中子晶体学数据收集和处理，用于蛋白质结构中氢原子的建模
December 1st, 2020
中子蛋白晶体学是一种结构技术，允许氢原子的定位，从而提供蛋白质功能的重要机制细节。我们在这里介绍了用于安装蛋白质晶体，中子衍射数据收集，结构细化以及中子散射长度密度图分析的工作流程。
中子晶体学是一种用于确定生物大分子中氢原子位置的结构技术。中子结构揭示了质子化态和水分子取向，以阐明反应机制和结合相互作用。与 X 射线衍射相比，中子衍射的优势在于是一种无损技术。
可以研究具有光敏基团或金属传感器的蛋白质而不会受到辐射损伤。为了进行中子蛋白晶体学，将大而脆弱的蛋白质晶体安装在石英毛细管中，用于室温数据收集。晶体毛细管封片不是常规进行的，因此该技术的演示具有指导意义。
对于晶体收获，打开九孔大容量硅化玻璃板中含有蛋白质晶体的密封夹心盒，并使用微量移液器将 10 至 20 微升从结晶储液槽溶液转移到载玻片上。用显微镜评估晶体。使用适当大小的微环收获晶体并将晶体放入液滴中的储液槽溶液中。
对于晶体镶嵌，取直径为 2 毫米、长度为 50 毫米的石英毛细管，用移液管吸出储液槽缓冲液，并用储液槽缓冲液填充毛细管的一端。使用安装环将晶体轻轻放入石英毛细管内的储液槽缓冲液中。轻敲试管，将储液槽缓冲液和晶体沿毛细管向下移动，并使用细长的移液管从晶体周围吸出溶液。
使用薄纸芯小心地干燥晶体并干燥毛细管壁，并在毛细管末端加入 20 至 50 微升氘代缓冲溶液。使用加热棒融化一部分蜂蜡，然后将毛细管轻轻插入融化的蜂蜡中，直到形成气密密封。在晶体安装后的第 2 天、第 6 天和第 10 天用 20 至 50 微升新鲜的氘酸盐缓冲液替换氘代缓冲液，并在每次蒸汽交换后用新鲜熔化的蜂蜡重新密封毛细管，如图所示。
至少两周的蒸汽交换后，使用腻子将石英毛细管固定到已固定在仪器样品台上的 IMAGINE 中子衍射仪测角仪样品棒上，然后将样品降低并插入中子束和探测器区域。在 Beamline 控制计算机上打开数据采集程序，然后单击设置选项卡以设置数据收集策略并输入实验参数，包括仪器名称和要收集的图像名称。单击 collect 选项卡，然后输入数据收集参数，包括曝光时间和需要采集的帧数。
在光学图形用户界面中，单击 lambda 最小值 2.78 和 lambda 最大值 4.5 以设置数据收集的准范围。单击 Start scan 以启动数据收集。中子数据收集后，在相同温度下在同一晶体上收集相应的 X 射线数据集。
在低温数据收集之前，从夹心盒中取出储液槽溶液，用氘代储液槽缓冲溶液填充夹心盒，平衡一周并重复 3 次。再更换三轮储液后，用微环收获晶体，并将晶体浸入冷冻保护剂溶液中两小时，然后将晶体安装在连接到冷冻晶体支架的微环中。将镶座的晶体和低温镶样浸入液氮中。
当晶体冻结时，将晶体安装在装有低温流的大分子中子衍射仪样品台上。验证晶体是否已挂载并居中以进行数据收集，填写提案信息，然后单击文件夹图标以加载数据收集策略表，然后单击 submit 开始数据收集。衍射中子在被 MaNDi 飞行时间探测器探测到时将变得实时可见。
对于 X 射线和中子联合数据优化，首先打开 CCP4 并选择转换以修改扩展 MTZ 程序，以将中子数据的 R 自由数据标志与 X 射线数据的自由数据标志相匹配。以 MTZ 格式导入 neutron 数据反射文件。选择 Import free R data from another MTZ file（从另一个 MTZ 文件导入空闲 R 数据），然后导入 x-ray MTZ 文件。
为新的匹配 MTZ 文件命名，然后单击 run。接下来，打开 Phoenix 软件包，然后在 refinement 下单击 ready set。上传蛋白质坐标文件，选择将氢添加到模型中（如果不存在），然后从下拉菜单中选择 HD at exchangeable sites， H elsewhere 。
选择 add deuterium to solvent moleculation（将氘添加到溶剂分子中），然后单击 Run（运行）开始。对于结构优化，在 refinement （优化） 选项卡中，打开 phoenix。Refine 程序以使用 X 射线和 Neutron 数据设置精修。
在 configure （配置） 选项卡中，输入已求解 X 射线结构中的 PDB 文件。从 neutron 数据上传 MTZ 文件。将 MTZ 文件数据指定为 neutron R free 中的中子数据。
从 X 射线数据上传 MTZ 文件，并将其分配为 X 射线数据和 X-Ray Free。在 refinement settings （细化设置） 下，确认选择了标准细化策略，并将周期数增加到 5。选择所有参数、高级和氢。
将氢精炼模型更改为 individual（单个）并关闭 Force riding ADP（力骑行 ADP），然后搜索 nuclear。选择 Use the nuclear distance from X-HD（使用与 X-HD 的核距离）。单击 run 以启动优化。
对于 Phoenix 中的模型构建，请单击在 Coot 中打开。在 Coot 中，可视化 X 射线电子密度和中子散射长度密度图。选择显示管理器并删除 neutron 2FOFC 中子散射长度密度图。
选择 open MTZ（打开 MTZ），然后选择 open MTZ（打开 MTZ），然后打开 neutron 数据 mtz 文件。对于振幅和相位选项，从下拉菜单中选择 no_fill_neutron data 以打开未填充的中子散射长度密度图。对残留物进行目视检查，以确定模型是否与数据相符，并分析氢-氘可交换位点的差异密度图峰，以确定正确的方向和占用率。
根据中子 SLD 图和氢键相互作用重新定向水分子。根据中子 SLD 图调整蛋白质残基氢-氘交换位点的质子化状态和方向。执行更多轮交互式模型构建和优化，以获得完整的结构。
在水基缓冲液中生长的氢化蛋白质晶体的尺寸约为 1， 000 x 900 微米。晶体可以安装在石英毛细管中，在中子衍射数据收集之前与基于氧化氘的缓冲液进行蒸汽交换三周。以 2.30 埃的分辨率收集了几天的中子衍射数据，并在同一晶体上收集了 X 射线衍射数据集。
FO 减去 FC 中子散射长度密度图中的峰提供了有关残基（如天冬酰胺）取向的宝贵信息，而 FO 减去 FC 中子散射长度密度省略图中的正峰在确定具有可滴定基团（如组氨酸）的残基的质子化状态方面也非常有用。水分子的电子和中子散射长度密度图的映射叠加表明，虽然可以从 X 射线数据推断出氢键相互作用，但中子提供了有关这些氢键位置的明确信息。中子散射长度密度省略图可用于确定氢-氘侧链官能团方向。
由于密度抵消，不可交换的氢原子与碳键合的中子散射长度密度图与电子密度图相比似乎不完整。因此，最好对样品进行 X 射线和中子数据的联合精炼，其中 X 射线数据可用于确定蛋白质骨架的位置。中子蛋白晶体学需要大晶体。
在晶体处理和镶嵌过程中应小心，以免损坏晶体，因为晶体很容易破裂，从而影响数据质量。中子蛋白晶体学提供了对蛋白质反应机制的见解，有可能揭示催化相关的残基或水分子，其作用可以通过动力学、诱变或光谱学进一步探测。
概述
中子蛋白质晶体学是一种结构技术，它允许定位蛋白质中的氢原子，为它们的功能提供关键的洞察。本文概述了蛋白质晶体的安装、中子衍射数据的收集以及结果图谱的分析工作流程。
关键研究组成部分
科学领域
- 结构生物学
- 中子晶体学
- 蛋白质分析
背景
- 中子晶体学有助于确定生物大分子中的氢原子位置。
- 这种技术揭示了质子化状态和水分子的取向。
- 它是非破坏性的，使其适用于敏感的蛋白质。
- 晶体安装技术不是常规操作，使这种演示具有价值。
研究目的
- 展示中子蛋白质晶体学的过程。
- 提供数据收集和分析的详细工作流程。
- 突出中子衍射相对于X射线衍射的优势。
使用的方法
- 在石英毛细管中安装蛋白质晶体。
- 使用转角仪收集中子衍射数据。
- 使用中子和X射线数据集进行数据精炼。
- 使用软件进行模型构建和密度图的可视化。
主要结果
- 成功安装和从中子衍射实验中收集数据。
- 展示了联合X射线和中子数据精炼的工作流程。
- 可视化中子散射长度密度图。
- 通过这种方法获得的蛋白质结构细节的洞察。
结论
- 中子蛋白质晶体学是结构生物学的强大工具。
- 该技术提供了关于蛋白质功能和相互作用的独特洞察。
- 适当的方法对于成功的数据收集和分析至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Neutron crystallography enables direct visualization of hydrogen atom positions in protein structures, providing mechanistic clarity on protonation and hydration states critical for drug discovery. This capability addresses a key gap left by X-ray diffraction, especially for targets with photosensitive cofactors or metal centers. Integrating neutron data into early discovery workflows enhances predictive confidence and de-risks mechanistic hypotheses across the portfolio.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Direct mapping of hydrogen atoms clarifies catalytic mechanisms and functional group orientations.
- Protonation state assignment supports mechanistic de-risking and target validation.
- Hydrogen bond network visualization informs structure-based drug design and ligand optimization.
Screening & Assay Development
- Preparation of deuterated, hydrogenated crystals enables reproducible structural interrogation.
- Joint X-ray/neutron refinement produces all-atom models for downstream computational screening.
- Quantitative neutron scattering length density maps support assay standardization and reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Mechanistic insights from neutron data inform preclinical model selection and biomarker alignment.
- Structural elucidation of labile intermediates supports translational continuity from discovery to preclinical validation.
- Hydrogen/deuterium exchange analysis aids in understanding solvent interactions relevant to in vivo conditions.
Pipeline & Workflow Integration
Neutron crystallography integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing atomic-level mechanistic data that complements X-ray structures and informs lead optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of protonation and hydrogen bonding in active sites.
- Screening: Supplies validated structural templates for computational and experimental screening.
- Analytics: Delivers quantitative SLD maps for comparative analysis of functional states.
- Translational Research: Supports mechanistic continuity and biomarker strategy development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for high-value, mechanistically complex targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes crystal handling, mounting, and data collection for reproducibility.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of structurally complex or mechanistically ambiguous targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in large crystal growth, handling, and mounting for neutron diffraction.
- Access to specialized neutron beamlines and advanced data processing infrastructure is essential.
- Cross-team standardization of data formats and refinement protocols is needed for joint X-ray/neutron analysis.
- Adaptation to different protein systems may require optimization of deuteration and cryo-handling steps.
- Crystal fragility and size requirements may limit throughput and target selection.
