Name: 体外模拟旁非规范Wnt信号传导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 学习在体外模拟旁分泌非经典Wnt信号传导的方法，利用小鼠神经嵴细胞和C2C12成肌细胞评估Wnt5a信号的功能与分子机制。该方案可重复应用于Wnt/PCP通路研究。

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本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目F30HL154324（授予O.T.）以及K08HL121191和R03HL154301（授予S.R.K.）的支持。作者希望说明，本文中图1的示意图是使用biorender.com制作的。

1. 实验前细胞的扩增与传代
<ol>
	<li>C2C12 细胞培养
	<ol>
		<li>通过将杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）与10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素混合，制备500 mL C2C12细胞培养基。</li>
		<li>在37 °C水浴中解冻一管C2C12细胞。细胞解冻的同时，在15 mL离心管中加入5 mL C2C12培养基。使用P1000移液器立即将解冻的细胞转移至15 mL离心管中。 
		注意：C2C12 细胞是小鼠成肌细胞，既往已被使用并验证为模拟心肌母细胞前体的主要细胞系。</li>
		<li>使用移液管轻轻混匀锥形管中的C2C12细胞。然后，将解冻的C2C12细胞完全转移至6 mL C2C12培养基中，并接种于75 cm²培养瓶中。2 烧瓶</li>
		<li>向烧瓶中加入 6 mL 新鲜 C2C12 培养基，终体积为 12 mL。轻轻旋转烧瓶，使细胞与培养基溶液覆盖烧瓶底部的整个表面。将烧瓶置于细胞培养箱（37 °C，5% CO₂）中。2) 以使细胞贴壁。</li>
		<li>在培养箱中培养细胞，直至其融合度达到约60%。 
		注意：可通过定期将细胞从培养箱中取出，并在显微镜下快速检查其汇合度来确定。务必尽量减少细胞离开培养箱的时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>C2C12细胞传代
	<ol>
		<li>将C2C12培养基、500 mL 1x PBS和0.25%胰蛋白酶-EDTA置于37 °C水浴中预热。待试剂完全预热后，将其全部转移至细胞培养操作台。</li>
		<li>将含有C2C12细胞的培养瓶放入细胞培养操作台。用预热的1×PBS轻轻冲洗含有C2C12细胞的培养瓶两次。
		<ol>
			<li>将培养瓶倾斜至45°角，使用连接真空负压的玻璃移液管吸除C2C12培养基。保持45°角，用血清移液管小心地向培养瓶的一角加入10 mL温热的1×PBS。将培养瓶平放于台面，轻柔地以画圆方式移动培养瓶，确保1×PBS充分洗涤整个单层细胞。 
			注意：吸除培养基时需小心，避免破坏C2C12单层细胞。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第二次洗涤后移除1x PBS。向培养瓶中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，轻轻晃动培养瓶（操作如上所述），使胰蛋白酶-EDTA溶液尽可能均匀覆盖单层细胞，随后将培养瓶放入培养箱中孵育2 min。</li>
		<li>孵育2分钟后，将培养瓶从培养箱中取出，轻轻敲击以使残留的细胞脱落。</li>
		<li>加入9 mL C2C12培养基至含有胰蛋白酶的培养瓶中，以终止消化反应。使用血清移液管轻轻冲洗细胞，并收集10 mL含细胞的消化液。将10 mL细胞悬液转移至新的15 mL离心管中，在100 × g 5 分钟。</li>
		<li>将锥形管放回细胞培养操作台，用连接真空吸引装置的玻璃移液管吸除上清液。吸取上清液时，注意不要扰动锥形管底部的细胞沉淀，为此应保留约0.2 mL上清液在管中。用10 mL新鲜C2C12培养基重悬细胞。</li>
		<li>如需进一步传代，将1 mL重悬的细胞加入75 cm²培养瓶中2 锥形瓶。用血清移液管向锥形瓶中加入11 mL C2C12培养基，并将锥形瓶放入培养箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>STO 细胞培养
	<ol>
		<li>配制STO培养基：将500 mL DMEM中加入7% FBS、1%青霉素/链霉素和2 nM L-谷氨酰胺。</li>
		<li>将0.5 g明胶粉末加入含有500 mL组织级水或高压灭菌水的瓶中，配制0.1%明胶溶液。向75 cm²培养瓶中加入7 mL 0.1%明胶溶液。2 培养瓶。旋转培养瓶，使明胶溶液覆盖瓶底的整个表面。将培养瓶置于细胞培养超净台中，室温孵育30分钟。</li>
		<li>孵育30分钟后，使用连接真空抽吸装置的移液器除去多余的明胶。将培养瓶在使用前继续置于培养箱中静置30分钟。</li>
		<li>在37 °C水浴中解冻一管STO细胞。使用P1000移液器，立即将解冻的细胞转移至含有5 mL新鲜配制的STO培养基的15 mL锥形管中。 
		注意：STO细胞是小鼠胚胎成纤维细胞，常在细胞培养方案中用作饲养层细胞。</li>
		<li>用移液管轻轻混匀锥形管中的细胞。将全部细胞悬液（6 mL）加入经明胶包被的75 cm²培养瓶中。2 培养瓶。旋转培养瓶，确保细胞悬液均匀分布于瓶底。</li>
		<li>向烧瓶中加入6 mL新鲜STO培养基，使总体积达到12 mL。按照上述方法旋转烧瓶，确保细胞和培养基均匀分布于烧瓶底部。将烧瓶放入37 °C培养箱中，使细胞贴壁。在培养箱中培养细胞，使其增殖至约60–70%汇合度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>STO细胞传代
	<ol>
		<li>将STO细胞培养基、1×PBS和0.25%胰蛋白酶-EDTA置于37 °C水浴中预热。</li>
		<li>用预热的1×PBS按照步骤1.2.2.1所述方法，将含有STO细胞的培养瓶轻轻冲洗两次。</li>
		<li>使用 P1000 移液器向培养瓶中加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。将培养瓶置于 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟。</li>
		<li>孵育5分钟后，从培养箱中取出培养瓶。轻轻敲击培养瓶，使贴壁细胞脱落。</li>
		<li>向烧瓶中加入 9 mL STO 培养基以终止胰蛋白酶消化，并按上述方法收集 10 mL 胰蛋白酶消化后的细胞悬液。取 10 mL 细胞悬液加入 15 mL 圆底离心管中，于 100 × g 5 分钟。</li>
		<li>移除上清液，并将细胞重悬于 10 mL STO 培养基中，操作同上。如需进一步传代，取 1 mL 重悬的细胞加入至 75 cm² 培养瓶中。2 锥形瓶中加入11 mL STO培养基，轻轻旋转锥形瓶以确保细胞和培养基在瓶底均匀分布，然后将锥形瓶放入培养箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>STO 细胞培养物的失活及 O9-1 细胞基础培养基的制备：
	<ol>
		<li>将500 mL DMEM与15% FBS、1%青霉素/链霉素、2 nM L-谷氨酰胺、0.1 mM最低非必需氨基酸、1 nM丙酮酸钠和55 µM β-巯基乙醇混合，制备O9-1细胞基础培养基。</li>
		<li>在1×PBS中配制浓度为0.5 mg/mL的丝裂霉素C溶液：将4 mL 1×PBS直接加入丝裂霉素C小瓶中。使用P1000移液器反复吹打溶液多次。为促进丝裂霉素C在1×PBS中的充分溶解，将小瓶置于涡旋振荡器或台式摇床上振荡45分钟至1小时。</li>
		<li>通过向标准STO培养基中添加终浓度为0.01 mg/mL的丝裂霉素C处理STO培养板，使STO细胞失活。将STO培养板放入培养箱中孵育2小时，注意尽量减少含丝裂霉素C的培养瓶在培养箱外的暴露时间，以避免光照。丝裂霉素处理后，按照步骤1.2.2.1所述，用1×PBS洗涤细胞两次。 
		注意：丝裂霉素C可抑制STO细胞的增殖，使其在数天内持续产生条件培养基，而不会在培养瓶中过度汇合。</li>
		<li>除去1×PBS后，向灭活的STO细胞培养物中加入12 mL O9-1基础培养基，于37°C孵育24小时。收集经条件化处理的灭活STO + O9-1基础培养基，置于50 mL锥形管中，并用铝箔包裹以避光保存。</li>
		<li>向灭活的STO细胞培养物中加入12 mL新鲜的O9-1基础培养基，操作如上所述。每隔24小时，向含有灭活STO细胞的同一侧继续添加新鲜的O9-1基础培养基，重复此步骤。 
		注意：经丝裂霉素C处理后，失活的STO细胞无法增殖；因此，含有失活STO细胞的培养瓶可重复用于制备条件培养基。</li>
		<li>将装有经条件处理并灭活的 STO + O9-1 基础培养基的铝箔包裹的 50 mL 锥形管置于 4 °C 保存，直至收集总量达到 500 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>O9-1 细胞培养：
	<ol>
		<li>使用500 mL的条件化STO + O9-1基础培养基配制O9-1细胞生长培养基，并加入103 白血病抑制因子（LIF）单位和25 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（basic-FGF）。</li>
		<li>按照步骤1.3.2-1.3.3所述方法制备0.1%明胶包被的培养瓶。</li>
		<li>将一管O9-1细胞在37 °C水浴中解冻。立即将解冻后的细胞转移至含有5 mL新鲜配制的O9-1生长培养基的15 mL锥形管中。 
		注意：O9-1 细胞系是目前唯一由小鼠来源建立的稳定、多能性神经嵴细胞系，该细胞系常用于神经嵴相关研究。 体外 实验</li>
		<li>使用移液管轻轻混匀细胞。将全部6 mL细胞悬液加入经明胶包被的75 cm²培养瓶中。2 烧瓶</li>
		<li>向烧瓶中加入6 mL O9-1生长培养基，终体积为12 mL。将烧瓶置于37 °C培养箱中，使细胞贴壁。在培养箱中继续培养细胞，直至其融合度达到约60–70%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>O9-1 细胞传代
	<ol>
		<li>将 O9-1 培养基、1× PBS 和 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 置于 37 °C 水浴中预热。</li>
		<li>用预热的1×PBS按照步骤1.2.2.1所述方法，轻轻冲洗含有O9-1细胞的培养板两次。</li>
		<li>向培养瓶中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，置于37 °C培养箱中孵育5 min。</li>
		<li>孵育5分钟后，从培养箱中取出培养瓶，轻轻敲击培养瓶以使贴壁细胞脱落。</li>
		<li>加入 9 mL O9-1 生长培养基至培养瓶中以终止胰酶消化。收集 10 mL 胰酶消化后的细胞悬液，取 10 mL 该细胞悬液加入 15 mL 圆底离心管中。将离心管以 100 × g 5 分钟。</li>
		<li>移去上清液，将细胞重悬于 10 mL O9-1 生长培养基中。如需进一步传代，取 1 mL 重悬的细胞加入至 75 cm² 培养瓶中2 烧瓶中加入11 mL O9-1生长培养基，将含有细胞的烧瓶置于12 mL培养基中，放入37 °C培养箱内。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在共培养系统中接种细胞
<ol>
	<li>接种 C2C12 细胞培养室：
	<ol>
		<li>消化后（如步骤 1.2 所述），将 C2C12 细胞沉淀重悬于 10 mL C2C12 培养基中。以 1:20 的比例在 C2C12 培养基中稀释细胞：取 0.5 mL 重悬的 C2C12 细胞，加入含有 9.5 mL 新鲜 C2C12 培养基的新 15 mL 离心管中。用移液管轻轻混匀细胞悬液。</li>
		<li>使用 P1000 移液器将 1 mL 1:20 稀释的 C2C12 细胞悬液加入新的四室培养板的每个孔中，并将四室培养板放入培养箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种 O9-1 细胞插入式培养小室：
	<ol>
		<li>消化后，将 O9-1 细胞沉淀重悬于 10 mL O9-1 生长培养基中。以 1:20 的比例在 O9-1 生长培养基中稀释细胞：取 0.5 mL 重悬的 C2C12 细胞（注：原文此处应为 O9-1 细胞，疑似笔误），加入含有 9.5 mL 新鲜 O9-1 生长培养基的新 15 mL 离心管中。用移液管轻轻混匀细胞悬液。</li>
		<li>将单个可渗透性插入式小室（见材料表）放入已加入 1 mL O9-1 生长培养基的新四室培养板的每个孔中。 
		注意：此四室培养板应与步骤 2.1.3 中含 C2C12 细胞的培养板不同。</li>
		<li>使用 P1000 移液器向每个插入式小室中加入 300 µL 稀释后的 O9-1 细胞悬液。确保每个插入式小室的底部浸没在含有 1.3 mL O9-1 生长培养基的孔中。将培养板置于 37 °C 培养箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>（可选）在 O9-1 细胞或 C2C12 细胞中进行 siRNA 沉默。
	<ol>
		<li>在接种 O9-1 细胞插入式小室或 C2C12 细胞培养室后 18–24 小时进行 siRNA 基因沉默。
		<ol>
			<li>根据生产商推荐及实验所需的浓度，将 siRNA 和转染试剂稀释于低血清培养基中（见材料表）。将稀释后的 siRNA 与转染试剂按 1:1 比例轻轻混合，并在室温下孵育 7 分钟。 
			注意：本实验方案中使用 50 nM 的 siRNA 浓度，该浓度已被证实可有效降低目标基因的表达水平。</li>
			<li>根据实验设计，将 siRNA-脂质复合物加入 O9-1 细胞插入式小室或 C2C12 细胞培养室中，并让细胞与 siRNA-脂质复合物共孵育约 36–48 小时。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 进行划痕实验并定量评估成肌细胞迁移
<ol>
	<li>伤口愈合实验：
	<ol>
		<li>让O9-1细胞插入物和C2C12细胞培养室小室在培养箱中贴壁并增殖，直至两种细胞均达到约70–80%汇合度，再进行本实验步骤。若细胞生长 &#62;细胞融合度达到90%时，不要进行划痕实验，否则细胞会从孔壁上脱落。</li>
		<li>将1×PBS和C2C12培养基置于37 °C水浴中预热。</li>
		<li>从 C2C12 培养室小孔中移除上清液，并用 1× PBS 洗涤细胞一次。吸除 1× PBS 后，立即使用无菌 P10 移液器吸头划线刮伤细胞。
		<ol>
			<li>用无菌的P10枪头以单向用力的方式划过细胞单层的整个长度或宽度（例如从右到左、从上到下）。确保每个含细胞的孔仅划一次。 
			注意：为获得最佳划痕效果，应在相似的细胞汇合度下对不同实验条件的孔进行划痕。为此，需确保每个4孔板中的每个孔都包含各自实验条件所需的细胞（例如，孔#1为阴性对照，孔#2为阳性对照）。此外，每次划痕应使用新的无菌P10移液枪头，并每次施加相似的力度。禁止在每个孔中制造多个划痕。</li>
			<li>划痕后，立即使用 P1000 移液器吸头向孔中加入 1 mL 1×PBS。对需要划痕的每个孔重复此操作。 
			注意：由于每个划痕存在变异性，建议在每种实验条件下使用多个孔（n = 3）进行划痕操作。操作应迅速进行，以尽量缩短细胞在这些步骤中处于无1x PBS状态的时间。在从每个孔中移除1x PBS后，应在5秒内完成每个孔的划痕。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在制造伤口并向每个孔中加入1×PBS后，使用倒置明场显微镜对划痕进行成像，并将此图像作为伤口初始大小的基线（0时间点）。进行成像时，请执行以下步骤：
		<ol>
			<li>打开计算机和显微镜（参见 材料表) 按下电源按钮启动设备。将培养皿载玻片放置于载物台上，并旋转物镜转盘至5倍放大倍数。</li>
			<li>打开成像软件（参见 材料表) 通过双击计算机桌面上的软件图标启动。单击 相机 软件主界面上的标签。点击 活体 按钮以可视化细胞 AxioCam IC 表。</li>
			<li>确保将光滤镜完全拉出，以允许光线通过至相机和计算机屏幕。手动移动和/或旋转培养小室载玻片，使伤口区域位于实时图像的中央 AxioCam IC 表。</li>
			<li>要拍摄图像，请单击 快照 打开一个 新 标签旁边的下一个 AxioCam IC 包含图像的标签页</li>
			<li>要保存此静态图像，请单击 文件 位于软件主页的左上角 | 另存为 | 输入 文件名 在文件名框中。将图像保存为 Carl Zeiss 图像（*.czi）格式（默认设置），并选择 桌面 在左侧的工具栏上点击以将文件另存到桌面 .czi 文件，该文件只能在 Zen lite 2012 软件程序中打开。</li>
			<li>要将图片另存为 .tiff 格式，请单击 文件 | 另存为 | 进入 文件名 在文件名框中。将图像另存为标记图像文件 (*.tiff) 通过点击 保存类型 按钮并选择 *.tiff 从下拉菜单中。 
			注意：.tiff 格式的文件可在任何图像处理软件中打开。</li>
			<li>手动重新定位腔室载玻片，在同一孔中伤口的其他位置再采集2-3张图像。 
			注意：每个孔将总共获得3-4张无重叠的高倍镜伤口图像。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>吸除每孔中的1×PBS，加入1 mL C2C12培养基。 
		注意：在伤口生成后向培养小室孔中移除或添加溶液时，切勿过于剧烈地使用移液器，以免导致细胞从培养小室孔中脱落。此外，应倾斜培养小室孔，使溶液的吸取和重新加入可在每个孔的角落进行，以最大程度减少对细胞单层的扰动。</li>
		<li>将含有 O9-1 细胞的插件手动放入培养板各孔中，组装小室插件共培养系统。轻柔下压插件，使其底部刚好位于下方 C2C12 细胞的上方。将插件培养装置放回培养箱中。 
		注意：切勿使插入物底部直接接触并机械干扰下方的C2C12细胞。</li>
		<li>让细胞迁移总共 9–12 小时。为确定最佳迁移时间，可在划痕后 6 小时首次观察细胞，之后每隔 2–3 小时观察一次。当对照组或阳性对照组的细胞开始完全覆盖划痕区域时，终止实验。 
		&#8203;注意：由于该装置具有非接触特性，在观察迁移进程时无需从孔中取出上方的插入物。迁移的差异性将取决于多种因素，例如本实验所用的细胞类型、划痕生成时的细胞密度、所形成划痕的宽度以及经处理细胞的实验条件（如基因敲低、添加重组蛋白等）。这些试剂的浓度应根据制造商的建议，并通过实验优化确定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 迁移性成肌细胞的免疫荧光染色与成像
<ol>
	<li>终止迁移实验并拆卸小室插入系统：
	<ol>
		<li>在 O9-1 细胞迁移 9–12 小时后（或根据实验条件指定的其他时间点）移除细胞插入物。使用 P1000 移液器小心吸除 C2C12 培养基。向小室孔中加入 0.5 mL 的 1× PBS，并在细胞迁移完成后拍摄最终图像。</li>
		<li>小心吸除与培养基混合的全部 0.5 mL 1× PBS，并按照试剂盒说明书将塑料小室从孔中取出，仅保留含有 C2C12 细胞的底层玻片。 
		注意：移除小室时需小心，避免扰动贴附在玻片上的 C2C12 细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行免疫染色：
	<ol>
		<li>立即将玻片放入含有 4% 多聚甲醛（PFA）的玻片架中，在室温下孵育 10 分钟。倒出 4% PFA，加入含 0.1% Triton X-100 的 1× PBS（1× PBST）至玻片架中，在室温下洗涤玻片 15 分钟。倒出 1× PBST，加入 1× PBS 至玻片架中，在室温下洗涤 10 分钟。重复此步骤一次，共进行两次 1× PBS 洗涤。</li>
		<li>将玻片从玻片架中取出。使用疏水笔沿玻片外缘描画，形成疏水边界，以防止溶液从玻片上溢出。操作时注意避免扰动贴壁细胞。</li>
		<li>向玻片上加入 1% 牛血清白蛋白（BSA）封闭液（用 1× PBS 稀释，每张玻片约 0.5 mL）。确保溶液位于第 4.2.4 步形成的疏水边界内。将玻片置于湿盒中，在室温下孵育 1 小时。 
		注意：尽管鬼笔环肽（phalloidin）免疫染色无需 BSA 封闭，但本步骤可为后续联合使用荧光抗体染色提供便利。</li>
		<li>封闭 1 小时后，倒出封闭液，向玻片上加入鬼笔环肽抗体（用 1% BSA 封闭液按 1:200 稀释，即 5 µL 抗体加入 995 µL BSA 溶液），并在 4 °C 下避光孵育过夜。再次确保溶液位于第 4.2.4 步形成的疏水边界内。由于鬼笔环肽抗体偶联了 Alexa Fluor-488 荧光染料，因此在加入玻片前后均应尽量减少抗体试剂的光照暴露。</li>
		<li>次日，将玻片置于避光的玻片架中（例如用铝箔包裹玻片架或使用不透光的玻片架）。在玻片架中用 1× PBS 在室温下洗涤 10 分钟，重复洗涤共三次，每次 10 分钟。</li>
		<li>加入含 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂，并用盖玻片封片。使用标准荧光显微镜观察已迁移的细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ho, H. Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a-Ror-Dishevelled+signaling+constitutes+a+core+developmental+pathway+that+controls+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).</li>
<li>Čapek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+Frizzled7+reveals+a+permissive+role+of+noncanonical+wnt+signaling+in+mesendoderm+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration.</a> Elife. (8), 42093(2019).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+signaling+regulates+polarized+second+heart+field+morphogenesis+to+promote+both+arterial+and+venous+pole+septation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation.</a> Development. 146 (20), 181719(2019).</li>
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<li>Descamps, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled+4+regulates+arterial+network+organization+through+noncanonical+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling.</a> Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).</li>
<li>Weeraratna, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+signaling+directly+affects+cell+motility+and+invasion+of+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma.</a> Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).</li>
<li>Henry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+novel+Wnt+receptor+ROR2+is+increased+in+breast+cancer+and+may+regulate+both+%CE%B2-catenin+dependent+and+independent+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).</li>
<li>Anastas, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+complex+of+SCRIB%2C+NOS1AP+and+VANGL1+regulates+cell+polarity+and+migration%2C+and+is+associated+with+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression.</a> Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).</li>
<li>Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+world+of+WNT+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The complex world of WNT receptor signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).</li>
<li>Dong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+redundancy+of+frizzled+3+and+frizzled+6+in+planar+cell+polarity+control+of+mouse+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles.</a> Development. 145 (19), (2018).</li>
<li>Bernascone, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sfrp3+modulates+stromal-epithelial+crosstalk+during+mammary+gland+development+by+regulating+Wnt+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 2481(2019).</li>
<li>Hendrickx, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT16+requires+G%CE%B1+subunits+as+intracellular+partners+for+both+its+canonical+and+noncanonical+WNT+signalling+activity+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts.</a> Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).</li>
<li>Avgustinova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+cell-derived+Wnt7a+recruits+and+activates+fibroblasts+to+promote+tumour+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness.</a> Nature Communications. (7), 10305(2016).</li>
<li>Tseng, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAPE+suppresses+migration+and+invasion+of+prostate+cancer+cells+via+activation+of+noncanonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling.</a> Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Wnt%2FCa2%2B+signaling+in+actin+cytoskeleton+remodeling+and+cell+motility+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer.</a> PLoS One. 5 (5), 10456(2010).</li>
<li>Gibbs, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prickle1+mutation+causes+planar+cell+polarity+and+directional+cell+migration+defects+associated+with+cardiac+outflow+tract+anomalies+and+other+structural+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects.</a> Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).</li>
<li>Cui, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+PCP+protein+required+for+ciliogenesis%2C+regulates+directional+cell+migration+and+cell+polarity+by+direct+modulation+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton.</a> PLoS Biology. 11 (11), 1001720(2013).</li>
<li>Gombos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formin+DAAM+functions+as+molecular+effector+of+the+planar+cell+polarity+pathway+during+axonal+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).</li>
<li>Toubat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Crest+Cell-derived+Wnt5a+Regulates+Planar+Cell+Polarity+in+Cranial+Second+Heart+Field+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells.</a> Circulation. 142, Suppl_3 12540(2020).</li>
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<li>Waldo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neural+crest+is+necessary+for+normal+addition+of+the+myocardium+to+the+arterial+pole+from+the+secondary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field.</a> Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).</li>
<li>Schleiffarth, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+is+required+for+cardiac+outflow+tract+septation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice.</a> Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).</li>
<li>Nguyen, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+Manipulation+of+O9-1+Neural+Crest+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).</li>
<li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).</li>
<li>Martinotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratch+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).</li>
</ol>

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

非经典Wnt/平面细胞极性（PCP）信号通路是一种至关重要的细胞信号通路，已被证实参与多种发育过程24,25 和疾病过程24,26在胚胎发育过程中，非经典 Wnt 信号传导涉及来自信号发送细胞的庞大分子信号网络，最终诱导信号接收细胞在形态、不对称结构和定向迁移方面发生改变11先前的研究表明，驱动该信号传导的特异性配体-受体通路具有多样性，依赖于具体环境，并且常因细胞类型不同而有所差异。12,13,14,15由于这种分子复杂性，评估旁分泌非经典通路的能力 Wnt 使用传统...

非经典Wnt信号通路是一种在进化上保守的通路，可调控细胞丝状结构的组织及定向迁移。该通路参与多种生物学过程，包括胚胎组织形态发生1,2,3淋巴管和血管生成4,5,6,7，以及癌症生长和转移8,9,10在细胞水平上，非经典Wnt信号通路通过信号发送细胞与信号接收细胞之间协调的旁分泌相互作用来实现。这些相互作用常发生在不同谱系或类型的细胞之间，涉及一个复杂的分子网络，其中包括多达19种配体以及多种受体、共受体和下游信号转导效应分子。11此外，先前的研究表明，配体-受体组合可因不同环境和组织而异，使该信号传导过程更加复杂12,13，且在信号接收细胞中驱动非经典Wnt信号通路的相同来源配体可由多种信号发送细胞类型产生14,15鉴于非经典Wnt信号通路所涉及的细胞与分子复杂性，研究其中单个且具有临床相关性机制的能力 体内 有限。
已尝试利用细胞培养来研究非经典Wnt信号通路&#160;技术 体外例如，利用细胞单层进行的伤口愈合实验已被用于功能性评估细胞的定向迁移能力4,16,17,18,19免疫染色技术已被用于对表面蛋白表达进行空间分析，以评估非经典Wnt信号诱导的细胞形态变化7,10、结构与不对称极化18,19,20. 尽管这些方法为表征信号接收细胞中与Wnt相关的表型提供了重要工具，但这些方案中缺乏信号发送组分，限制了其准确模拟所观察到的旁分泌信号传导机制的能力 体内因此，仍然迫切需要开发 体外 允许对非经典Wnt信号通路中信号发送细胞与接收细胞之间的旁分泌信号相互作用进行稳健且可重复评估的系统，特别是针对不同类型细胞之间的相互作用。
为此，本研究的主要目标是建立一种用于模拟旁分泌非经典Wnt信号通路相互作用的实验方案 体外 我们开发了一种非接触式共培养系统，可重现这些相互作用中的信号发送与信号接收组分，并允许使用标准的分子、遗传或药理学方法，独立研究非经典Wnt通路中特定的配体-受体机制。利用已建立的小鼠细胞系，在成肌细胞中检测了神经嵴细胞介导的Wnt信号转导机制。作为原理验证，该模型被用于验证先前研究的发现 体内 小鼠研究揭示了 Wnt5a-ROR2 轴作为神经嵴细胞间一种相关的非经典Wnt信号通路21 以及SHF心肌母细胞前体3,22,23.

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td>4 ℃下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2323</td><td>4 ℃ 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>C2C12 小鼠成肌细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶，75 cm²&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>4孔板式培养皿系统</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;DMEM高糖培养基（4.5 g/L），含L-谷氨酰胺（2 mM）</td><td>康宁</td><td>10-017-CV</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Falcon 锥形离心管，15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>24孔板用Falcon可渗透支持膜，孔径0.4 &amp;micro;M 透明 PET 膜</td><td>康宁</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3381E</td><td>-20℃下分装保存于50 mL等份中 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>0.1% 明胶溶液</td><td>ATCC</td><td>PCS-999-027</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>10 个带刻度的无菌移液器吸头 &amp;micro;L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3810</td><td></td></tr><tr><td>白血病抑制因子（LIF），106 单位/毫升</td><td>默克生命科学</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM (100倍浓缩液)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸（MEM NEAA）100×</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基（MEM）</td><td>康宁</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>丝裂霉素C</td><td>罗氏</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>防粘连自动盖玻片，24 x 55 mm</td><td>Springside Scientific</td><td>HRTCG2455</td><td></td></tr><tr><td>O9-1 神经嵴细胞系</td><td>默克生命科学</td><td>SCC049</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I, 1x</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>PBS 中的 4% 多聚甲醛溶液</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>4 ℃下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL 青霉素和 10,000 &amp;mu;g/mL 链霉素）</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3470H</td><td>-20℃下以10 mL等分试样保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>鬼笔环肽-iFluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C，避光</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），1×，不含钙和镁，pH 7.4</td><td>康宁</td><td>21-040-CV</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>重组人碱性成纤维细胞生长因子（rhFGF-basic）</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>重组人/小鼠 Wnt5a 蛋白</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>645-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠，100 mM</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>带网格的方形培养皿</td><td>托马斯科学公司</td><td>1219C98</td><td></td></tr><tr><td>STO 小鼠成纤维细胞饲养层细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3513C</td><td>4 ℃下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>蔡司 Apotome.2 荧光显微镜</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔡司倒置 Axio Vert.A1 光学显微镜</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen lite 2012 显微镜软件</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td></td><td>成像软件</td></tr></tbody></table>

模拟旁分泌非经典wnt信号通路 体外

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

非经典Wnt信号通路在胚胎发生过程中调控细胞内肌动蛋白丝的组装以及前体细胞的极化迁移。该过程需要信号发出细胞与信号接收细胞之间复杂而协调的旁分泌相互作用。鉴于这些相互作用可发生于来自不同谱系的多种类型细胞之间， 体内 评估细胞特异性缺陷可能具有挑战性。本研究描述了一种高度可重复的方法，用于评估旁分泌非经典Wnt信号通路 体外 本方案设计旨在实现以下目标：（1）对任意两种目标细胞之间的非经典Wnt信号通路进行功能与分子水平的评估；（2）解析非经典Wnt信号通路中信号发送分子与信号接收分子各自的作用；（3）采用常规分子生物学或药理学方法开展表型挽救实验。
本方案用于评估神经嵴细胞（NCC）介导的成肌细胞非经典Wnt信号通路。成肌细胞中存在神经嵴细胞与肌动蛋白丝（phalloidin阳性）胞质丝状伪足和片状伪足数量增加相关，并可改善划痕愈合实验中成肌细胞的迁移能力。 Wnt5a-ROR2 轴被确定为神经嵴细胞（NCC）与第二心区（SHF）心肌母细胞前体之间关键的非经典Wnt信号通路。总之，这是一种高度可行的方案，可用于研究旁分泌型非经典Wnt信号机制 体外.

神经嵴细胞对小鼠成肌细胞迁移能力的影响 
本实验首先用于评估神经嵴细胞（NCCs）对成肌细胞迁移能力的影响。图1展示了该实验的示意图。为检测这一影响，对单独培养（无NCC插入物）的成肌细胞与共培养（含NCC插入物）的成肌细胞分别进行了划痕实验。作为阳性对照，在含有NCC插入物的培养室中加入500 ng/mL重组Wnt5a（rWnt5a）。该rWnt5a浓度是通过在C2C12细胞中进行剂量-反应分析确定的（补充图S1）。补充图S2展示了NCC插入物的代表性图像，表明在此时间点NCCs状态良好。免疫荧光结果显示，在使用50 nM Wnt5a siRNA孵育后，Wnt5a蛋白水平显著降低（补充图S3）。经过9小时的迁移后发现，与未添加NCC插入物的成肌细胞相比，NCC的存在显著提高了成肌细胞的迁移能力（伤口再填充面积分别为72.6%和59.1%，p = 0.033）。在共培养孔中添加rWnt5a可进一步加速成肌细胞迁移，部分伤...

本研究概述了一种高度可重复且易于操作的方法，用于在体外研究旁分泌非经典Wnt信号事件。in vitro。该方案已应用于评估旁分泌Wnt5a信号对小鼠神经嵴细胞和成肌细胞的影响。

模拟旁分泌非经典Wnt信号通路 体外

非经典Wnt信号通路在胚胎发生过程中调控前体细胞内肌动蛋白丝的排列及极化迁移。

本方案概述了一种高度可重复的方法，用于在任何目标细胞群体中从功能和分子层面评估旁分泌的非经典Wnt信号通路。功能性和分子评估在同一细胞群体中进行，可用于研究Wnt/PCP通路的任何组分。首先，将先前沉淀的C2C12细胞重悬于10毫升C2C12培养基中。按1:20的比例稀释细胞：将0.5毫升细胞悬液加入含有9.5毫升新鲜C2C12培养基的15毫升离心管中，使用P1000移液器配合血清学移液管轻轻混匀。随后，将1毫升稀释后的细胞悬液加入新的四孔板的每个孔中，并将培养板放入培养箱内。对于O9-1细胞插入式培养插件的接种，将O9-1细胞沉淀重悬于10毫升O9-1生长培养基中。参照C2C12细胞的稀释方法，按1:20的比例稀释O9-1细胞。接下来，将一个可渗透的插入式培养小室放入新四孔板的每个孔中，每个孔内含有1毫升O9-1生长培养基。向每个插入式培养小室中加入300微升稀释后的O9-1细胞悬液，并确保插入式培养小室完全浸没。随后将培养板置于37摄氏度下孵育。为了在 O9-1 细胞中进行 siRNA 沉默，按照生产商推荐的方法，将 siRNA 和转染试剂用低血清培养基稀释至所需浓度。轻轻混合稀释后的 siRNA 和转染试剂，并在室温下孵育 7 分钟。细胞铺板后 18 至 24 小时，将 siRNA 脂质复合物加入 O9-1 细胞插入式培养皿中，孵育约 34 至 48 小时。当细胞达到70%至80%融合度时，从C2C12培养室小孔中移除培养基，并用PBS洗涤细胞一次。移除PBS后，使用无菌P10移液枪头沿单一方向用力划过细胞单层的整个长度或宽度，开始刮伤细胞。细胞划伤后，迅速加入一毫升PBS。接下来，打开计算机和显微镜。将腔室载玻片放置在载物台上，并旋转物镜转盘至 5X 放大倍数。启动成像软件。单击相机选项卡，然后点击“实时”按钮，以在AxioCam IC选项卡上观察细胞。确保将光滤片完全拉出，以便光线能够到达相机和计算机屏幕；手动移动或旋转培养小室载玻片，使伤口区域位于AxioCam IC选项卡实时图像的中央。如需拍摄图像，请点击“抓拍”按钮，将在AxioCam IC选项卡旁打开一个包含图像的新选项卡。要保存此静态图像，请单击文件，选择“另存为”，在左侧栏中选择“桌面”以将文件保存到桌面，在文件名框中输入文件名，并将图像保存为 czi 文件格式。要将图片保存为 tiff 格式，请单击“文件”，选择“另存为”，在文件名框中输入文件名，单击“保存类型”按钮，然后从下拉菜单中选择 tiff。手动调整腔室载玻片位置，在同一孔内的伤口其他位置再采集两到三张图像。成像后，吸去各孔中的PBS，加入1毫升C2C12培养基。通过手动将含有O9-1细胞的插入物放置于腔室板的各孔中，组装孔内插入式共培养系统。轻轻将插入物推入孔中，使插入物底部刚好位于下方C2C12细胞的上方。将含插入物的培养板放回培养箱，使细胞迁移总共9至12小时。为确定最佳迁移时间，可在划痕形成后6小时首次观察细胞，之后每隔2至3小时检查一次。当对照条件下的细胞完全覆盖伤口时，结束实验。在迁移期9至12小时后，通过移除O9-1细胞插入物，开始终止迁移实验并拆解小室插入系统。小心吸除C2C12培养基。向腔室孔中加入 0.5 毫升 PBS，并在细胞迁移后拍摄细胞的最终图像。根据试剂盒说明书，小心吸除与培养基混合的所有 PBS，并将塑料腔室从腔室孔中移除，保留含有 C2C12 细胞的底层载玻片。进行免疫染色时，立即将载玻片在室温下用4%多聚甲醛孵育10分钟。随后去除多聚甲醛，并用含0.1%Triton X-100的PBST在室温下洗涤载玻片15分钟。15分钟后，倒出PBST，并用PBS洗涤载玻片两次，每次10分钟。然后，使用疏水笔在载玻片周围创建一个疏水性边界，以防止溶液溢出载玻片，避免破坏已贴壁的细胞。接着，在疏水边界内加入约0.5毫升的1% BSA封闭液，并将载玻片置于湿盒中，室温孵育1小时。孵育结束后，移除封闭液，并在疏水边界内向载玻片加入鬼笔环肽抗体，于4°C条件下孵育过夜。第二天，将载玻片放入避光的玻片盒中。在室温下用 PBS 洗涤细胞三次，每次 10 分钟。加入含 DAPI 的封片剂，用盖玻片封片，并使用标准荧光显微镜观察细胞。在本研究中，向共培养孔中添加重组Wnt5a可加速成肌细胞迁移，部分区域在9小时内完全恢复。三种条件下的迁移性成肌细胞均表现出正常的迁移细胞形态，包括形态良好的突起丝状伪足和片状伪足，以及肌动蛋白细胞骨架投影的不对称极化。研究了神经嵴细胞来源的Wnt5a对成肌细胞迁移的旁分泌作用。使用50纳摩尔针对Wnt5a的siRNA处理后，Wnt5a基因表达水平较阴性对照组下降了64%。在神经嵴细胞（NCCs）中敲低Wnt5a后，C2C12成肌细胞的迁移能力显著降低；而外源性添加重组Wnt5a蛋白可挽救这些成肌细胞的迁移缺陷及形态学异常。为了更深入理解旁分泌模型中信号接收细胞的作用机制，我们对ROR2受体进行了敲低，其基因表达水平降低了54%。在成肌细胞中敲低ROR2后，即使存在神经嵴细胞，其迁移能力仍显著下降。外源性重组Wnt5a在ROR2敲低后未能挽救成肌细胞的迁移，表明ROR2缺失破坏了成肌细胞接收Wnt5a信号的能力。将细胞培养至适当密度，仅用P10枪头划痕一次，小心构建和拆卸共培养系统，避免破坏底层细胞。该技术作为概念验证被用于研究复杂Wnt/PCP通路中一个特定的分子信号轴，该信号轴与神经嵴细胞及第二心区生物学相关。

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Research

科研

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