr><tr><td>带盖三明治盒</td><td>Hampton</td><td>HR3-132</td><td></td></tr><tr><td>硅化 9 孔玻璃板</td><td>Hampton</td><td>HR3-134</td><td></td></tr><tr><td>坐滴结晶板（24 大孔）</td><td>Mitegen</td><td>XQ-P-24S-A</td><td></td></tr><tr><td>氘氧化钠溶液，40 wt. % 溶于 D2O，99 atom % D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>176788</td><td></td></tr><tr><td>厚型硅化圆形盖玻片（22 mm × 0.96 mm）</td><td>Hampton</td><td>HR3-247</td><td></td></tr><tr><td>通用移液器吸头，0.1–10 &amp;micro;L</td><td>VWR</td><td>76322-528</td><td></td></tr><tr><td>通用移液器吸头，1–100 &amp;micro;L</td><td>VWR</td><td>76322-136</td><td></td></tr><tr><td>通用移液器吸头，100–1000 &amp;micro;L</td><td>VWR</td><td>76322-154</td><td></td></tr><tr><td>通用移液器吸头，20–200 &amp;micro;L</td><td>VWR</td><td>76322-150</td><td></td></tr><tr><td>通用移液器吸头，1–20 &amp;micro;L</td><td>VWR</td><td>76322-134</td><td></td></tr><tr><td>蜡笔</td><td>Hampton</td><td>HR4-342</td><td></td></tr></tbody></table>

中子晶体学数据收集与处理在蛋白质结构中氢原子建模的应用

Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures

中子晶体学是一种结构分析技术，可确定生物大分子中氢原子的位置，从而提供有关质子化状态和水合状态的机制性重要信息，且不会引起辐射损伤。相比之下，X射线衍射仅能提供关于轻原子位置的有限信息，且X射线束&#160;迅速引发光敏物质的辐射损伤&#160;辅因子和金属中心。本文展示了在橡树岭国家实验室（ORNL）的IMAGINE和MaNDi光束线上，获得蛋白质晶体中子衍射结构所采用的工作流程，前提是已获得尺寸合适的蛋白质晶体（&#62; 0.1 mm3) 已经培养完成。我们展示了氢化蛋白的封片方法&#160;用于中子衍射数据收集的石英毛细管中的晶体，以及已安装晶体与D的蒸气交换过程2含氧缓冲液中以确保可交换位点上的氢原子被氘原子取代。氘的引入可降低由氢原子非相干散射引起的背景信号，并避免因其负相干散射长度导致的密度抵消现象。样品取向与室温数据采集策略以高通量同位素反应堆（HFIR）的IMAGINE束线上的准劳厄法数据采集为例进行说明。此外，在散裂中子源（SNS）的MaNDi飞行时间仪器上，展示了晶体安装及在液氮中快速冷冻以捕获不稳定反应中间体的低温数据采集方法。模型坐标文件与衍射数据文件的准备，以及中子散射长度密度（SLD）图的可视化也将予以介绍。最后将讨论仅使用中子数据或联合X射线与中子数据进行结构精修，以获得目标蛋白质的全原子结构。该中子结构解析过程将以溶菌性多糖单加氧酶的晶体为例进行演示。 Neurospora crassa LPMO9D，一种参与难降解多糖降解的含铜金属蛋白 通过 糖苷键的氧化断裂

中子蛋白质晶体学是一种能够定位氢原子的结构分析技术，从而提供有关蛋白质功能的重要机制信息。本文介绍了蛋白质晶体的安装、中子衍射数据收集、结构精修以及中子散射长度密度图分析的工作流程。

中子晶体学是一种结构分析技术，可确定生物大分子中氢原子的位置，从而获得……

中子晶体学是一种用于确定生物大分子中氢原子位置的结构分析技术。中子结构能够揭示质子化状态和水分子的取向，从而阐明反应机理和结合相互作用。与X射线衍射相比，中子衍射的优势在于它是一种非破坏性技术。含有光敏基团或金属传感器的蛋白质可在不遭受辐射损伤的情况下进行研究。为了开展中子蛋白质晶体学实验，需将体积较大且易碎的蛋白质晶体装载到石英毛细管中，用于室温下的数据收集。由于晶体毛细管装载技术并非常规操作，因此对该技术的示范具有重要的指导意义。进行晶体收获时，打开密封的三明治盒，盒内含有置于九孔大容量硅化玻璃板中的蛋白质晶体，用微量移液器从结晶储液槽中转移10至20微升溶液至载玻片上。在显微镜下评估晶体状态。选用合适尺寸的微环环取晶体，并将其置入储液液滴中。进行晶体挂载时，取一根直径为2毫米、长度为50毫米的石英毛细管，用移液器吸取储液缓冲液，并将毛细管一端充满储液缓冲液。使用挂载环将晶体轻柔地放入石英毛细管内的储液缓冲液中。轻敲管壁，使储液缓冲液和晶体沿毛细管向下滑动，然后用一根细长的移液管吸除晶体周围的溶液。使用一根细的纸灯芯小心地吸干晶体，并擦干毛细管内壁，然后向毛细管末端加入 20 至 50 微升的氘代缓冲液。使用加热棒熔化部分蜂蜡，轻轻将毛细管插入熔化的蜂蜡中，直至形成气密性密封。在晶体装载后的第 2、6 和 10 天，分别更换为 20 至 50 微升新鲜的氘代缓冲液，并在每次蒸气交换后用新熔化的蜂蜡重新密封毛细管，操作如示。经过至少两周的蒸气交换后，使用橡皮泥将石英毛细管固定在已安装于仪器样品台上的IMAGINE中子衍射仪测角仪样品杆上，并将样品及样品杆降至中子束流和探测器区域。在光束线控制计算机上打开数据采集程序，点击“setup”选项卡以设置数据采集策略，并输入实验参数，包括仪器名称和待采集图像的名称。点击“collect”选项卡，并输入数据采集参数，包括曝光时间和需采集的帧数。在光学图形用户界面中，点击设置数据采集的准范围，将波长最小值（lambda minimum）设为 2.78，最大值（lambda maximum）设为 4.5。点击“开始扫描”（start scan）以启动数据采集。中子数据采集完成后，在相同温度下对同一晶体采集相应的X射线数据集。在进行冷冻数据收集之前，从三明治盒中移除储液溶液，并用氘代储液缓冲液填充三明治盒，平衡一周后重复此步骤三次。再经过三轮储液溶液更换后，用微环捞取晶体，并将晶体浸入冷冻保护剂溶液中两小时，然后将晶体装载到连接在冷冻晶体支架上的微环中。将装载好的晶体连同冷冻支架迅速浸入液氮中。当晶体冻结后，将其安装在配备低温气流装置的生物大分子中子衍射仪样品台上。确认晶体已安装到位并居中以进行数据采集，填写完整的实验提案信息，点击文件夹图标以加载数据采集策略表，然后点击提交以开始数据采集。当中子被MaNDi飞行时间探测器探测到时，衍射中子将实时显示出来。对于联合X射线与中子数据精修，首先打开CCP4，选择“转换”以修改扩展MTZ程序，使中子数据的R自由标记与X射线数据的标记相匹配。导入中子数据的MTZ格式反射文件。选择“从另一个MTZ文件导入自由R数据”，并导入X射线MTZ文件。命名新的匹配 MTZ 文件并点击运行。接下来，打开 Phoenix 软件包，在 refinement 模块下点击 ready set。上传蛋白质坐标文件，如果模型中缺少氢原子，则选择添加氢原子，并从下拉菜单中选择在可交换位点添加 HD，在其他位置添加 H。选择向溶剂分子中添加氘，然后单击运行以开始。对于结构精修，在精修选项卡中，打开 phoenix.refine 程序，使用X射线和中子数据设置精修。在配置选项卡中，输入来自已解析的X射线结构的PDB文件。上传来自中子数据的MTZ文件。将MTZ文件数据指定为中子R自由中的中子数据。上传X射线数据的MTZ文件，并将其指定为X射线数据和X射线R自由因子。在精修设置中，确认已选择标准精修策略，并将循环次数增加至五次。选择所有参数、高级选项和氢原子。将氢原子 refinement 模型更改为独立模型，并关闭强制 riding ADP，然后搜索核位置。选择使用来自 X-HD 的核间距。单击运行以开始 refinement。在 Phoenix 中进行模型构建时，点击在 Coot 中打开。在 Coot 中，可视化 X 射线电子密度图和中子散射长度密度图。选择显示管理器，并删除中子 2FOFC 中子散射长度密度图。选择打开 MTZ 文件，并选择打开中子数据的 mtz 文件。在振幅和相位选项中，均从下拉菜单中选择 no_fill_neutron 数据，以打开未填充的中子散射长度密度图。对残基进行目视检查，以确定模型是否与数据吻合，并分析可交换氢-氘位点的差值密度图峰，从而判断其正确取向和占据率。根据中子散射长度密度（SLD）图和氢键相互作用重新调整水分子的取向。依据中子SLD图调整蛋白质残基上可发生氢-氘交换位点的质子化状态和取向。进行多轮交互式模型构建与精修，以获得完整的结构。在基于水的缓冲液中生长的氘代蛋白质晶体大小约为 1,000 × 900 微米。这些晶体可装载于石英毛细管中，并与基于重水（氘氧化物）的缓冲液进行为期三周的蒸气交换，随后进行中子衍射数据收集。在同一晶体上，以 2.30 埃分辨率连续收集了数天的中子衍射数据，并采集了一套X射线衍射数据集。FO减去FC的中子散射长度密度图中的峰可提供有关残基取向的宝贵信息，例如天冬酰胺；而在FO减去FC的中子散射长度密度缺失图中出现的正峰，对于确定具有可滴定基团（如组氨酸）残基的质子化状态也极具信息价值。水分子的电子散射长度密度图与中子散射长度密度图的叠加显示，尽管氢键相互作用可从X射线数据中推断，但中子数据能清晰揭示这些氢键的位置。中子散射长度密度缺失图可用于确定氢-氘交换侧链功能基团的取向。由于密度抵消效应，当中子散射长度密度图中与碳原子结合的非可交换氢原子呈现时，其图像相较于电子密度图显得不完整。因此，更宜采用X射线与中子数据对样品进行联合精修，其中X射线数据可用于确定蛋白质主链的位置。中子蛋白质晶体学需要较大的晶体。在晶体处理和安装过程中需格外小心，以避免晶体受损，因为晶体容易开裂，从而影响数据质量。中子蛋白质晶体学可提供有关蛋白质反应机制的信息，有可能揭示具有催化相关性的残基或水分子，其功能可通过动力学、诱变或光谱学方法进一步探究。

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科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

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