Name: 使用扩增显微镜物理放大 整个果蝇 胚胎以进行超分辨率成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 了解扩增显微镜技术，利用PDMS水凝胶物理放大果蝇胚胎样本，突破传统共聚焦显微镜的衍射极限，实现超分辨率成像。该方法无需昂贵设备即可研究蛋白质定位与细胞形态的关系。

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我们感谢Jennifer Zallen博士提供了用于实验的豚鼠抗Par-3一抗。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）下属的国立普通医学科学研究所（NIGMS）的慷慨资助（项目编号：1R15GM143729-01 和 1P20GM139768-01 5743），以及阿肯色生物科学研究所（ABI）的部分资助，后者为本实验室共聚焦显微镜的购置提供了部分经费支持。

本方案遵循阿肯色大学（UARK）关于无脊椎动物（如黑腹果蝇 Drosophila melanogaster）研究的指导原则，并已获得UARK机构生物安全委员会批准（方案编号 #20001）。
1. Drosophila 胚胎固定与去卵黄膜
注意：步骤1描述了一种手动去除包绕胚胎的透明不可渗透膜（即卵黄膜）的操作方法（手工剥离法）。重要的是，在ExM实验流程开始时通过手工剥离法可选择发育阶段合适的胚胎，从而显著提高在ExM流程结束时获得可用方向胚胎的可能性。然而，本ExM实验流程完全兼容大量胚胎收集以及基于甲醇法去除卵黄膜的标准操作步骤；若采用后者，可直接跳至步骤2（免疫荧光标记）。
<ol>
	<li>准备或购买若干细玻璃针。针尖的实际尺寸并不关键，但需确保玻璃针具有足够的刚性和锐利度，以刺穿固定胚胎的卵黄膜。可使用显微拉针仪，将玻璃毛细管（外径1 mm，内径0.75 mm）拉制成针，制备方法与制备胚胎显微注射用针一致。18；或者购买预拉制的毛细管针头。</li>
	<li>使用标准方法收集胚胎 果蝇 技术19 通过放置 &gt;100 成虫 果蝇 在带有通气孔的塑料杯中，用果汁/琼脂平板密封20使用定时收集窗口以富集合适发育阶段的胚胎16例如，为了富集原肠胚形成期（6期）和汇聚延伸期（7期）的胚胎，需更换果汁培养板，并在该阶段收集胚胎2小时 25 °C，然后取出培养板，在相同条件下继续孵育2小时 25 °C 以获取约2-4小时龄的胚胎。</li>
	<li>为了去除胚胎外层类似蛋壳的卵壳，用50%的次氯酸钠溶液覆盖果汁培养基的表面表1），用小号画笔轻轻搅动胚胎以使其从琼脂表面脱离，静置3分钟，待卵膜完全溶解。</li>
	<li>使用毛笔将去壳胚胎转移至含有4 mL庚烷（有机上相）和4 mL固定缓冲液（水相下相）的30 mL闪烁瓶中； 表1）。使用新近配制或刚开封的甲醛母液进行新鲜稀释，并在加入胚胎前立即与10×PBS和去离子水混合。 
	注意：应使用多聚甲醛粉末或玻璃安瓿中的16%电镜级甲醛配制甲醛溶液。也可使用高浓度甲醛（如37%甲醛）的储存液，但结果可能不够稳定。</li>
	<li>胚胎将聚集在有机相与水相之间的界面处。加入的胚胎数量应以能在界面处形成单层为宜。若加入的胚胎过多，则固定效果会降低。</li>
	<li>使用强力胶带将闪烁瓶侧向固定在台式摇床平台上，于220 rpm条件下振荡20分钟。为达到最佳固定效果，整个固定过程中需保持有机相与水相之间形成剧烈的乳化状态。</li>
	<li>固定期间，为每个样品准备以下选项之一。
	<ol>
		<li>取一个塑料6 cm培养皿底，加入半量3%琼脂，在琼脂表面用刀片或解剖刀划出一个约5 cm × 3 cm的矩形区域。也可使用果汁/琼脂平板进行此操作。</li>
		<li>使用小型实验室刮刀取下琼脂块。将培养皿的底部倒置，放在实验台上。将琼脂块置于倒置的培养皿底部上方（图2A).</li>
		<li>取下培养皿盖，确保其内部干燥。戴好手套后，将一片双面胶带贴在皿盖内侧（胶带面积应略大于琼脂块）； 图2B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从摇床中取出小瓶，直立放置于实验台上，静置使有机相和水相分离。固定良好的胚胎将停留在两相之间的界面处。</li>
	<li>使用带有乳胶吸头的玻璃巴斯德移液管将固定后的胚胎转移至琼脂板上。为防止胚胎黏附在移液管内壁，应尽量使胚胎保持在移液管的狭窄颈部，并分多次小批量转移，避免一次性全部转移。待所有胚胎均转移至琼脂板后，用P200移液器尽可能快速地吸除胚胎周围残留的庚烷。此步骤应尽快完成（&lt;3 分钟）以避免固定后的胚胎干燥，否则可能对形态产生不利影响。</li>
	<li>从约 2 cm 的高度将带有双面胶的盖子轻轻落下，使其贴附在琼脂板上，从而将胚胎粘附于胶带上（图 2C）。轻轻取下琼脂平板的盖子，倒置放在实验台上，然后加入足量的PBS-Tween（表1) 以覆盖盖子中的胚胎。</li>
	<li>使用体视解剖显微镜，在约100倍放大倍数下采用间接照明，根据形态学标志物鉴定发育阶段合适的胚胎。对于6期胚胎，采用明显的头褶和内陷的中胚层作为标志物；对于7期胚胎，采用伸长的胚带作为标志物；对于11期胚胎，采用完全伸长的胚带以及沿头尾轴可见的体节分节作为标志物。16.
	<ol>
		<li>为收集所需胚胎，先用细玻璃针刺破胚胎前端或后端附近的卵黄膜（包裹胚胎的一层透明椭圆形膜）；随着压力释放，膜会略微塌陷。然后用精细镊子或金属探针轻轻从另一端将胚胎推过小孔，卵黄膜将留在双面胶带上。不需要的胚胎则保留在胶带上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定期使用玻璃巴斯德吸管收集漂浮的去卵黄胚胎，并转移至1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>此时，请执行以下步骤之一。
	<ol>
		<li>继续直接进行免疫荧光标记步骤。去卵黄膜的胚胎可直接进入封闭液（步骤 2.2）。请勿让胚胎在 PBS-Tween 或封闭液中停留过久。表1在进入下一步之前，需孵育超过 16 小时。</li>
		<li>将胚胎转移至甲醇中保存。尽可能去除 PBS-Tween，然后加入 1 mL 甲醇。待胚胎沉降后，尽可能吸除甲醇，并加入 1 mL 新鲜甲醇。将胚胎于 −20 °C 无限期保存。甲醇保存还允许将多次收集的胚胎合并储存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 免疫荧光标记
注意：除了抗体孵育步骤外，本节中的液体具体用量和时间并不关键。进行漂洗或洗涤时，先让胚胎沉降到管底，尽可能吸除上清液但避免吸走胚胎，然后加入约 1 mL 新液体；建议使用带有乳胶球的玻璃巴斯德吸管，以获得最佳的清晰度和操作控制。在漂洗步骤中，无需摇动胚胎，仅让其自然沉降；在洗涤步骤中，需将胚胎在旋转摇床（nutator）上按指定时间摇动，之后再让其沉降。
<ol>
	<li>如果胚胎未保存在甲醇中，则进行步骤 2.2。如果胚胎已保存在甲醇中，则用 PBS-Tween 漂洗两次，再用 PBS-Tween 每次洗涤 20 分钟，共洗涤两次。</li>
	<li>将胚胎在 1 mL 封闭液中洗涤 30–60 分钟。</li>
	<li>将胚胎与用抗体溶液稀释的一抗（表 1）在室温下孵育 2 小时，或更优选择是在 4 °C 下过夜孵育。此步骤应使用尽可能小的体积（50–300 µL）以节约一抗用量；在摇床上进行振荡并非严格必需。
	<ol>
		<li>对于扩展显微技术（ExM），应将典型免疫荧光实验中使用的一抗用量至少增加 50%。使用以下一抗浓度：抗 Par-3 豚鼠多克隆抗体 1:20021，抗 GFP 兔多克隆抗体 1:100。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除一抗溶液（如需可保存于 4 °C），用 PBS-Tween 漂洗两次，再用 PBS-Tween 每次洗涤 15 分钟，共洗涤四次。</li>
	<li>将胚胎与荧光标记的二抗在最终体积为 300 µL 的抗体溶液中，在摇床上室温孵育 1 小时。此步骤中可同时加入荧光标记的链霉亲和素。从本步骤开始，应尽可能避免胚胎暴露于强光或长时间光照下，例如用不透明的盒子盖住离心管或将样品置于抽屉中。
	<ol>
		<li>使用以下浓度：与 Alexa Fluor 488 偶联的抗兔 IgG 山羊多克隆抗体 1:500；与 Alexa Fluor 568 偶联的抗豚鼠 IgG 山羊多克隆抗体 1:500；链霉亲和素-Alexa Fluor 488 1:1000。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除并妥善处理二抗溶液。将胚胎用 PBS-Tween 漂洗两次，再用 PBS-Tween 每次洗涤 15 分钟，共洗涤四次。</li>
	<li>此时，胚胎可在避光条件下于 4 °C 保存，但应尽快处理样品（<24 小时）。</li>
</ol>
3. 准备PDMS小室
注意：PDMS 小室可提前 2 周制备。
<ol>
	<li>将培养箱或加热板温度设置为 55 °C，并将可旋转锥形管的离心机温度设置为 15 °C。</li>
	<li>为配制 PDMS 溶液（表 1），将一个 50 mL 锥形管放入置于天平上的次级容器中，用注射器向管内加入 10 g 硅弹性体基础液，然后加入 1 g 硅弹性体固化剂，反复倒置管子数次以混合均匀。</li>
	<li>取另一支 50 mL 锥形管，加入适量水配制平衡管。在 15 °C 条件下，以 500 x g 离心 PDMS 溶液 3 分钟，随后将其倒入直径 10 cm 的培养皿中，厚度约为 1 mm。如有需要，可用气管轻轻吹拂溶液表面以去除气泡。将 PDMS 溶液在 55 °C 下静置过夜，使其完全固化。</li>
	<li>PDMS 片完全固化后，使用解剖刀在表面划出略小于 22 mm x 22 mm 盖玻片的方形区域。在每个方形区域内，再划出并移除一个宽度约为 8 mm 的方形凹槽。</li>
	<li>将每个方形 PDMS 凹槽转移至 22 mm x 22 mm 盖玻片上，并牢固粘附（图 2D）。制备六片或更多的盖玻片，通常可获得足够数量的扩展胚胎用于成像。</li>
</ol>
4. 将胚胎黏附到盖玻片上
<ol>
	<li>在每个孔内的盖玻片表面加入足量的0.1%多聚-L-赖氨酸以覆盖其表面（约50 µL），并将它们放入一个 55 °C 将孵育器置于空气中晾干。重复此步骤以增强粘附性。</li>
	<li>用1×PBS短暂漂洗胚胎一次，以去除Tween去污剂，然后转移 &gt;将10个胚胎分别放入每个经多聚-L-赖氨酸包被的孔中。</li>
	<li>让胚胎沉降至孔底。用巴斯德吸管移除附着胚胎的多余液体。立即进行下一步操作。</li>
</ol>
5. 活化与凝胶化
注意：激活是指向胚胎中加入MA-NHS，这将修饰样品中的蛋白质和抗体，使其能够与水凝胶结合。凝胶化是指在每个孔中的胚胎内部及周围形成水凝胶的过程。在凝胶化过程中，胚胎首先被单体溶液渗透，然后用凝胶化溶液处理以形成水凝胶。
<ol>
	<li>在室温下用激活溶液（将1 mM MA-NHS新鲜稀释于1×PBS中；表1）孵育胚胎，激活1小时。每约10分钟更换一次该溶液。</li>
	<li>用1×PBS清洗胚胎三次。将胚胎在单体溶液（表1）中于4 °C孵育45分钟。</li>
	<li>在胚胎处于单体溶液期间，配制凝胶化溶液（表1）。制备约2 mL凝胶化溶液足以覆盖一个10 cm培养皿中的所有PDMS孔。注意最后加入APS，因其会引发聚合并启动凝胶化过程。
	<ol>
		<li>将催化氧化剂从粉末新鲜配制（例如，1% TEMPO w/v 水溶液）。取1,960 µL单体溶液，加入30 µL 10% TEMED和10 µL 1% TEMPO，混匀。</li>
		<li>为避免整批凝胶化溶液一次性聚合，应分小批量操作。将不含APS的凝胶化溶液分装至8联PCR管中，每管125 µL。</li>
		<li>用真空泵小心吸除三个PDMS孔中的单体溶液，注意不要扰动胚胎。向其中一管PCR管中的凝胶化溶液加入5 µL APS以启动聚合反应。迅速将正在聚合的凝胶化溶液分配至各孔中（每孔约40 µL）。重复此步骤，直至所有孔和胚胎均被覆盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品在37 °C下静置凝胶化1.5–2.5小时。期间可不时轻轻振荡水凝胶以监测聚合进程。完全固化的水凝胶不会晃动。较厚的水凝胶需要更长时间完成聚合和固化。</li>
</ol>
6. 消化与扩增
注意：较厚且较大的凝胶需要更长的膨胀时间，凝胶中心可能需要数小时才能完全膨胀；通过修剪凝胶边缘可加快膨胀速度。随着凝胶膨胀，其折射率将变得与水几乎相同，凝胶会变得极难观察。
<ol>
	<li>凝胶完成后，将PDMS孔从盖玻片上剥离，注意尽量不要扰动水凝胶。如有需要，可切除多余的水凝胶材料。</li>
	<li>将水凝胶（仍附着在盖玻片上）分别转移至六孔板的各个孔中（图2E）。请注意，水凝胶在消化过程中可能会轻微膨胀。</li>
	<li>用消化缓冲液（Table 1）完全覆盖凝胶，在37 °C下孵育1小时。通常情况下，每孔加入30 mL消化缓冲液即可充分覆盖六孔板中的凝胶。</li>
	<li>消化完成后，通过将水凝胶从盖玻片上滑落的方式，将其逐一转移至6 cm培养皿中。必要时可使用另一张盖玻片帮助松动凝胶。向每个培养皿中加入去离子水以使凝胶充分膨胀。在1–2小时内换水3至4次，直至凝胶完全膨胀（预计宽度增加约四倍）。</li>
</ol>
7. 封片与成像
注意：膨胀后的水凝胶几乎完全由水组成，因此几乎透明且极为脆弱。可使用长盖玻片移动和拾取凝胶。每次仅安装和成像一到两个凝胶，因为凝胶会逐渐释放水分，导致在盖玻片上滑动。
<ol>
	<li>使用巴斯德移液管尽可能吸除培养皿中多余的水分，以减少操作时凝胶的移动。</li>
	<li>将每个展开的凝胶连同底部表面的胚胎一起移动到大盖玻片（例如 24 mm × 40 mm）上，用于成像。</li>
	<li>将每个带有凝胶的盖玻片置于倒置激光扫描共聚焦显微镜的物镜上方。使用显微镜的落射荧光或明场模式，配合低倍（5x 或 10x）或中倍（20x）空气物镜，定位处于合适发育阶段且方向正确的样本。</li>
	<li>为实现高分辨率成像，切换至高倍率（60x、63x 或 100x）油镜或水镜物镜。胚胎表面必须位于物镜的焦距范围内。&lt;300 µm 从盖玻片上取下，以便使用63倍物镜进行成像。</li>
	<li>使用显微镜的激光扫描共聚焦模式采集样品数据。确保采集的图像未饱和且具有良好的动态范围，并为每幅图像使用适当的像素数量，以获取关于样品的尽可能多的信息23.</li>
</ol>
<img alt="薄膜器件的制备方法；包含逐步组装过程及所用材料的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：手动去卵黄及水凝胶操作。 (A) 从琼脂/果汁平板上切下琼脂块。(B) 将双面胶带贴在直径6 cm的培养皿盖内侧。(C) 将胚胎粘附在贴有胶带的皿盖上。(D) 将带有方形孔腔的聚二甲基硅氧烷（PDMS）块粘附至22 mm × 22 mm的盖玻片上。(E) 将带有PDMS孔腔的盖玻片置于6孔板中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

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作者声明无利益冲突。

手动去卵黄 
大多数 果蝇 胚胎固定方案包括将固定后的胚胎在甲醇与庚烷的乳液中振荡，以去除卵黄膜，该过程可使卵黄膜破裂脱落 通过 渗透破裂26尽管基于甲醇的去卵黄膜处理（甲醇爆裂法）对许多应用而言有效且适用，但手工去卵黄膜（手剥法）具有一些显著优势。首先，手剥法可精确选择特定发育阶段的胚胎进行去卵黄膜处理和收集，从而显著提高实验结束时获得处于可用方向的伸展胚胎的概率。&#160;这种富集在研究快速发育过程的特定方面（例如中胚层内陷或汇聚延伸）时至关重要，因为在严格限定的时间收集窗口内，处于合适发育阶段的胚胎可能仅占所有胚胎的百分之几。当然，对于许多应用而言，采用传统的大批量甲醇“爆裂法”处理定时收集的胚胎已足够，此时手工剥离可能不值得付出额外 effort。其次，某些一抗和染料的结合会因样本先前接触甲醇而受到不利影响。因此，与经甲醇处理的样本相比，手工剥离可显著提高免疫荧光信号的质量，使其成为一种有用的通用技术 果蝇 发育生物学研究人员
在扩展的整体 Drosophila 胚胎中进行高分辨率共聚焦显微镜成像 
尽管在扩展样品上进行高分辨率共聚焦显微镜成像在概念上与未扩展样品相同，但扩展显微镜技术（ExM）确实引入了一些技术难题。值得注意的是，随着样品尺寸增大，胚胎的取向问题变得更加重要，因为高倍率、高数值孔径（NA）的物镜只能聚焦来自非常靠近盖玻片的样品区域的光线27。因此，通常只能对在凝胶形成时恰好紧邻盖玻片、位于胚胎表面或接近表面的细胞进行清晰聚焦。为确保最终获得正确取向的样本，最佳方法是在ExM实验开始时使用精确分期收集的固定胚胎（例如通过手工剥离法），并在每个孔中接种大量胚胎（&#62;10个）。若要观察胚胎内部深处的细胞，可能需要使用更专业的成像装置，例如光片显微镜28。此外，我们发现通过将共聚焦针孔开大至超过一个艾里单位（airy unit）的尺寸，可以提高图像质量。当然，增大针孔尺寸会降低最大分辨率，但在实际操作中，即使轻微增加针孔大小，也能显著增强信号强度（数据未显示）。未来的研究应系统地探讨ExM样品中针孔尺寸与有效分辨率之间的关系。
基础 ExM 的多种改进方法 
本文所述的方案是 ExM 的一种相对简单的示例，适用于多种应用场景，并且大多数发育生物学实验室均可轻松实施。然而，基于 ExM 基本原理已发展出多种变体4,5,7，可用于增强信号强度、实现更大的扩张倍数，并同时检测核酸分子和蛋白质。在本方案中，胚胎在凝胶化和扩张前即与抗体孵育。另一种方法是，在样品扩张后再进行抗体处理6,30，由于表位可及性提高，且在扩张过程中结合的抗体损失减少，该方法可增强信号强度。此外，可使用特定的交联分子将 RNA 分子连接至水凝胶，从而利用杂交链式反应（hybridization chain reaction）方法在扩张后的凝胶中检测 RNA30。最后，样品还可经历多轮扩张，如迭代扩张显微技术（iterative expansion microscopy, iExM）31、全扩张显微技术（pan-ExM）32 和扩张显像技术（expansion revealing, ExR）31，以实现更高程度的分辨率提升。

在细胞与发育生物学中，眼见为实，准确确定蛋白质定位模式的能力是许多实验类型的基础。激光扫描共聚焦显微镜是用于对完整样品中荧光标记蛋白质进行三维成像的标准工具。传统的共聚焦显微镜无法区分彼此间距小于其发射光波长一半的相邻荧光信号1。换句话说，两个点状信号源在横向方向上必须至少相距200-300 nm（轴向方向为500-700 nm），才能被分辨为两个独立的信号。这一技术限制被称为衍射极限，是研究具有小于衍射极限空间特征的复杂亚细胞结构（例如肌动球蛋白细胞骨架或线粒体网络）时面临的基本障碍。因此，提高传统共聚焦显微镜分辨能力的技术在生物学领域具有广泛的关注价值。
为了克服衍射极限，已开发出多种不同的超分辨率显微技术，可实现数十纳米甚至更高的分辨率1,2,3，揭示了一个此前仅可望而不可即的生物学复杂世界 通过 电子显微镜。尽管这些基于硬件的方法具有明显优势，但超分辨率显微镜通常对样品标记有特定要求，且采集时间较长，限制了其灵活性，或者对某些实验室而言成本过高而难以获取。一种替代显微镜的超分辨率技术是扩张显微镜技术（expansion microscopy, ExM），它并非一种显微镜技术 本身 但是一种在保持其组成分子相对空间排布的前提下使样品膨胀的方法4各向同性扩增后的样品可使用传统的荧光共聚焦显微镜进行观察，从而实现有效分辨率的提升。扩增显微技术（ExM）最初由 Boyden 团队于 2015 年首次报道。5，且该基本技术此后已被改进并应用于多种实验中6,7,8扩展显微镜技术也已适用于整体胚胎样本，尤其是在 果蝇9,10,11, 秀丽隐杆线虫12和斑马鱼13，使其成为发育生物学家的强大工具。
ExM 基于两种不同的水凝胶化学体系：1）可膨胀的聚电解质水凝胶，其在水中浸泡后体积显著增大14；2）聚丙烯酰胺水凝胶，其具有极小的聚合物间距，可实现样本的各向同性膨胀15。尽管已有多种已发表的 ExM 方案，但它们通常包含以下步骤：样本固定、标记、活化、凝胶化、消化和膨胀4。固定条件和荧光标记策略自然会根据实验需求和系统类型而有所不同，某些方案中，标记步骤在膨胀后进行。样本中的目标分子必须预先（活化）以使其能够与水凝胶结合，这可通过不同的化学方法实现4。在凝胶化步骤期间，样本被饱和浸透未来的水凝胶单体（丙烯酸钠、丙烯酰胺以及交联剂双丙烯酰胺），随后通过引发剂（如过硫酸铵，APS）和加速剂（如四甲基乙二胺，TEMED）催化的自由基聚合反应形成水凝胶4。凝胶化完成后，样本经酶消化处理，以均一化样本对溶胀的阻力，并确保水凝胶的各向同性膨胀4。最后，将消化后的水凝胶置于水中，使其膨胀至原始线性尺寸的约四倍4。
<img alt="胚胎处理流程图；固定、标记、盖玻片粘附、成像；免疫荧光。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：Drosophila胚胎中扩展显微技术的总体流程。ExM是一种多步骤实验流程，至少需要4天完成。胚胎收集、固定和去卵黄膜过程需1天或更长时间，具体取决于是否合并多次收集的胚胎。免疫荧光标记需1至2天，具体取决于是否将胚胎与一抗在4℃孵育过夜。胚胎活化、凝胶化、消化和膨胀过程可在一天内完成。凝胶在膨胀后可立即封片并成像，但出于实际操作考虑，通常选择在次日开始成像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
本方案描述了如何对完整-mount的早期至中期胚胎进行扩展显微技术（ExM）操作 果蝇 胚胎16 以超高分辨率观察亚细胞蛋白质定位模式图1）。该方法利用甲基丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（MA-NHS）化学法将蛋白质分子活化并锚定于水凝胶上17，它是先前发表的ExM方案的一种改进，适用于晚期阶段 果蝇 胚胎和组织11本方案使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）小室来塑形水凝胶，并在激活和凝胶化过程中便于溶液更换。另一种无需制备PDMS小室的方法是将附着在盖玻片上的胚胎放入置于实验室封膜片上的单体溶液液滴中。22此外，本方案还描述了一种手动去除包围胚胎的不可渗透卵黄膜的方法 果蝇 胚胎，这是进行免疫荧光染色的前提条件。重要的是，这种手工剥离胚胎的方法可用于仅选择发育阶段正确的胚胎 果蝇 在样本标记前对胚胎进行筛选，可显著提高获得正确发育阶段和方向的扩展样本的概率，从而大幅提升后续数据采集的效率。

<table><tbody><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Milipore Sigma</td><td>1490-100ML</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>VWR</td><td>BDH9214-500G</td><td></td></tr><tr><td>抗-GFP 兔多克隆抗体</td><td>Torrey Pines BioLabs</td><td>TP-401</td><td></td></tr><tr><td>抗豚鼠 IgG 山羊多克隆抗体，Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11075</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 IgG 山羊多克隆抗体，Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>双丙烯酰胺</td><td>Research Products International</td><td>A11275</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（30% 溶液）</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7284</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>fisherscientific&amp;nbsp;</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，方形，22 mm</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，矩形，40 mm × 24 mm</td><td>VWR</td><td>48393-230</td><td></td></tr><tr><td>用于拉制针头的玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>玻璃显微注射针（预拉制）</td><td>World Precision Instruments</td><td>TIP10LT</td><td></td></tr><tr><td>盐酸胍</td><td>VWR</td><td>101970-606</td><td></td></tr><tr><td>正庚烷</td><td>VWR</td><td>EM-HX0078-1</td><td></td></tr><tr><td>乳胶移液球</td><td>VWR</td><td>82024-554</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>N-羟基琥珀酰亚胺甲基丙烯酸酯</td><td>VWR</td><td>730300-1G</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，1.5 mL</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>多孔板，6 孔</td><td>Genesee</td><td>25-100</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（16%，电镜级，无甲醇）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>509804487 (Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管（2 mL，短头）</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 试剂盒（Sylgard 184 试剂盒，基础剂与固化剂）</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Genesee</td><td>32-107</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（10x 溶液）</td><td>VWR</td><td>97063-660</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液（0.1% 溶液）</td><td>VWR</td><td>P8920-1ooML</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E00491</td><td></td></tr><tr><td>闪烁瓶（30 mL）</td><td>VWR</td><td>66022-128</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酸钠</td><td>VWR</td><td>101181-226</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠（粉末）</td><td>Millipore Sigma</td><td>71289</td><td>配制 1% w/v 工作液；该浓度下为急性剧毒！</td></tr><tr><td>链霉亲和素，Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S32354</td><td></td></tr><tr><td>TAE（50x）</td><td>VWR</td><td>97063-692</td><td></td></tr><tr><td>胶带（双面，1 英寸宽）</td><td>Scotch&amp;nbsp; 3M</td><td>665 Scotch double sided 1inch/1296 inches Boxed</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI17919</td><td></td></tr><tr><td>TEMPO</td><td>VWR</td><td>EM8.14681.0005</td><td>催化性氧化剂</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>VWR</td><td>97063-872</td><td>纯品极为黏稠；用蒸馏水配制 10% 工作液</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 900</td><td>Zeiss</td><td></td><td>激光扫描显微镜，未使用 AiryScan 功能</td></tr></tbody></table>

使用扩展显微镜技术对整体安装的 drosophila 胚胎进行物理放大以实现超分辨率成像

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

发育生物学研究的核心工具是共聚焦显微镜，它使研究人员能够确定复杂生物样本中标记分子的三维定位。传统的共聚焦显微镜可分辨相距数百纳米的两个相邻荧光点源，但要观察亚细胞结构的更精细细节，则需要分辨能力达到数十纳米级别的信号。为突破这一分辨率限制，研究人员已开发出多种基于硬件的超分辨率显微技术，但这些方法依赖于特殊的显微镜设备，并非所有实验室都能获得。另一种提高分辨能力的方法是通过一种称为膨胀显微技术（expansion microscopy, ExM）的过程，各向同性地放大样本本身。该技术由 Boyden 团队于 2015 年首次提出。ExM 并非一种显微技术 本身 但是一种在保持样品中各分子相对空间排布的前提下使其膨胀的方法。通过传统共聚焦显微镜观察膨胀后的样品，可实现有效分辨率的提升。本文中，我们描述了一种用于整体样品的ExM实施方案 果蝇 胚胎样本，用于检测 Par-3、肌球蛋白 II 和线粒体在表层上皮细胞内的定位。该方案可使样本量增加约四倍，从而能够观察到常规共聚焦显微镜下无法看到的亚细胞结构细节。作为原理验证，使用抗 GFP 抗体区分相邻细胞皮层中不同区域的肌球蛋白-GFP，同时使用荧光标记的链霉亲和素检测内源性生物素化分子，以揭示线粒体网络结构的精细特征。该方案采用常见的荧光标记抗体和试剂，可与多种现有的免疫荧光染色方案兼容。

为表征ExM在整体样本中的普遍功效 果蝇 胚胎，沿头尾轴测量未扩张对照组胚胎与扩张后胚胎的胚胎长度（图3A-C）。未扩张的对照胚胎与扩张后的胚胎经过相同的固定处理和免疫荧光标记步骤，但在成像前使用固化的封片介质进行封片。当使用10倍物镜时，单个未扩张胚胎约占据视野的一半范围图3A相比之下，使用相同的10倍物镜时，扩张后的胚胎大约占据了两个完整的视野范围。图3B）。为了评估不同实验之间及同一实验内部扩张程度的差异，采用相同的膨胀显微镜（ExM）方案在三个独立时间点重复实验，并在每次实验中分别测量三个不同凝胶内胚胎的长度。未扩张对照组胚胎的头尾平均长度为 398.8 µm （标准差 [SD] = 22.93 µm；n = 74； 图3C）。在实验1、实验2和实验3中，胚胎的平均长度为 1,596 µm （SD = 159.9 µm；n = 57）， 1,868 µm （SD = 150.5 µm；n = 51），以及 1,954 µm （SD = 120.3 µm；n = 44），分别代表扩增倍数为4.0倍、4.7倍和4.9倍（图3C）。凝胶间的组内实验差异远小于组间实验差异，后者约为20%（图3C）。为了评估ExM对细胞和胚胎形态的影响，使用了一种针对黏附连接组分Par-3（Bazooka）的抗体21 用于标记顶端细胞膜，并对11期发育中的口部节段进行成像 果蝇 胚胎——具有复杂分节结构的阶段（图3D-F）。在对照样本中，上颌节段的细胞平均宽度为 4.76 µm （SD = 1.053 µm，n = 25； 图3D,F）。在使用相同40倍物镜和放大倍数（1倍）成像的扩展样本中，上颌节段的细胞平均宽度为 19.10 µm （SD = 3.966 µm，n = 18； 图3E,F），代表扩增了4.0倍。因此，与以往的报道一致11，我们能够扩增完整组织样本 果蝇 胚胎在细胞和组织形态无撕裂或明显畸变的情况下，通过扩展显微技术（ExM）实现线性尺寸约四倍的扩增。
<img alt="胚胎发育：显微镜观察、测量；示意图、显微图像（10倍，40倍）及分析图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：Drosophila 胚胎的四倍膨胀。（A）未膨胀和（B）膨胀后的Drosophila胚胎，使用10倍物镜（0.3 NA）在1倍缩放下成像。虚线标示了各个视野（FOV）。胚胎表达GFP标记的肌球蛋白轻链，并用抗GFP抗体进行染色。（C）每项实验中三种水凝胶处理的胚胎长度（沿头尾轴方向）的定量分析，数据来自三次独立的ExM实验，并与未膨胀对照组比较。（D，E）使用40倍物镜（1.3 NA）在1倍缩放下成像的（D）未膨胀和（E）膨胀后11期Drosophila胚胎的上颌节段图像。细胞轮廓（黏着连接）通过抗Par-3/Bazooka抗体（白色）检测。（F）来自（D）和（E）中对应细胞群的细胞宽度（长轴）的定量分析。（C）和（F）中的箱线图显示第25、50和75百分位数范围；须线表示最小值和最大值；“+”符号表示均值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了证明扩展显微技术（ExM）可用于解析低于典型衍射极限的亚细胞结构细节，对未扩展的对照组与发生汇聚延伸（阶段7）的扩展胚胎中的肌动球蛋白细胞骨架进行了成像。原肠胚形成及汇聚延伸过程中的组织重塑事件主要由运动蛋白肌球蛋白II定位的变化所调控。24然而，在早期紧密排列的柱状上皮中 果蝇 外胚层中，即使在158倍放大倍数下（63倍物镜配合2.5倍光学变焦）成像——这已接近激光扫描共聚焦显微镜通常的最大分辨能力——也难以观察到肌球蛋白II定位模式的许多精细细节。例如，由于肌球蛋白II是一种皮层蛋白（位于质膜正下方），其聚集区域的肌球蛋白II25 位于细胞-细胞接触两侧的结构在7期胚胎中无法分辨，且在相邻细胞相接处呈现为一条单一的线状结构（图4A）。相比之下，在扩展的7期胚胎中，可在细胞间连接处观察到成束平行排列的肌球蛋白II，代表相邻细胞中的皮层蛋白聚集。图4B）。扩增样品中平行的肌球蛋白II条带之间的距离为892.7 nm（标准差 = 0.171 nm，n = 12）；将其除以4后，预测未扩增胚胎中相邻细胞间肌球蛋白条带的距离约为220 nm，该值确实略低于使用Alexa 488检测信号时的衍射极限（最大发射波长约520 nm/2 = 260 nm）。
此外，我们还测试了扩展显微技术（ExM）是否可用于解析原肠胚形成期 Drosophila 胚胎（第6阶段）中紧密排列细胞内的线粒体网络结构。线粒体功能与其网络结构（即融合态与碎片化细胞器）密切相关，但在非扁平或非薄层的细胞类型中，使用传统共聚焦显微镜难以清晰观察线粒体网络结构的细节。线粒体天然富含生物素化分子，因此可在早期 Drosophila 胚胎中利用荧光标记的链霉亲和素对线粒体进行标记26。在用链霉亲和素-Alexa 488 标记的未扩展第6阶段胚胎中，信号呈现为细胞质内的点状结构，常相互重叠且难以分辨（图4C）。相比之下，在扩展后的第6阶段胚胎中，可观察到更多线粒体网络的精细结构，点状信号也更易于分辨（图4D）26, 27。这些结果表明，ExM 可用于研究传统上不适合进行线粒体分析的细胞类型中的线粒体网络组织结构。
<img alt="细胞中肌球蛋白II和Par-3的定位；158倍放大倍数下的荧光显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：扩展显微镜揭示的肌动球蛋白细胞骨架和线粒体的细节。（A、B）使用63倍物镜（1.4 NA）在2.5倍放大下对第7期神经外胚层（成带区）细胞中肌球蛋白II的定位成像：（A）未扩展胚胎和（B）扩展胚胎。胚胎中表达了一种转基因的GFP标记的肌球蛋白II调节轻链（sqh-GFP），通过抗GFP抗体（红色）检测。在扩展后的胚胎中，相邻细胞中皮层肌球蛋白的不同区域得以分辨（白色箭头）。（C、D）使用63×物镜（1.4 NA）在2.5倍放大下对第6期未扩展（C）和扩展（D）胚胎神经外胚层细胞中的线粒体网络成像。线粒体用链霉亲和素-Alexa 488（绿色）检测，细胞轮廓用抗Par-3/Bazooka抗体（洋红色）检测。实验采用激光扫描共聚焦显微镜进行。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：溶液配方。本方案中所用溶液按出现顺序列出的组成。除非另有说明，所有储备液均为液体。除非另有说明，化学品均用经高压灭菌的滤过水重悬或稀释。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/JOVE_Parveen%202023_Revision_Recipes.zip" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本文介绍了一种在早期Drosophila胚胎中实施膨胀显微技术的实验方案，旨在利用常规激光扫描共聚焦显微镜实现超分辨率成像。

使用扩展显微镜技术对整体安装的 Drosophila 胚胎进行物理放大以实现超分辨率成像

发育生物学研究的核心工具是共聚焦显微镜，它使研究人员能够确定标记蛋白的三维定位……

该方案可在大多数食管发育生物学实验室中实施，使无法使用超分辨率显微镜的研究人员也能获得超分辨率图像。该技术的主要优势在于，通过直接扩增样本本身，使研究人员无需超分辨率显微镜即可突破传统共聚焦显微镜的衍射极限。本方案对于研究蛋白质定位如何影响完整胚胎中细胞形态或功能的研究者尤为有益，特别是当这些蛋白质形成复杂的亚细胞结构或网络时。人们在操作过程中最常见的问题是胚胎在整个实验流程中脱落。建议多次涂布多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine），以牢固地黏附胚胎。放置胚胎后，取一个直径6厘米的塑料培养皿底部，其中一半填充3%琼脂。用剃刀或解剖刀在琼脂上划出一个5厘米×3厘米的矩形。用小型实验室刮刀取下琼脂块。然后将培养皿的底部倒置，放在实验台上，并将琼脂块放置在倒置的培养皿底部上方。打开培养皿盖子，确保其内部干燥。戴上手套后，将一片双面胶贴在皿盖内侧。从摇床中取出装有包被和固定胚胎的离心管，垂直放置在实验台上。静置，使有机相和水相分层。固定良好的胚胎应停留在两相交界处。使用巴斯德吸管和P200移液器彻底移除下层水相。使用带有乳胶吸头的玻璃巴斯德移液管，将固定的胚胎分多次小批量转移至琼脂板上，以防止胚胎粘附在移液管内壁。胚胎转移至琼脂板后，使用P200移液器去除胚胎周围残留的庚烷。随后，从两厘米高度将双面胶盖轻轻落下，使其接触琼脂板，从而使胚胎粘附于胶带上。轻轻取下琼脂板的盖子，将其倒置放在实验台上，并加入足量的含吐温磷酸盐缓冲液（PBS Tween），以浸没盖子中的胚胎。使用体视显微镜在100倍放大倍数下配合间接照明，收集所需胚胎。用细玻璃针在胚胎前端或后端附近的卵黄膜上刺破一个小孔，以使膜塌陷并释放压力。使用精细镊子或金属探针，轻轻将胚胎从孔中推出，使卵黄膜仍附着在双面胶带上。将不需要的胚胎留在胶带上。定期使用玻璃巴斯德移液管收集任何漂浮的去卵黄膜胚胎，并将其转移至1.5毫升微量离心管中。在50毫升锥形管中配制PDMS溶液，并在另一支50毫升锥形管中加入适量水以配平。在15摄氏度下，以500×g离心PDMS溶液3分钟。随后将其倒入直径10厘米的培养皿中，厚度为1毫米。将PDMS溶液在55摄氏度下静置过夜使其固化。PDMS平板固化后，使用手术刀划出略小于22毫米×22毫米盖玻片的方形区域。在每个方形区域内，再划出并移除一个宽8毫米的方形孔洞。将每个方形PDMS小室转移至22 mm × 22 mm的盖玻片上，并牢固粘附。为将胚胎粘附到盖玻片上，向每个小室内的盖玻片表面加入足量0.1%聚-L-赖氨酸（Poly-L-Lysine），使其完全覆盖表面，随后置于55°C培养箱中干燥。用PBS短暂漂洗胚胎，以去除Tween去污剂。然后将10个以上的胚胎转移至每个经多聚-L-赖氨酸包被的孔中。让胚胎沉降至孔底。用巴斯德移液管吸除黏附胚胎周围的多余液体，并立即进行下一步操作。在胚胎置于单体溶液中的同时，准备凝胶溶液以覆盖PDMS孔。将催化氧化剂从粉末中新鲜稀释。将3,920微升单体溶液与60微升10%TEMED和20微升1%TEMPO混合。将凝胶溶液分装至多个PCR管中，每管125微升。使用真空泵或移液器小心地从PDMS孔中移除单体溶液，注意不要破坏胚胎。向其中一管含有凝胶溶液的PCR管中加入5微升APS，以启动聚合反应。迅速将正在聚合的凝胶溶液分配到三个孔中。重复此操作，直至所有孔和胚胎均被覆盖。将样品在37摄氏度下静置凝胶化1.5至2.5小时。较厚的水凝胶需要更长时间才能完成聚合并固化。应经常振荡水凝胶以监测聚合过程。一旦固化，水凝胶将不再晃动。凝胶化后，将PDMS小室从盖玻片上小心剥离，避免扰动水凝胶。将水凝胶逐个转移至六孔板的孔中。水凝胶在消化过程中可能会轻微膨胀。用消化缓冲液完全覆盖凝胶。在六孔板中，30 毫升消化缓冲液足以覆盖凝胶，并在 37 摄氏度下孵育一小时。消化后，将水凝胶转移至一个六厘米的培养皿中，并加入去离子水使其膨胀。此时，水凝胶可能会从盖玻片上脱落，并在线性尺寸上膨胀至原来的四倍。使用巴斯德吸管尽可能移除培养皿中多余的水分，以尽量减少操作时凝胶的移动。将带有胚胎且位于底面的膨胀凝胶转移至一张较大的盖玻片上，以便成像。将每张盖玻片用凝胶封固后，置于倒置激光扫描共聚焦显微镜的物镜上方。先定位到处于合适发育阶段且方向正确的样本，随后切换至高倍油镜或水浸物镜，以高分辨率进行成像。在10倍物镜下沿胚胎头尾轴测量其长度，结果显示未扩张的胚胎约占据半个视野，而扩张后的胚胎则大约横跨两个完整的视野。未扩张对照组胚胎的头尾平均长度为398.8微米。实验一、实验二和实验三中，胚胎的平均长度分别为对照组的4.0倍、4.7倍和4.9倍。在对照样本中，上颌节段细胞的平均宽度为4.76微米。在扩增的样本中，上颌节段细胞的平均宽度为19.10微米，代表了4.0倍的扩增。在未扩增的对照组与发生汇聚延伸的扩增胚胎中均对肌动蛋白-肌球蛋白细胞骨架进行了成像。它们在相邻细胞相接处呈现为一条单线。相比之下，在扩张的7期胚胎中，可在细胞间连接处观察到成平行排列的肌球蛋白II，代表相邻细胞中的皮层蛋白聚集区域。在未扩张的6期胚胎中，经链霉亲和素标记的线粒体呈现为异质性的细胞质弥散信号，无明显的亚细胞结构细节。然而，在扩张的胚胎中，细胞质内可分辨出大量点状结构，可能代表断裂的线粒体或线粒体网络的片段。进行此操作时需要牢记的一个重要事项是，在二抗孵育后应保护胚胎免受过度光照。

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发育生物学

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