中子晶体学数据收集与处理在蛋白质结构中氢原子建模的应用

中子晶体学是一种用于确定生物大分子中氢原子位置的结构分析技术。中子结构能够揭示质子化状态和水分子的取向，从而阐明反应机理和结合相互作用。与X射线衍射相比，中子衍射的优势在于它是一种非破坏性技术。

含有光敏基团或金属传感器的蛋白质可在不遭受辐射损伤的情况下进行研究。为了开展中子蛋白质晶体学实验，需将体积较大且易碎的蛋白质晶体装载到石英毛细管中，用于室温下的数据收集。由于晶体毛细管装载技术并非常规操作，因此对该技术的示范具有重要的指导意义。

进行晶体收获时，打开密封的三明治盒，盒内含有置于九孔大容量硅化玻璃板中的蛋白质晶体，用微量移液器从结晶储液槽中转移10至20微升溶液至载玻片上。在显微镜下评估晶体状态。选用合适尺寸的微环环取晶体，并将其置入储液液滴中。

进行晶体挂载时，取一根直径为2毫米、长度为50毫米的石英毛细管，用移液器吸取储液缓冲液，并将毛细管一端充满储液缓冲液。使用挂载环将晶体轻柔地放入石英毛细管内的储液缓冲液中。轻敲管壁，使储液缓冲液和晶体沿毛细管向下滑动，然后用一根细长的移液管吸除晶体周围的溶液。

使用一根细的纸灯芯小心地吸干晶体，并擦干毛细管内壁，然后向毛细管末端加入 20 至 50 微升的氘代缓冲液。使用加热棒熔化部分蜂蜡，轻轻将毛细管插入熔化的蜂蜡中，直至形成气密性密封。在晶体装载后的第 2、6 和 10 天，分别更换为 20 至 50 微升新鲜的氘代缓冲液，并在每次蒸气交换后用新熔化的蜂蜡重新密封毛细管，操作如示。

经过至少两周的蒸气交换后，使用橡皮泥将石英毛细管固定在已安装于仪器样品台上的IMAGINE中子衍射仪测角仪样品杆上，并将样品及样品杆降至中子束流和探测器区域。在光束线控制计算机上打开数据采集程序，点击“setup”选项卡以设置数据采集策略，并输入实验参数，包括仪器名称和待采集图像的名称。点击“collect”选项卡，并输入数据采集参数，包括曝光时间和需采集的帧数。

在光学图形用户界面中，点击设置数据采集的准范围，将波长最小值（lambda minimum）设为 2.78，最大值（lambda maximum）设为 4.5。点击“开始扫描”（start scan）以启动数据采集。中子数据采集完成后，在相同温度下对同一晶体采集相应的X射线数据集。

在进行冷冻数据收集之前，从三明治盒中移除储液溶液，并用氘代储液缓冲液填充三明治盒，平衡一周后重复此步骤三次。再经过三轮储液溶液更换后，用微环捞取晶体，并将晶体浸入冷冻保护剂溶液中两小时，然后将晶体装载到连接在冷冻晶体支架上的微环中。将装载好的晶体连同冷冻支架迅速浸入液氮中。

当晶体冻结后，将其安装在配备低温气流装置的生物大分子中子衍射仪样品台上。确认晶体已安装到位并居中以进行数据采集，填写完整的实验提案信息，点击文件夹图标以加载数据采集策略表，然后点击提交以开始数据采集。当中子被MaNDi飞行时间探测器探测到时，衍射中子将实时显示出来。

对于联合X射线与中子数据精修，首先打开CCP4，选择“转换”以修改扩展MTZ程序，使中子数据的R自由标记与X射线数据的标记相匹配。导入中子数据的MTZ格式反射文件。选择“从另一个MTZ文件导入自由R数据”，并导入X射线MTZ文件。

命名新的匹配 MTZ 文件并点击运行。接下来，打开 Phoenix 软件包，在 refinement 模块下点击 ready set。上传蛋白质坐标文件，如果模型中缺少氢原子，则选择添加氢原子，并从下拉菜单中选择在可交换位点添加 HD，在其他位置添加 H。

选择向溶剂分子中添加氘，然后单击运行以开始。对于结构精修，在精修选项卡中，打开 phoenix.refine 程序，使用X射线和中子数据设置精修。

在配置选项卡中，输入来自已解析的X射线结构的PDB文件。上传来自中子数据的MTZ文件。将MTZ文件数据指定为中子R自由中的中子数据。

上传X射线数据的MTZ文件，并将其指定为X射线数据和X射线R自由因子。在精修设置中，确认已选择标准精修策略，并将循环次数增加至五次。选择所有参数、高级选项和氢原子。

将氢原子 refinement 模型更改为独立模型，并关闭强制 riding ADP，然后搜索核位置。选择使用来自 X-HD 的核间距。单击运行以开始 refinement。

在 Phoenix 中进行模型构建时，点击在 Coot 中打开。在 Coot 中，可视化 X 射线电子密度图和中子散射长度密度图。选择显示管理器，并删除中子 2FOFC 中子散射长度密度图。

选择打开 MTZ 文件，并选择打开中子数据的 mtz 文件。在振幅和相位选项中，均从下拉菜单中选择 no_fill_neutron 数据，以打开未填充的中子散射长度密度图。对残基进行目视检查，以确定模型是否与数据吻合，并分析可交换氢-氘位点的差值密度图峰，从而判断其正确取向和占据率。

根据中子散射长度密度（SLD）图和氢键相互作用重新调整水分子的取向。依据中子SLD图调整蛋白质残基上可发生氢-氘交换位点的质子化状态和取向。进行多轮交互式模型构建与精修，以获得完整的结构。

在基于水的缓冲液中生长的氘代蛋白质晶体大小约为 1,000 × 900 微米。这些晶体可装载于石英毛细管中，并与基于重水（氘氧化物）的缓冲液进行为期三周的蒸气交换，随后进行中子衍射数据收集。在同一晶体上，以 2.30 埃分辨率连续收集了数天的中子衍射数据，并采集了一套X射线衍射数据集。

FO减去FC的中子散射长度密度图中的峰可提供有关残基取向的宝贵信息，例如天冬酰胺；而在FO减去FC的中子散射长度密度缺失图中出现的正峰，对于确定具有可滴定基团（如组氨酸）残基的质子化状态也极具信息价值。水分子的电子散射长度密度图与中子散射长度密度图的叠加显示，尽管氢键相互作用可从X射线数据中推断，但中子数据能清晰揭示这些氢键的位置。中子散射长度密度缺失图可用于确定氢-氘交换侧链功能基团的取向。

由于密度抵消效应，当中子散射长度密度图中与碳原子结合的非可交换氢原子呈现时，其图像相较于电子密度图显得不完整。因此，更宜采用X射线与中子数据对样品进行联合精修，其中X射线数据可用于确定蛋白质主链的位置。中子蛋白质晶体学需要较大的晶体。

在晶体处理和安装过程中需格外小心，以避免晶体受损，因为晶体容易开裂，从而影响数据质量。中子蛋白质晶体学可提供有关蛋白质反应机制的信息，有可能揭示具有催化相关性的残基或水分子，其功能可通过动力学、诱变或光谱学方法进一步探究。