Name: 两种剥离方法，用于分离小鼠视网膜中的光感受器细胞区室以进行蛋白质分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 学习两种剥离技术，用于从小鼠视网膜中分离视杆细胞外段和内段区室，以进行蛋白质分析。该方法使用滤纸和胶带等常见实验材料，操作简便且成本低廉，可支持健康与疾病状态下光感受器生理过程的研究。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 EY12155、EY027193 和 EY027387，资助对象为 JC。我们感谢加州理工学院（Caltech，帕萨迪纳，美国）的 Spyridon Michalakis 博士和南加州大学（USC，洛杉矶，美国）的 Natalie Chen 对稿件的校对。我们还要感谢南加州大学（USC，洛杉矶，美国）的 Seth Ruffins 博士和 Janos Peti-Peterdi 博士，他们提供了采集作者提供视频所需的设备。材料来源：Kasey Rose 等人，《小鼠视网膜光感受器细胞区室分离用于蛋白质分析》，《分子神经退行性疾病》（Molecular Neurodegeneration），[2017] 年出版，[Springer Nature]。

所有实验均根据南加州大学（USC）研究动物护理委员会的本地机构指南进行。
1. 活细胞视网膜剥离方法
<ol>
	<li>Ames 缓冲液、剥离滤纸和解剖皿的准备
	<ol>
		<li>使用钝头虹膜剪刀（或同等类型的剪刀），将纤维素滤纸（413 级）裁剪成约 5 mm × 2.5 mm 的矩形。将裁好的滤纸保存以备后续使用。</li>
		<li>通过将一瓶 Ames 培养基、2.38 g HEPES 和 0.877 g NaCl 混合，配制 1 L 的 Ames HEPES 缓冲液。用去离子超纯水在无菌玻璃瓶中溶解试剂，并将渗透压和 pH 值分别调节至 280 mOsm 和 7.4。经滤膜（孔径 0.2 µm）过滤除菌，用石蜡膜密封瓶口，于 4 °C 保存。</li>
		<li>通过将一瓶 Ames 培养基与 1.9 g NaHCO3 混合，配制 1 L 的 Ames 碳酸氢盐缓冲液。用去离子超纯水在无菌玻璃瓶中溶解试剂，并将渗透压和 pH 值分别调节至 280 mOsm 和 7.4。经滤膜（孔径 0.2 µm）过滤除菌，用石蜡膜密封瓶口，于 4 °C 保存。 
		注：Ames HEPES 缓冲液和 Ames 碳酸氢盐缓冲液可预先配制，并在 4 °C 下保存 1 周。</li>
		<li>在 35 × 10 mm 培养皿底部，使用手术刀（11 号刀片，40 mm）刻出网格状或棋盘状纹路。 
		注：培养皿底部的纹理有助于在视网膜解剖过程中固定分离的、自由漂浮的眼球。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视网膜解剖 
	注：本操作中，缓冲液应保持在室温（RT）。解剖过程中每 15 分钟更换一次新鲜的通入碳氧混合气的 Ames 碳酸氢盐缓冲液，以维持所需的生理 pH 值。
	<ol>
		<li>在解剖前约 15–20 分钟，将 Ames HEPES 缓冲液置于配有管帽适配器的 100 mL 实验室或培养基瓶中进行氧合；同时将 Ames 碳酸氢盐缓冲液置于组织孵育 chamber 及配有管帽适配器的 100 mL 实验室或培养基瓶中，通入 95% O2 和 5% CO2 进行气泡氧合。</li>
		<li>通过异氟烷吸入或二氧化碳（CO2）窒息后行颈椎脱位法，处死同等数量的雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠（2–3 月龄）。使用弯头剪刀摘除眼球，并将眼球放入盛有通气 Ames 碳酸氢盐缓冲液的带纹理 35 × 10 mm 培养皿中。</li>
		<li>用 18 G 针头在角膜-角巩膜缘交界处穿刺打孔，形成眼杯（图 1A）。使用显微虹膜剪刀沿该交界边缘剪开，去除每只眼球的角膜。用镊子分离并弃去每只眼球的晶状体和玻璃体。</li>
		<li>小心地将视网膜色素上皮（RPE）-巩膜-脉络膜复合体从神经视网膜上剥离，从而分离出视网膜。弃去 RPE-巩膜-脉络膜复合体。操作时仅接触视网膜边缘，确保解剖过程中视网膜不受损伤。</li>
		<li>使用宽口移液管将分离的视网膜转移至盛有通气 Ames 碳酸氢盐缓冲液的 60 × 15 mm 培养皿盖中。</li>
		<li>将半球形视网膜凹面朝上放置（光感受器朝下贴向皿底），使用虹膜剪刀或手术刀（10 号刀片，40 mm）沿视神经将每片视网膜切成两半。修剪每半片视网膜的弯曲边缘，使其成为两个矩形（图 1A）。 
		注：尽量减小每半片视网膜的曲率，有助于在后续剥离步骤中更好地展平视网膜，并准确剥离视杆外段（ROS）层。</li>
		<li>将切半的视网膜存放于持续通入 95% O2 和 5% CO2 的组织孵育 chamber 中。 
		注：分离的视网膜可在通碳氧混合气的 Ames 碳酸氢盐缓冲液中保存约 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过滤纸剥离法收集视杆外段（ROS） 
	注：剥离过程中每 15–20 分钟更换一次室温氧合的 Ames HEPES 缓冲液，以维持所需的生理 pH 值。
	<ol>
		<li>使用宽口移液管将一片来自组织孵育 chamber 的视网膜矩形和一块 5 mm × 2.5 mm 的滤纸转移至盛有通入 100% O2 的 Ames HEPES 缓冲液的 35 × 10 mm 培养皿中。</li>
		<li>将分割后的视网膜凹面朝上放置，确保光感受器朝下贴向皿底。用镊子轻轻夹住半片视网膜的两侧，将其移至滤纸上方。当视网膜居中于滤纸上后，将滤纸向上移动，使半片视网膜接触滤纸，形成 ROS 与滤纸之间的黏附（图 1B）。 
		注：确保光感受器层与滤纸直接接触。</li>
		<li>小心地将附着视网膜的滤纸从 Ames HEPES 缓冲液中提起。将滤纸底面（无视网膜的一面）置于纸巾上，轻拍 2–3 次以吸干液体（图 1B）。</li>
		<li>在滤纸有视网膜的一侧滴加一滴 Ames HEPES 缓冲液。再次将滤纸放回纸巾上吸干，重复此过程共三次。</li>
		<li>将带有视网膜的滤纸放回培养皿中。用镊子轻轻将半片视网膜的所有边缘从滤纸上向四周推起。</li>
		<li>小心地将视网膜从滤纸上剥离。剥离过程中仅接触视网膜最外周边缘，以保持其结构完整性。</li>
		<li>将滤纸从培养皿中取出，在纸巾上吸去多余液体。注意确保曾与视网膜接触的一面不接触纸巾。</li>
		<li>将带有部分 ROS 层的滤纸放入标记好的冰上试管中（图 1B）。保持已剥离的视网膜浸没在 Ames HEPES 缓冲液中。</li>
		<li>对该半片视网膜重复剥离过程约 7–8 次，以完全去除整个 ROS 层。每次剥离后，将滤纸放入同一试管中，该试管将包含来自一片半视网膜的分离 ROS。 
		&#8203;注：剥离时需小心避免撕裂半片视网膜，因为在此过程中视网膜会逐渐变薄。</li>
		<li>将装有全部 ROS 滤纸剥离物的试管置于冰上立即使用，或直接在干冰上速冻后于 -80 °C 保存。</li>
		<li>使用镊子将剩余的、已无 ROS 的剥离视网膜转移至适当标记的试管中。将试管置于冰上立即使用，或用干冰速冻后于 -80 °C 保存。</li>
		<li>对每片半视网膜重复剥离操作，并准确标记每个试管。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 冻干视网膜剥离法
<ol>
	<li>缓冲液、剥离介质、解剖皿制备及冻干机设置
	<ol>
		<li>在1 L储存瓶中，加入500 mL去离子超纯水配制任氏液（Ringer's solution）。溶解试剂至终浓度为130 mM NaCl、3.6 mM KCl、2.4 mM MgCl2、1.2 mM CaCl2、10 mM HEPES和0.02 mM EDTA。用NaOH调节pH至7.4，再加入超纯水定容至1 L，并调节渗透压至313 mOsm。</li>
		<li>使用前，用无菌滤器（孔径0.2 µm）过滤任氏液，瓶盖用石蜡膜密封后，于4 °C保存。</li>
		<li>使用钝头虹膜剪刀（或同等类型的剪刀），将纤维素滤纸剪成约5 mm × 2.5 mm的矩形。用铅笔在滤纸一侧书写，以创建唯一标识标签。</li>
		<li>使用手术刀（11号刀片，40 mm）在35 × 10 mm培养皿底部刻出网格或棋盘状图案。</li>
		<li>根据制造商说明启动冻干机。</li>
		<li>在杜瓦瓶或其他保温真空容器中准备液氮。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视网膜解剖
	<ol>
		<li>按照方案第1节所述完成视网膜解剖（图1A），使用冷任氏液代替Ames缓冲液。</li>
		<li>解剖完成后，将半片矩形视网膜置于盛有冷任氏液的35 × 10 mm培养皿中，并放置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冻干用视网膜样品制备
	<ol>
		<li>取一片5 × 2.5 mm的滤纸，将半片视网膜转移至盛有冷任氏缓冲液的带纹理35 × 10 mm培养皿中。使用宽口移液管在各培养皿间转移每片视网膜。</li>
		<li>用镊子小心翻转视网膜，使其凹面朝上（感光细胞朝上），并移动至滤纸表面放置（图2A）。 
		注意：确保感光细胞不接触滤纸（视网膜神经节细胞层应直接接触滤纸），且唯一标签可见。为便于快速识别视网膜样本，建议将唯一标签置于滤纸底面。</li>
		<li>从边缘向上提起滤纸，使半片视网膜贴附于滤纸上，继续将滤纸从任氏液中提起。</li>
		<li>将滤纸底面（无视网膜的一面）朝下放在纸巾上，轻轻拍打2–3次以去除多余液体（图2A）。</li>
		<li>用镊子夹起滤纸，在有视网膜的一侧滴加一滴冷任氏液，再次将滤纸放在纸巾上去除多余液体。重复此过程两次。 
		注意：这些交替润湿与干燥步骤可确保组织牢固附着于滤纸上。</li>
		<li>将每份附着好的视网膜/滤纸样本暂存于盛有冷任氏液的培养皿中，待所有样本准备好后统一冷冻。对所有半片视网膜重复此过程。</li>
		<li>准备一个洁净干燥的35 × 10 mm培养皿（仅底面）和一张裁剪为3.5 × 3.5英寸的铝箔。</li>
		<li>用镊子将每个样本从冷任氏缓冲液中取出，确保镊子仅接触滤纸边缘，避免触碰半片视网膜。</li>
		<li>将每张滤纸底面（无视网膜的一面）朝下放在纸巾上，去除多余液体。</li>
		<li>在滤纸附着视网膜的一侧滴加一滴冷1× PBS（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4，pH 7.4），然后将滤纸轻压在纸巾上以去除多余液体。 
		注意：冷冻前务必充分去除滤纸上的水分。</li>
		<li>将所有滤纸片放入35 × 10 mm培养皿中。使用无绒纸巾吸除滤纸周围任何多余液体。 
		注意：避免样本在培养皿中过于密集。若使用超过四只小鼠眼球，建议使用更大的培养皿或多个较小培养皿来容纳视网膜/滤纸样本。</li>
		<li>用铝箔紧密包裹整个培养皿，确保铝箔边缘紧贴并平滑压入培养皿底部。在铝箔盖上穿刺数个直径0.1–0.2 mm的小孔（图2A）。</li>
		<li>使用金属钳子将铝箔包裹的培养皿缓慢浸入液氮中。样本在液氮中保存（&#60;10分钟），直至准备进行冻干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冻干
	<ol>
		<li>将铝箔包裹的培养皿放入冷冻干燥瓶中，并按照制造商说明连接至冻干机。冻干视网膜30分钟。</li>
		<li>将瓶子从冻干机上拆下，并按制造商要求关闭机器。</li>
		<li>移除铝箔，当日立即使用冻干样本，或将样本存于正确标记的1 mL微量离心管中。将这些离心管放入装有无水干燥剂的容器（如50 mL锥形管）中，并于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过粘性胶带剥离收集视杆细胞外段和内段
	<ol>
		<li>裁剪透明粘性胶带成条状（1–2 cm），并将胶带条存放于胶带分配器/实验台边缘等便于快速取用的位置。</li>
		<li>将一个视网膜样本转移至塑料60 × 15 mm培养皿盖上进行剥离操作。操作时仅夹取滤纸最外缘，避免接触视网膜。</li>
		<li>使用钝头虹膜剪刀（或同等类型剪刀），剪下一小块矩形胶带，大小约与组织相近（1.5 × 2.5 mm）。</li>
		<li>小心将小块胶带覆盖在冻干视网膜上（图2B），用镊子轻轻按压，确保其与感光细胞层（橙色/粉红色顶层）粘合。</li>
		<li>缓慢揭下胶带，视杆细胞外段（ROS）和视杆细胞内段（RIS）将一同粘附于胶带上（图2B）。</li>
		<li>确保断裂面存在一层薄的白色膜状物，此即RIS。为分离RIS，另取一片胶带，将其压在断裂面上（图2B）。 
		注意：可能需要使用多片胶带才能完全去除整层薄白色物质。</li>
		<li>将仅带有橙色/粉红色层的胶带放入标记为+ROS的微量离心管中。</li>
		<li>将带有薄白色层的胶带或胶带碎片放入标记为+RIS的微量离心管中。 
		注意：使用胶带分离冻干视网膜需要练习。施加于胶带的压力会影响冻干样本的分层效果。若压力过大，整个冻干视网膜会从滤纸上剥离并粘附于胶带；若压力不足，则橙色/粉红色顶层（+ROS）无法粘附于胶带。</li>
		<li>使用胶带从滤纸上剥离残留的厚白色层，收集滤纸上剩余的视网膜组织（缺失ROS和RIS层，标记为-OIS），并将样本放入标记为-OIS的离心管中。</li>
		<li>对每片半视网膜样本重复上述步骤。</li>
		<li>若当天进行蛋白定量、凝胶电泳和蛋白免疫印迹分析，可将分离的各层组织在室温下保存；若需后续使用，则将其存于装有无水干燥剂的容器（如50 mL锥形管）中，并于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 剥离分离样品的 Western 印迹制备
<ol>
	<li>制备 RIPA 裂解缓冲液
	<ol>
		<li>在 100 mL 储存瓶中加入试剂，使其终浓度为 50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl、1% Triton X-100、1% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS 和 1 mM EDTA。加入 100 mL 去离子超纯水，充分混匀。 
		注意：RIPA 裂解缓冲液可在 2–8 °C 下保存 2–3 周。如需长期保存，应分装后置于 -20 °C 冰箱中储存。</li>
		<li>实验当天，在 RIPA 裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂混合物（0.1 M PMSF、1:1000 抑肽酶 Aprotinin 和 1:1000 亮抑蛋白酶肽 Leupeptin），并置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于 Western blot 的滤纸剥离裂解液制备
	<ol>
		<li>确保装有滤纸剥离物及剩余去核视网膜的离心管保持在冰上（当日实验）或从 -80 °C 冰箱中取出后立即置于冰上。</li>
		<li>移除装有滤纸剥离物的微量离心管底部多余的液体。在小型离心机中快速离心 2–4 秒，弃去残留液体。</li>
		<li>向含有滤纸分离物的离心管中加入 45–55 µL 冷 RIPA 缓冲液。</li>
		<li>使用洁净且经高压灭菌的研磨杵对每个样品匀浆 1 分钟。确保滤纸始终与研磨杵接触。将滤纸置于管壁一侧，而非管底。</li>
		<li>用镊子将滤纸移至各管壁一侧，并在小型离心机中离心 2–4 秒，以去除滤纸上的 RIPA 缓冲液。</li>
		<li>取出干燥的滤纸，如有必要，对每管中的所有滤纸重复此步骤。</li>
		<li>将匀浆液转移至新离心管中，并做好相应标记。 
		注意：此步骤耗时最长，若操作不当，大部分样品将被滤纸吸附。</li>
		<li>向含有剩余去核视网膜的各个离心管中加入 60–80 µL 冷 RIPA 缓冲液。</li>
		<li>使用洁净且经高压灭菌的研磨杵对每个样品匀浆 1 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于 Western blot 的胶带剥离裂解液制备
	<ol>
		<li>将室温下冻干的样品或 -80 °C 保存的样品置于冰上。</li>
		<li>向含有 +ROS 和 +RIS 胶带剥离物的各离心管中加入 50–70 µL 冷 RIPA 缓冲液。</li>
		<li>向含有已去除 ROS 和 RIS 的剩余冻干视网膜的 -OIS 管中加入 60–80 µL 冷裂解缓冲液。</li>
		<li>使用洁净的研磨杵对每个样品匀浆 1 分钟。确保各离心管中的胶带始终与研磨杵和裂解缓冲液接触。</li>
		<li>使用灭菌镊子将胶带移至离心管壁一侧，并在小型离心机中离心 2–4 秒，以去除胶带上的液体。随后从管中取出干燥的胶带。 
		注意：此时，可将同一视网膜来源的两个半份视网膜分离物（无论是“滤纸剥离”法还是“胶带剥离”法）合并，以确保有足够的体积进行二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）蛋白定量分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

许多视网膜疾病会影响视杆感光细胞，导致视杆细胞死亡，最终造成完全失明37。多年来，人类视网膜变性的大量遗传和机制起源已在多种小鼠模型中成功重现。在此背景下，若能简便且选择性地从小鼠微小的视网膜中分离出单个视杆细胞的亚细胞区室，将极大促进我们对视网膜疾病局部生化和分子机制的理解。此外，神经视网膜的分层结构，加上视杆感光细胞独特且高度极化的排列方式，使得可通过选择性剥离来分离视杆细胞的不同区室。本文描述了两种用于免疫印迹分析的视杆感光细胞亚细胞区室分离方案。与现有的切向切片法9相比，这两种方法不仅显著更快且技术难度更低，而且与常用的利用密度梯度生化分离视杆外节（ROS）的方法相比，所需样本量也明显更小19。传统的ROS梯度纯化技术需要8至10只小鼠的视网膜才能可靠地获得足够的ROS，而本文所述方案适用于单个视网膜。
尽管所提出的技术总体上较为简单，但两种方案共同面临的主要挑战之一是将弯曲的视网膜平整地贴附于滤纸上，这是正确分离不同亚细胞组分所必...

视网膜神经层最外层紧密排列的视杆光感受器细胞是暗光视觉的重要组成部分。为了精确地计数光子，视杆细胞利用一种基于G蛋白的信号通路——即光转导通路，产生快速、放大且可重复的响应，以应对单个光子的捕获。这种光响应最终引发细胞质膜电流的变化，并将信号传递至视觉系统的其他部分1。顾名思义，每个视杆细胞均具有明显的杆状形态，且表现出高度极化的细胞结构，包括外节（OS）、内节（IS）、细胞体（CB）和突触终末（ST）。每个亚细胞区室都含有特定的蛋白质机器（膜结合型和可溶性）、生物分子特征及蛋白复合物，在视觉光转导、基础细胞维护与蛋白质合成以及突触传递等过程中发挥关键作用2,3。
三十多年前，人们首次观察到亚细胞蛋白质的光依赖性相互移动现象，具体表现为转导素（从外段OS移出）和阻遏蛋白（向OS移动）4,5,6,7。起初，这一现象因免疫组织化学技术易受表位遮蔽的影响而受到质疑8。21世纪初，研究人员通过一种严格但繁琐的物理切片技术证实了刺激依赖性蛋白质转位的存在9。通过对冷冻平铺的啮齿类动物视网膜进行连续切向切片并结合免疫印迹分析，发现转导素9,10、阻遏蛋白11,12和恢复蛋白13均会在光照条件下发生亚细胞再分布。目前认为，这些关键信号蛋白的光驱动转位不仅可调节光转导级联反应的敏感性9,14,15，还可能对光损伤具有神经保护作用16,17,18。由于光驱动的蛋白质运输在视杆细胞的生物学与生理学中似乎具有重要意义，因此能够分离不同亚细胞区室以确定蛋白质分布的技术成为重要的研究工具。
目前，已有少数几种方法用于分离视杆细胞的亚细胞区室。然而，这些方法往往耗时较长、难以重复，或需要大量视网膜组织。例如，通过密度梯度离心法分离视杆外段（ROS）19 常用于从视网膜匀浆物中分离ROS。该方法在Western blot中广泛应用，但操作过程非常耗时，且至少需要8–12只小鼠的视网膜20。另一方面，对冷冻的小鼠和大鼠视网膜进行连续切向切片，已成功用于分离外段（OS）、内段（IS）、连接纤毛（CB）和突触终末（ST）9,11,13。然而，由于在进行切向切片前必须将体积微小且高度弯曲的小鼠视网膜完全展平以对齐各层结构，该方法在技术上具有较大挑战性。鉴于存在大量模拟视觉系统疾病的基因工程小鼠模型和转基因小鼠，建立一种能够可靠、快速且简便地分离视杆细胞各亚区室的技术，有望揭示各特化区室中发生的生理过程，以及健康与疾病状态下视觉功能的潜在机制。
为了促进这些研究，我们描述了两种剥离方法，相较于现有方案，能更简便地分离视杆细胞的亚细胞区室。第一种剥离方法改进自一种用于暴露荧光标记双极细胞以进行膜片钳记录的技术21，采用纤维素滤纸依次从活体分离的小鼠视网膜中去除外节段（ROS）（图1）。第二种方法改进自一种从鸡22和蛙23视网膜中分离三种主要视网膜细胞层的操作流程，利用粘性胶带从冻干视网膜中去除外节段（ROS）和视杆细胞内节段（RIS）（图2）。这两种操作均可在1小时内完成，且具有较高的用户友好性。我们通过使用暗适应和光暴露的C57BL/6J小鼠视网膜，验证了这两种分离方案在蛋白质印迹（western blot）分析中的有效性，以展示光诱导的视杆细胞转导蛋白（GNAT1）和阻遏蛋白（ARR1）的转位现象。此外，利用胶带剥离法，我们进一步提供了证据表明该技术可用于检验并解决免疫细胞化学（ICC）与蛋白质印迹结果之间在蛋白定位数据上的不一致问题。具体而言，我们的技术表明：1）蛋白激酶C-α（PKCα）亚型不仅存在于双极细胞中，也以较低浓度存在于小鼠的ROS和RIS中24,25；2）视紫红质激酶（GRK1）主要存在于分离得到的外节段（OS）样品中。这些数据证明了我们所提出的两种剥离技术在分离和定量特定视杆细胞及视网膜蛋白方面的有效性。

<table><tbody><tr><td>配备导管帽适配器的100 mL实验室或培养基瓶</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>100% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气罐</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL 瓶顶过滤器，PES滤膜材料，0.22 &amp;mu;m</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-235</td><td></td></tr><tr><td>4X SDS上样缓冲液</td><td>Millipore Sigma</td><td>70607-3</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气罐</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>含L-谷氨酰胺、不含碳酸氢盐的Ames&amp;rsquo;培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;（99%，二水合物）</td><td>Sigma</td><td>C-3881</td><td></td></tr><tr><td>Drierite（无水硫酸钙，&gt;98% CaSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，&gt;2% CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>WA Hammond Drierite Co LTD</td><td>21005</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Easy-Grip 培养皿（聚苯乙烯，35 × 10 mm）</td><td>Falcon-Corning</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Easy-Grip 组织培养皿（60 × 15 mm）</td><td>Falcon-Corning</td><td>08-772F</td><td></td></tr><tr><td>Feather手术刀（10号，40 mm）</td><td>VWR</td><td>100499-578</td><td></td></tr><tr><td>Feather手术刀（11号，40 mm）</td><td>VWT</td><td>100499-580</td><td></td></tr><tr><td>KCl（99%）</td><td>Sigma</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>Kimble Kontes研磨杵</td><td>Sigma</td><td>z359971</td><td></td></tr><tr><td>Labconco Fast-Freeze冻存瓶</td><td>Labconco</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LN&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;（液氮）+ 杜瓦瓶或类似真空瓶</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M-9272</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q/去离子水</td><td>EMD Millipore</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（粉末）</td><td>J.T. Baker</td><td>4062-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl（晶体）</td><td>EMD Millipore</td><td>Sx0420-3</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Amresco</td><td>0865</td><td></td></tr><tr><td>OmniPur EDTA</td><td>EMD</td><td>4005</td><td></td></tr><tr><td>OmniPur HEPES，游离酸</td><td>EMD</td><td>5320</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds Wrap铝箔纸</td><td>Reynolds Brands</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Magic胶带（12.7 mm × 32.9 m）</td><td>Scotch-3M</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D67501</td><td></td></tr><tr><td>Spectrafuge小型离心机</td><td>Labnet International, Inc</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>组织孵育室（购买或定制）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>J.T.Baker</td><td>4103-02</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Signma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>VirTis Benchtop 2K冷冻干燥机或同等设备</td><td>SP Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>VWR Grade 413滤纸（直径5.5 cm，孔径5 &amp;mu;m）</td><td>VWR</td><td>28310-015</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Grade 1定性滤纸（直径9 cm，孔径11 &amp;mu;m）</td><td>Whatman/GE Healthcare</td><td>1001-090</td><td></td></tr><tr><td>宽口移液管，Global Scientific</td><td>VWR</td><td>76285-362</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠视网膜感光细胞区室分离的两种剥离方法及其蛋白质分析

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

视杆细胞是具有明显区室结构的高度极化的感觉神经元。小鼠的视杆细胞细长（长约80 µm，直径约2 µm），并侧向紧密排列于视网膜最外层的光感受器层，使得同类的亚细胞区室整齐对齐。传统上，通过冷冻铺片视网膜的切线切片来研究不同视杆细胞区室中蛋白质的转运与定位。然而，以视杆细胞为主的小鼠视网膜曲率较高，使得切线切片操作困难。基于对蛋白质在不同区室间转运的研究需求，我们开发了两种剥离方法，可稳定分离视杆外段（ROS）及其他亚细胞区室，用于蛋白质印迹分析。这些相对快速且简便的技术可获得富集且具有亚细胞特异性的组分，从而对正常视杆细胞中重要光感受器蛋白的分布与再分布进行定量检测。此外，这些分离技术还可轻松适用于健康及变性视网膜中其他细胞层的分离，以定量分析其蛋白质组成。

本研究建立的方法旨在提供相对快速且简便的技术，用于从特定的视杆细胞亚细胞区室中分离和分析蛋白质，以进行蛋白质印迹（western blot）检测。我们采用了两种连续剥离技术（图1 和 图2），随后进行免疫印迹分析，以证明这些方法可可靠地检测视杆细胞中转导蛋白（GNAT1）和阻遏蛋白（ARR1）在暗适应和光适应动物中的已知分布情况。为了验证这两种方案在精确分离视杆细胞亚细胞区室时避免其他细胞层污染的有效性，我们使用细胞色素C（Cyt C）、肌动蛋白（actin）以及Gß5S/Gß5L26的抗体对免疫印迹结果进行检测。表1 列出了所用抗体及其稀释比例。Cyt C和肌动蛋白可指示外节段（ROS）的纯度，因为它们在近端视网膜中含量丰富，但在ROS中不存在。Gß5L是作用于GNAT1的GTP酶激活蛋白（GAP）的组分27，存在于ROS和内节段（RIS）中，可作为这两种区室分离的对照。Gß5S是较短的剪...

本方案介绍了两种用于分离小鼠视杆光感受器亚细胞区室以进行蛋白质分析的技术。第一种方法利用活体视网膜和纤维素滤纸分离视杆外节，而第二种方法则采用冻干视网膜和粘性胶带剥离视杆内节与外节层。

视杆光感受器是具有明显区室化结构的高度极化感觉神经元。小鼠视杆细胞细长，长约80 μm，直径约2 μm，且……

本文展示的两种剥离技术可分离单个视杆细胞的亚细胞区室，有助于揭示健康和病变视杆细胞各特化区室中发生的重要生理过程。从小鼠视网膜中分离不同的视杆细胞区室具有挑战性。这些简单技术利用廉价且常见的实验材料，可稳定地分离视杆细胞的亚细胞区室，用于蛋白质分析。首先，将一张滤纸放入盛有经100%氧气饱和的Ames HEPES缓冲液的培养皿中。然后，使用宽口移液管将一块从2至3月龄C57 Black 6J小鼠中分离出的视网膜矩形组织转移至滤纸上。将分离的视网膜以凹面朝上放置，并确保感光细胞朝下，面向培养皿底部。然后，使用镊子轻轻夹住半片视网膜的边缘，将其移至滤纸上方。当视网膜位于中心位置后，向上移动滤纸，使半片视网膜接触滤纸，从而实现视杆细胞外段（ROS）与滤纸的黏附。小心地将附着有视网膜的滤纸从Ames HEPES缓冲液中取出。将滤纸的底面放在纸巾上，轻拍两到三次以吸干。在滤纸带有视网膜的一侧滴加一滴Ames HEPES，然后再次将滤纸放回纸巾上干燥。接着，将带有视网膜的滤纸放回培养皿中，用镊子轻轻将半片视网膜的所有边缘从滤纸边缘向四周推起并展开。小心地将视网膜从滤纸上剥离，仅触碰视网膜的最外缘，以保持其结构完整性。然后将滤纸从培养皿中提起，并在纸巾上除去多余的液体，确保与视网膜接触的一侧不接触纸巾。将带有部分ROS层的滤纸放入冰上预冷的标记管中，并使剥离后的视网膜保持浸没在Ames HEPES缓冲液中。对该半片视网膜重复剥离过程约七至八次，以完全去除外节段（ROS）层。每次剥离后，将滤纸放入同一离心管中，以收集来自同一半片视网膜的所有ROS。将含有所有ROS滤纸片的离心管置于冰上，以备立即使用。用镊子将剩余的去除了色素上皮的视网膜转移至适当标记的离心管中，并将离心管置于冰上以备立即使用。为准备视网膜样本进行冻干，先在培养皿中放置一片滤纸，然后将半片视网膜转移至盛有冷林格液的培养皿中。接着，用镊子小心地将视网膜翻转，使其凹面朝上，并将其移至滤纸上平放。用手轻轻提起滤纸边缘，使半片视网膜贴附在滤纸上。继续将滤纸从林格液中取出。然后将滤纸的底面朝下放在纸巾上，小心轻拍两到三次，以去除多余液体。接下来，用镊子夹起滤纸，在滤纸接触视网膜的一侧滴加一滴冰冷的林格氏液。再次将滤纸放置在纸巾上，以去除多余的液体。将每张附有视网膜的滤纸样本置于盛有冰冷林格氏液的培养皿中保存，直至所有样本准备好进行冷冻。然后，使用镊子将每个样本从冰冷的林格液缓冲液中取出，确保镊子仅接触滤纸边缘，避免触碰半片视网膜。将每张滤纸的底面置于纸巾上，以去除多余液体。接着，在滤纸附着视网膜的一侧滴加一滴冷的磷酸盐缓冲液（PBS），再次将滤纸轻压在纸巾上吸去多余液体。将所有滤纸片放入培养皿中，使用无绒擦拭纸吸去滤纸周围多余的液体。然后用铝箔紧密包裹整个培养皿，并确保铝箔边缘牢固地压入培养皿底部。在铝箔盖上刺出若干个直径为0.1至0.2毫米的小孔。接下来，使用金属镊子将覆盖有铝箔的培养皿逐渐浸入液氮中。将样品保存在液氮中，直至准备进行冻干。进行冻干时，将覆盖铝箔的培养皿放入冻干瓶中，并按照制造商的操作说明将其连接到冻干机上。将视网膜冻干30分钟。冻干后，取一小片胶带轻轻覆盖在冻干的视网膜表面，用镊子轻轻按压以确保其与感光细胞层粘附。缓慢揭下胶带，并确保外节段（ROS）和内节段（RIS）均已粘附在胶带上。在断裂表面会出现一层薄而白色的膜，即反应诱导层（RIS）。为分离此反应诱导层，可将另一片胶带贴于断裂表面，并按压胶带使其贴合。然后，将仅带有橙粉色层的胶带片段放入标记为 ROS 的微量离心管中，将带有薄白色层的胶带片段放入另一标记为 RIS 的离心管中。接着，使用胶带剥离滤纸上残留的较厚白色层，以收集剩余的视网膜组织。随后，将该分离物放入标记为 OIS 的离心管中。若在同一天使用，将来自冻干视网膜的分离层置于室温下保存。在暗适应动物中，GNAT1 和 ARR1 的分布与其已知的暗态分布高度一致，其中 GNAT1 信号在 ROS 分离组分中明显最强，而 ARR1 信号在 ROS 分离组分中更为显著。对 GNAT1 和 ARR1 信号的定量分析显示，在 ROS 和 ROS 样品中，GNAT1 与 ARR1 在暗态与光刺激条件下的信号存在显著差异。在暗适应和光适应的样品中，G蛋白亚基5S、细胞色素C和肌动蛋白信号均未出现在视杆外节（ROS）样品中，表明不存在其他细胞层的污染。此外，G蛋白亚基5L信号在ROS样品中清晰可见。对完整及剥离后的冻干视网膜表面进行扫描电子显微镜观察显示，在使用胶带剥离前，完整冻干视网 inflammata的表面与特征性的圆柱状视杆外节结构高度一致。初次胶带剥离后，ROS 和 RIS 似乎已完全去除，残留的剥离冻干视网膜表面呈现出均匀的核层即为证据。后续的胶带剥离去除了剥离层自由表面残余的 RIS。该技术还表明，在光照暴露的视网膜中，GRK1 免疫反应性在 ROS 样本中最强，而在 OIS 样本中则不存在。相反，ROS 和 RIS 样品中 PKC alpha 的信号较弱，而通过免疫荧光染色通常无法在 ROS 或 RIS 中检测到 PKC alpha。最后，不理想的胶带剥离可能导致样品轻微污染。RIS 样品中混入了部分 OIS 样品，因而出现了 G beta 5L 和 G beta 5S 两条带，并且 PKC alpha 信号增强。在冻干视网膜时必须格外小心。如果使用不恰当的冻干技术，视网膜可能会融化，从而无法通过胶带剥离法分离不同的视杆细胞亚细胞层。将此胶带剥离法与定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）结合使用，可实现将光感受器转录本与视网膜其他部分分离开来。

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