两种剥离方法，用于分离小鼠视网膜中的光感受器细胞区室以进行蛋白质分析

这里展示的两种剥离技术可分离单个杆亚细胞区室，并可以帮助揭示健康和患病杆细胞中每个特殊区室中发生的重要生理过程。从小鼠视网膜中分离出不同的视杆细胞区室可能具有挑战性。这些简单的技术使用廉价且司空见惯的实验室材料来可靠地分离杆亚细胞区室以进行蛋白质分析。

首先，将一张滤纸放入装满100%氧气气泡的Ames HEPES缓冲液的培养皿中。然后，使用宽孔转移移液器，从两到三个月大的C57 Black 6J小鼠中移出一个解剖出的视网膜矩形。将分区的视网膜向上凹陷，并确保光感受器朝下朝向培养皿的底部。

然后，使用镊子轻轻抓住半视网膜的侧面，并将其移动到滤纸的顶部。一旦视网膜居中，向上移动滤纸，使切成两半的视网膜接触滤纸以产生杆外段，或ROS以产生滤纸粘附。小心地将带有视网膜的滤纸从Ames HEPES缓冲液中提起。

将滤纸的底部放在纸巾上，轻拍两到三次以干燥。将一滴Ames HEPES加入视网膜滤纸的侧面，然后将滤纸再次放在纸巾上晾干。接下来，将带有视网膜的滤纸放回培养皿中，然后用镊子轻轻地将切成两半的视网膜的所有边缘向上推，使其远离所有侧面的滤纸。

小心地将视网膜从滤纸上剥离，仅接触视网膜的极端周边，以保持其结构完整性。然后，从培养皿中取出滤纸，除去纸巾上多余的液体，确保与视网膜接触的一侧不会接触纸巾。将带有部分ROS层的滤纸放入冰上的标记管中，并保持剥离的视网膜浸没在Ames HEPES缓冲液中。

对这个减半的视网膜重复剥离过程大约七到八次，以去除整个ROS层。每次剥离后，将滤纸放入同一管中，以组合从一个对半视网膜分离出来的所有ROS。将装有所有分离ROS滤纸剥离的管子放在冰上，以便立即使用。

使用镊子将剩余的剥离的视网膜转移到适当标记的管中，并将管子放在冰上以立即使用。要准备用于冻干的视网膜样品，请放置一张滤纸并将减半的视网膜转移到装有冷Ringer缓冲液的培养皿中。接下来，使用镊子小心地翻转视网膜，使其朝上凹陷，然后将其移动到滤纸的顶部。

将滤纸的边缘向上抬起，使视网膜的一半接触到滤纸。继续将滤纸从林格的溶液中取出。然后，将滤纸的底部放在纸巾上，小心地轻拍两到三次以除去多余的液体。

接下来，用镊子拿起滤纸，在带有视网膜的滤纸侧面加入一滴冷铃声。同样，将滤纸放在纸巾上以除去多余的液体。将每个粘附的视网膜和滤纸样品存放在装满冷铃声的培养皿中，直到准备好冷冻所有样品。

然后，使用镊子将每个样品从冷的Ringer缓冲液中取出，确保镊子仅接触滤纸边缘，避免视网膜减半。将每张滤纸的底部放在纸巾上，以除去多余的液体。然后，将一滴冷PBS添加到滤纸的侧面，其中有视网膜粘附，并再次将滤纸轻拍在纸巾上。

将所有滤纸放入培养皿中，并使用不起毛的薄纸吸走滤纸周围多余的液体。然后，用铝箔紧紧包裹整个培养皿，并确保铝箔的边缘固定并平稳地压入培养皿的底部。在铝箔盖上刺穿一些0.1至0.2毫米的孔。

接下来，使用金属钳，逐渐将铝箔覆盖的培养皿降低到液氮中。将样品保存在液氮中，直到准备好冻干。对于冻干，将铝箔覆盖的培养皿放入冷冻干燥瓶中，并按照制造商的协议将其连接到冻干机上。

冻干视网膜30分钟。冻干后，通过小心地在冻干视网膜顶部放置一小块胶带并用镊子施加轻微压力以确保其与感光器层结合来收集杆外段和内段。慢慢剥离磁带，确保 ROS 和 RIS 都粘附在磁带上。

断裂表面将出现一层薄薄的白色薄膜。这是RIS。要分离此RIS，请放置另一块胶带，然后将胶带向下推到断裂的表面上。

然后，将只有橙粉色层的胶带放入标有ROS的微量离心管中，并将带有薄薄白色层的胶带放入另一根标有RIS的管中。接下来，使用胶带，通过剥离厚厚的白色层来收集位于滤纸上的剩余视网膜组织。然后，将此隔离物放入标有OIS的管中。

如果当天使用，请在室温下储存冻干视网膜中的分离层。在适应黑暗的动物中，GNAT1和ARR1的分布与它们已知的暗态分布非常匹配，其中GNAT1信号在ROS隔离中明显最强，而ARR1信号在ROS隔离中更强。对GNAT1和ARR1信号的定量显示，ROS和ROS样品中GNAT1和ARR1的暗光条件之间存在显着差异。

在黑暗和光适应的样品中，G beat 5S，细胞色素C和肌动蛋白信号从ROS样品中排除，表明没有来自其他细胞层的污染。此外，G beta 5L信号在ROS样品中清晰可见。对完整和剥离的冻干视网膜表面的扫描电镜检查表明，在用胶带剥离之前，完整冻干视网膜的表面与特征圆柱形ROS紧密匹配。

在最初的胶带剥离后，ROS和RIS似乎被完全去除，正如残留的，剥离的冻干视网膜表面上存在的均匀核层所证明的那样。随后的胶带剥离从剥离层的自由表面上除去RIS。该技术还表明，GRK1免疫反应性在光暴露的视网膜中的ROS样品中最强烈，而在OIS样品中不存在。

相反，ROS和RIS样品显示出PKCα的微弱信号，这在ROS或RIS中通常不能通过免疫荧光染色检测到。最后，次优的胶带剥离可能会产生轻微污染的样品。RIS样品被一些OIS样品污染，产生G beta 5L和G beta 5S波段，以及更高的PKC alpha信号。

冻干视网膜时必须小心。如果使用不正确的冻干技术，视网膜可能会融化，从而无法通过胶带分离不同的杆亚细胞层。将这种胶带剥离方法与qRT-PCR结合使用，可以将光感受器转录本与视网膜的其余部分分离。