为线虫突触传递的突变体的药理特性的范式

大家好，我是来自阿拉巴马大学生物科学系考德威尔实验室的 Cody Locke。我是 Kyle Lee，我将向您展示如何为外碳水化合物和 PTZ 暴露检测准备蠕虫。我是 Bernard Tu，我将向您展示如何进行碳水化合物分析。

我是 Kaylin Berry，负责 sea Elegance 视频的制作。在本演示文稿中，我将讲述此演示文稿并演示 PTZ 暴露分析。今天，我和我的同事将展示如何在暴露于 PTZ 和具有一系列代表性突变菌株的 Alde 碳水化合物后，用癫痫的海洋优雅模型来表征突触传递突变体。

那么让我们开始吧。Kyle Lee 今天将首先展示手术第一天 ALD 碳水化合物检测的准备工作。确保每种基因型和每个重复的至少 30 条年轻成虫可用于第二天的 ALD 碳水化合物测定。

最好是实验者选择50条或更多的L四期蠕虫到新鲜的不含杀菌剂的NGM平板上，该平板以大肠杆菌OP 50作为食物来源。将蠕虫在一致且允许的温度下生长 12 至 24 小时。20 摄氏度到 22 摄氏度是最好的，尽管 25 摄氏度是可以接受的。

第二天，制备 100 毫摩尔的 Al Decarb 和 70% 乙醇储备溶液，将适量的 Al Decarb 涂抹在 NGM 板上。我们始终使用 0.5 毫摩尔的 al Decarb，方法是将 37.5 微升 100 毫摩尔的 alde carb 接种到 60 毫米非通气培养皿上，其中 7.5 mL的 gm。让 alde 碳水化合物板在室温下干燥大约 30 到 60 分钟。

板子干燥后没有必要打开盖子。在每个 alde 碳水化合物板的中心加入一致体积的大肠杆菌，再干燥 30 到 60 分钟。在室温下，我们通常添加 25 微升大肠杆菌 OP 50。

OP 50 的这个体积创造了一个足够大的食物草坪，可以将蠕虫保持在盘子中心的一小块地方，而不会过度拥挤。食物草坪干燥后，进行 alba 碳水化合物分析。由于 ALD 碳水化合物分析的主观性质，强烈建议盲目进行实验。

要做到这一点。主要实验者的同事重新标记包含要检测的蠕虫的原始板，或者该同事可以在启动计时器之前立即将蠕虫从原始板转移到 cipher alde carb 板。现在板已经被定位，硼 ABO 将继续进行分析，开始分析，计算麻痹蠕虫的数量。

定义急性 al decarb 诱发的麻痹有两种主要方法。第一种方法定义为停止咽泵血导致麻痹。在本视频说明中，位于屏幕右侧的蠕虫咽腔内的深色结构。

这种结构称为研磨机，通过胆碱能机制有节奏地收缩。本视频中蠕虫的运动因 Al Decarb 暴露而大大减慢。然而，这条蠕虫的咽部研磨机显然仍在移动。

因此，该蠕虫不会因停止泵送定义而瘫痪。在这个视频中，人们应该看到，位于屏幕右侧的咽部研磨机没有随着停止泵送而收缩，这是 al Decarb 诱发麻痹的工作定义。该蠕虫应评分为瘫痪。

然而，就像上一个视频中的蠕虫一样，这条蠕虫表现出轻微的左右觅食运动。尽管 Al Decarb 损害了它的运动，但这些运动将防止实验者认为这种蠕虫被第二种定义 al Decarb 诱导的麻痹、全身不动和对触摸无反应的方法所麻痹。定义 al decarb 诱发麻痹的第二种方法包括持续用铂丝刺激每条蠕虫并检查反应。

如果肉眼无法检测到身体运动，我们首选的方法是每 30 分钟在蠕虫的头部和尾巴上戳两次，总共三个小时。正如您应该看到的，此视频中的蠕虫并没有明显地移动其身体。尽管如此，因为这种蠕虫通过明显移动尾巴来响应刺激，所以我们不能称这种蠕虫为瘫痪。

根据 al decarb 的第二个定义，诱导瘫痪。与上一个视频中的蠕虫一样，该蠕虫没有明显移动其身体，因此需要进行刺激测试。然而，与上一个视频中的蠕虫不同，此蠕虫对刺激没有明显的反应。

因此，这条蠕虫被 al decarb 诱导的麻痹的第二个定义所麻痹。尽管 alde carb 麻痹和未瘫痪之间的区别可能很微妙，但实验者应该能够通过简单地观察大量代表性蠕虫在被挑选到 Al Decarb 板上后立即暴露于 Al Decarb 来识别实质性的变化和突触传递。野生型蠕虫仍然可以移动。

在此视频中。在 Al Decarb 暴露 1 小时后，人们会看到与上一个视频相同的野生型蠕虫。请注意，蠕虫在一定程度上减慢了速度，但仍然明显地在移动。

与野生型蠕虫不同，本视频中的 Tomasin one 突变体要么完全固定，要么在暴露一小时后几乎不动。该结果与托马辛一突变体由于无法负向调节神经肌肉接头处的神经递质释放而产生过量乙酰胆碱分泌，过量的乙酰胆碱和神经肌肉接头处的突触裂隙与乙酰胆碱降解的抑制一致，Bial Decarb 使托马辛一突变体过敏，虽然这里没有显示，但假设类似的结果来自 alde 碳水化合物测定，功能等位基因丧失为 43， 它编码钙钙 Moulin 依赖性蛋白激酶 2 的 C elegance 直系对数。该视频显示了 25 个突变体，这些突变体缺乏抑制性 GABA 能传递。

于 alde carb 一小时后，类似于 tomasin one 和 M 43 突变体，这些突变体表现出显着的 alde carb 诱导的运动 e 障碍，并且似乎比暴露于 al Decarb 相同时间长度的野生型蠕虫受到的影响更大。该结果与 M 25 突变体一致，由于 al Decarb 暴露和减少的 GABA 能传递相结合，体壁肌肉受到过度刺激，导致 CL ELs 神经肌肉接头处兴奋性与抑制性传递比更高，随后瘫痪。然而，因为 tomasin 1 在 43 和 25 个突变体上表现出对 Al Decarb 的敏感性在此时。

尽管体壁肌肉过度刺激的原因不同，但实验者如果不首先了解致病突变的身份，就无法知道超敏反应的潜在机制。在本视频中，我们在 ALD 碳水化合物测定的终点暴露 al Decarb 三个小时后返回早期视频中的相同野生型蠕虫，应该清楚地看到这些蠕虫尽管是野生型，但要么完全固定，要么几乎不动。这些蠕虫现在在表型上与暴露于 alde carb 后 1 小时显示的 TOM one 和 M 25 突变体相似，这可能是因为与野生型蠕虫相比，兴奋性胆碱能传递已达到相当的水平，Synap Bren one 突变体在暴露于 alde carb 三小时后仍保持相当大的移动性。

这一结果与突触性 Bren one 突变体一致，它们缺乏正常水平的神经递质分泌，与此时相同水平的 alde 碳水化合物暴露后的木材野生型蠕虫相比，其体壁肌肉的胆碱能刺激更少。点在四个突变体上，它们特别缺乏胆碱能传递，应该与 Synaptive Bren one 突变体对 Al Decarb 具有相似的敏感性。相反，Tomasin 1 和 O 25 过敏突变体保持瘫痪状态，与野生型蠕虫没有什么不同。

值得注意的是，一些蠕虫，尤其是那些对 Al Decarb 有抗性的蠕虫，可能会试图从板子里爬出来。在这种情况下，实验者可能会撒播一定量的棕榈酸，棕榈酸是蠕虫运动的物理屏障。在 Al Decarb 板周围，我们每毫升乙醇涂抹 25 微升 10 毫克棕榈酸。

这样就完成了 Al Decarb 暴露范式。现在，我将演示 Penta Lean Terazol 暴露范式。Kaylin Berry 将帮助我们进行 PTZ 检测。

用于 PTZ 测定的蠕虫制备与用于 alde carb 测定的蠕虫制备基本相同。两种检测方法之间唯一的显著差异如下。我们使用 DDH two O 作为 PTZ 溶剂，而不是 70% 乙醇。

此外，由于我们经常接种比 ALDE 碳水化合物大体积的 PTZ，因此在添加 OP 50 之前，我们会让接种板干燥至少一小时。棕榈酸也可以与 PTZ 一起使用。此外，重要的是要注意 PTZ 的稳定性远不如 alde carb，必须储存在零下 20 摄氏度。

首先进行分析时，每 30 分钟计算一次癫痫性轻度抽搐蠕虫的数量，总共一小时。最好将具有不同类型抽搐的蠕虫数量分为不同的类别，例如全身抽搐、前抽搐，我们称之为前抽搐与体壁肌肉麻痹的头 Bobs 组合，我们称之为强直阵挛或全身麻痹，我们称之为强直补品。右侧蠕虫所见的癫痫样活动通常发生在左侧强直剂上的蠕虫所见的强直阵挛性抽搐之后。

癫痫样活动可能只是由反复强直阵挛性抽搐后的肌肉疲劳引起的。然而，我们未发表的数据表明，一些蠕虫可以以类似于 al decarb 诱导的麻痹的方式在 PTZ 上滋补，而无需以前是强直阵挛。在这里，我们展示了在各种癫痫发作和癫痫动物模型中，在没有 PTZA GABA 受体拮抗剂和常见癫痫发作诱导剂的情况下爬行的代表性突触传递突变蠕虫。

请注意，蠕虫的尖端或鼻子在觅食时左右摆动。在本视频中，我们展示了来自上一个视频中使用的相同突触传递突变菌株的另一条蠕虫。请注意，这种蠕虫在每毫升水中含有 2.5 毫克 PTZ，在觅食时，它大部分时间会继续将头部左右移动。

然而，这种蠕虫偶尔会停止左右觅食，而是反复地将前部向前推。最后，在每毫升水含有 10 毫克 PTZ 的情况下，应该会看到一条蠕虫携带与前两个视频中的蠕虫相同的突变。请注意，这种蠕虫的侧向觅食减少了，并且与较低浓度的 PTZ 相比，它以更大的频率和强度向前推动其前部。

这些结果证明了 PTZ 的剂量依赖性，我们在所有 PTZ 敏感的突触传递突变体中观察到了这一点。重要的是，暴露于 PTZ 不足以在野生型蠕虫中诱发癫痫样抽搐。同样，我们已经尝试但未观察到 PTZ 诱导的胆碱能传递特定缺陷的蠕虫（例如 4 种）或胆碱能过度传播的蠕虫（如 tomasin 1）的癫痫样抽搐。

因此，根据它们对 PTZ 的相对敏感性，从一般突触功能缺陷或胆碱能传递的特定缺陷进一步表征具有 alde carb 抵抗性的突触传递突变体应该是可行的。也许令人惊讶的是，ONC 25 突变体的功能强烈降低，它在 C 优雅中缺乏可检测的 GABA 表达。抑制性运动神经元不会表现出本视频中所见的自发性癫痫性光抽搐。

ONC 25 突变体，每毫升水 10 毫克 PTZ。然而，表现出强烈的强直阵挛性抽搐，尽管没有显示仅在 ONC 25 相关的强直阵挛抽搐之前有一些运动的前部抽搐，并模拟了突触 Bren one 突变体的抽搐。因此，实验者不应假设所有抑制性 GABA 突变体在 PTZ 存在下都会表现出强直阵挛性惊厥或密切相关的强直性癫痫发作样活性，特别是考虑到获得亚型突变等位基因的可能性。

现在我们已经证明抑制性 GABA 突变体对 alde carb 和 PTZ 过敏，但只有对 alde carb 过敏和缺乏胆碱能传递负调节的突变体对 PTZ 的正常敏感性。人们可能想知道 UNC 43 功能丧失突变体在 PTZ 上是什么样子的，因为它们也对 Alda 碳水化合物过敏，就像我们在 43 上的其他突触传递突变体一样，在没有 PTZ 的情况下不会表现出明显的癫痫样抽搐，尽管这些突变体确实有罕见的非重复性，但仍然是自发的全身收缩，但在 43 上暴露于每毫升水 10 毫克 PTZ 后， 功能丧失突变体存在、稳健、重复和剂量依赖性全身抽搐。此时，这些结果是模棱两可的，但似乎表明 on 43 在抑制 GABA 能传递中不得具有特定作用，或仅在神经递质释放的负调节中发挥作用。

在 C 优雅神经系统中，我们刚刚向您展示了如何使用互补神经兴奋剂、alde carb、胆碱酯酶抑制剂和 PTZA GABA 受体拮抗剂来表征 CL elgan 突触传递突变体。当遵循任何一种互补的药理学范式时，请记住，对一种神经兴奋剂的敏感程度不能预测对另一种神经兴奋剂的敏感程度 利用 alde carb 测定应该有助于区分抑制性 GABA 突变体，这些突变体在 PTZ 上领导 Bob，但对 Alde 碳水化合物对一般突触功能缺陷突变体过敏， 它也在 PTZ 上领导 Bob，但对 alde carb 有抵抗力。此外，人们应该意识到，抑制性 GABA 突变体在 PTZ 上以 Bob 为头，而缺乏胆碱能传递负调节的蠕虫在 PTZ 上显示为野生型。

因此，PTZ 测定也可用于区分这些类别的突触传递突变体，它们都对 Alde 碳水化合物过敏。总之，PTZ 和 Alde 碳水化合物测定的补充方法应该允许实验者以单独使用任何一种药物都不可能的方式表征 C 优雅的突触传递突变体。感谢您的观看，祝您的实验好运。