通过分子建模方法探究半胱天冬酶突变及翻译后修饰

在启动和执行过程中，利用分子建模发挥关键作用。我们研究翻译后修饰和突变对Caspase结构与功能的影响。我们描述了分子动力学方法，该方法可在原子水平上引入结构修饰后，揭示蛋白质演变过程的动态视图。

这种方法对于理解调控程序性细胞死亡及其相关疾病的机制并开发新的有效疗法具有重要意义。我们展示了使用最流行的工具之一 Amber 20 进行分子建模的能力。但本研究所呈现的方案也可用于该软件的正式版本。

以下视频逐步介绍了如何准备Caspase结构以进行模拟，并对该蛋白质的野生型和修饰型进行ascilica分析。要获取选定的蛋白质数据银行（PDB）结构，请使用下载文件下拉列表并点击PDB格式。从PDB文件中删除备注和连接性数据，并在独立的蛋白质链之间插入TER卡片。

要准备起始模型，请从 Amber Tools 软件包中启动 T-LEAP 程序。然后在命令行中输入指定命令，加载 F F 14 S B 力场，以用于通过分子力学描述蛋白质，以及水分子和原子离子（如钠离子和氯离子）的参数。接下来，加载 P D B 文件，并为氢原子构建坐标，创建一个名为 mol 的对象。

使用 check mol 命令检查可能导致问题的内部不一致性。在蛋白质周围创建溶剂盒。然后通过输入 charge mol 检查总电荷，并添加反离子以中和体系。

输入指定命令以创建拓扑文件 P R M top 和坐标文件 I N P C R D。完成后，退出 T-lEAP 程序。进行第一阶段的能量最小化，以优化所添加的氢原子和水分子的位置，同时通过对重原子施加位置限制来固定蛋白质坐标。

通过输入指定命令来运行 P M E M D 程序。按照我控制的数据提供所需的参数。P 分子拓扑结构、力场参数和原子名称。

C 初始坐标。O 用户可读的日志输出。R 最终坐标。REF，位置限制的参考坐标。

接下来，使用指定命令的输入参数，在无约束条件下进行能量最小化的第二阶段，以优化整个系统。该阶段的目标是将体系从零开尔文加热至300开尔文。通过使用给定命令作为输入，在恒定体积下对蛋白质原子施加位置限制，用50皮秒完成加热过程。

按照分子动力学轨迹中保存的X坐标集合提供所需的参数。下一步需要调节水的密度，并获得蛋白质的平衡状态。在达到平衡后，使用指定命令在300开尔文、恒压条件下进行500皮秒的平衡，且不施加任何限制。

在恒定压力下进行一次长达10纳秒或更长时间的生产阶段分子动力学模拟，并使用指定命令生成轨迹文件，用于后续对蛋白质结构的分析。可在计算机集群和超级计算机上使用程序的并行版本 PMEMD.MPI 或 GPU 加速版本 PMEMD.cuda。长时间的分子动力学模拟可拆分为多个阶段，依次连续执行。

在本项分析中，通过分子动力学模拟工作流程研究了野生型Caspase-2及其丝氨酸-384丙氨酸突变体。丝氨酸-384到丙氨酸的替换在活性位点残基精氨酸-378处诱导了重要的构象变化。此外，研究显示，丝氨酸-384到丙氨酸的替换影响了活性位点中精氨酸残基对底物的识别，从而损害了caspase的催化活性。

位点定向诱变和生化实验证明，丝氨酸-384到丙氨酸的突变阻断了Caspase-2的酶活性，抑制了癌细胞的凋亡。该方法可用于评估氨基酸突变及翻译后修饰对Caspase-2以及其他参与多种癌症疾病的Caspase家族蛋白功能的影响。