体外模拟旁非规范Wnt信号传导

本研究概述了一种高度可重复和易于处理的体外研究旁分泌非典型Wnt信号事件的方法 。 该协议用于评估旁分泌Wnt5a信号传导对小鼠神经嵴细胞和成肌细胞的影响。

该协议概述了一种高度可重复的方法，可在功能和分子上评估任何感兴趣的细胞群中的旁分泌非规范Wnt信号传导。功能和分子评估在同一细胞群中进行，可用于研究Wnt/PCP途径的任何成分。首先，将先前沉淀的C2C12细胞重悬于10毫升C2C12培养基中。

为了以1:20的比例稀释细胞，在含有9.5毫升新鲜C2C12培养基的15毫升管中加入0.5毫升细胞悬液，并使用P1000移液管与血清移液器轻轻混合，将一毫升稀释的细胞悬液加入新的四室孔的每个孔中，并将其置于培养箱中。对于电镀O9-1细胞插入物，将O9-1细胞沉淀重悬于10毫升O9-1生长培养基中。与C2C12细胞稀释类似，以1:20的比例稀释O9-1细胞。

接下来，将单个渗透性插入物放入充满一毫升O9-1生长培养基的新四室孔的每个孔内。向每个插入物中加入300微升稀释的O9-1细胞悬液，并确保插入物完全浸没。然后将孔在37摄氏度下孵育。

要在O9-1细胞中进行siRNA敲低，请根据制造商的建议以所需浓度稀释还原血清培养基中的siRNA和转染试剂。轻轻混合稀释的siRNA和转染试剂，并在室温下孵育混合物7分钟。细胞接种18至24小时后，将siRNA脂质复合物加入O9-1细胞插入物中并孵育约34至48小时。

当细胞达到70%至80%汇合度时，从C2C12室中取出培养基并用PBS洗涤细胞一次。取出PBS后，通过向单个方向牢固地通过无菌P10移液器尖端以跨越细胞单层的整个长度或宽度来开始刮擦细胞。一旦细胞被划伤，迅速加入一毫升PBS。

接下来，打开计算机和显微镜。将腔室载玻片放在载物台上，并将物镜转盘旋转至5倍放大倍率。打开映像软件。

单击相机选项卡，然后单击实时按钮以可视化 AxioCam IC 选项卡上的单元格。确保将滤光片完全拉出，以使光线通过相机和计算机屏幕，手动移动或旋转腔室载玻片以将伤口区域定位在AxioCam IC选项卡上实时图像的中心。要拍摄图像，请单击捕捉以打开包含图像的 AxioCam IC 选项卡旁边的新选项卡。

要保存此静止图像，请单击文件，选择另存为，在左侧栏中选择桌面以将文件保存到桌面，在文件名框中输入文件名并以czi文件格式保存图形。若要将图片另存为 tiff，请单击"文件"，选择"另存为"，在"文件名"框中输入文件名。单击保存类型按钮，然后从下拉菜单中选择 tiff。

手动重新定位腔室载玻片，在同一孔中伤口的其他点再拍摄两到三张图像。成像后，从每个孔中取出PBS并加入一毫升C2C12培养基。通过将含有O9-1细胞的插入物手动放置在腔室孔的每个孔中来组装孔插入共培养系统。

轻轻地将插入物向下推入孔中，使插入物的底部位于下面的C2C12细胞上方。将孔插入构建体返回培养箱，并让细胞迁移总共 9 到 12 小时。为了确定最佳迁移时间，请在伤口形成后六小时检查细胞，然后每两到三个小时检查一次。

当对照条件下的细胞完全覆盖伤口时结束实验。在迁移期 9 至 12 小时后，通过移除 O9-1 细胞插入物开始迁移测定终止和孔插入系统解构。小心吸出C2C12培养基。

向腔室孔中加入0.5毫升PBS，并在迁移后拍摄细胞的最终图像。小心地吸出所有与培养基混合的PBS，并使用试剂盒说明从腔室孔中取出塑料室。留下包含 C2C12 单元格的底层幻灯片。

对于免疫染色，立即将载玻片与4%多聚氰醛在室温下孵育10分钟。然后除去多聚甲醛，并在室温下用含有PBST的0.1%Triton X-100洗涤载玻片15分钟。15分钟后，倒出PBST并用PBS清洗载玻片两次，每次10分钟。

然后在载玻片周围用疏水笔创建一个疏水边界，以防止溶液从载玻片溢出，防止粘附细胞的破坏。接下来，在疏水边界内的载玻片中加入约0.5毫升1%BSA封闭溶液，并在室温下在加湿的载玻片室中孵育载玻片一小时。在孵育结束时，除去封闭溶液，并在疏水边界内将鬼笔环肽抗体添加到该载玻片中，并在4摄氏度下孵育过夜。

第二天，将载玻片放在避光的载玻片架中。在室温下用PBS洗涤细胞三次，每次10分钟。添加含DAPI的封片剂，用玻璃盖玻片安装载玻片，并使用标准荧光显微镜捕获细胞。

在本研究中，将重组Wnt5a添加到共培养孔中加速了肌母细胞迁移，一些区域完全恢复了9小时。所有三种条件下的迁移性成肌细胞均表现出正常的迁移细胞形态，包括形成良好且突出的丝状伪足和板状伪足以及肌动蛋白细胞骨架突起的不对称极化。研究了NCC衍生的Wnt5a对肌母细胞迁移的旁分泌效应。

与阴性对照相比，用50纳摩尔siRNA对Wnt5a进行处理可使Wnt5a基因表达降低64%。在NCC中Wnt5a敲低后，C2C12英里爆炸的迁移显着减少，并且添加了外源重组Wnt5a，挽救了这些成肌细胞中的这种迁移缺陷和形态缺陷。为了更好地理解旁分泌模型中的信号接收细胞机制，ROR2受体被敲低，基因表达降低54%尽管存在NCC，但成肌细胞中ROR2的敲低降低了它们的迁移能力。

外源性重组Wnt5a未能在ROR2敲低后拯救肌母细胞迁移，这表明ROR2耗竭破坏了成肌细胞接收Wnt5a信号的能力。用P10尖端将细胞培养到足够的密度划痕，只需一次组装和未组装的共培养系统，小心而不会破坏下面的细胞。该技术被用作概念验证，以研究复杂的Wnt/PCP通路中的特定分子信号轴，与神经嵴细胞和第二心脏野生物学相关。