Summary
我々は、マウスにおける内側半月（DMM）モデル、変形性関節症（OA）研究のための効果的なツールの不安定化のためのプロトコルを記述します。加えて、我々はプログラがOAの病因において保護的な役割を果たしていることを示す、このモデルを用いてprogranulincan誇張のOAの発症および進行の欠乏を示した。
Abstract
内側半月（DMM）モデルの不安定化は、 生体内での変形性関節症（OA）の発症に非常に多くの関節炎に関連する分子の病態生理学的役割を研究するための重要なツールです。しかし、マウスでは、この複雑なモデルを確立するための詳細な、特に可視化プロトコルは、使用できません。 - / - マウスではDMMモデルを誘導するためのプロトコルを導入する例として、マウス、およびこの外科的に誘発されたモデルの確立に続いて、OAの発症を比較して、ここに、我々は野生型およびプログラ（PGRN）を利用しました。マウスで実行された操作だけmenisco脛骨靭帯を切って内側半月の不安定化を引き起こし、関節包、またはDMMの操作を、開かれた偽手術、のいずれかであった。変形性関節症の重症度は、組織学的ア ッセイ（ 例えばサフラニンO染色）、OA関連遺伝子の発現、軟骨の細胞外マトリックス分子の分解、および骨棘のフォームを用いて評価したATION。マウス、およびこの外科的に誘導されたモデルでは、より深刻なのOAの表現型につながっPGNR成長因子の損失 - DMM操作が正常に野生型およびPGRN - /の両方でのOA開始および進行を誘導した。
Introduction
また、変形性関節症として知られている変形性関節症（OA）は、世界の人口の15％、米国内4600万人以上の人々に影響を与え、滑膜炎、軟骨の変性、および骨棘形成1によって特徴づけられる。それは、遺伝的な代謝、生体力学的および生化学的要因の複雑な相互作用の結果であり得る。 OAの基礎となるメカニズムは、科学界を回避し続けています。 2,3 OAの病因を模倣することができる多数の動物モデルが現在存在する。それがために、様々な遺伝子改変マウスの可用性および実験の費用対効果の両方のマウスにおいて、動物モデルを確立することが重要である。実験のOAモデルのさまざまな種類の中では、内側半月板（DMM）モデルの外科的に誘発される不安定化は、その良好な再現性やOA開発中に比較的遅く進行の広く受け入れられたOAモデルです。これらの属性の両方を持っているさまざまな治療法や導入遺伝子3-8のOA進行を評価するための鍵となって。しかしながら、外科OAモデルの一貫性は、手術中に様々な要因によって影響され、その結果、外科用マウスモデルの適用が制限される。
プログラニュリン（PGRN）は、様々な細胞で発現多機能成長因子である。なお、PGRNは、創傷治癒9、10腫瘍形成、および炎症11-15のような種々の生理学的および疾患プロセスにおいて重要な役割を果たすことが知られている。研究はまた、PGRNの不足は、ヒトおよびマウスの両方において16-18神経系の変性疾患を引き起こす可能性があることを示す。なお、PGRNは、ヒト関節軟骨において発現されることが知られており、そのレベルは有意にOA 19および慢性関節リウマチを有する患者の軟骨において上昇する。さらに、PGRNも軟骨細胞増殖20、分化および軟骨性に重要な役割を果たしている開発21,22の間の成長板の骨化。最近では、PGRNは、TNF受容体への結合を介して、TNF-α拮抗し、炎症性関節炎モデル13,14,23,24において抗炎症機能を示すことを報告した。しかしながら、OAにおけるPGRNの役割は、特にインビボで 、謎のままである。ここで、我々は、外科DMMモデルを誘導するための手順を提示し、WTおよびPGRN - / DMMでモデルを構築を通してOA開発におけるPGRNの役割を調査 - マウス。
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Protocol
動物に関連する手術手順のすべては、手術による痛みや不快感を極力配慮の努力で、地元の機関の動物管理倫理委員会の承認を得なければならない。
1。準備
- 手術のため、約25グラムの体重で8〜12週齢のオスのC57BL / 6マウスを選択します。
- キシラジン（5 mg / kgの）およびケタミン（40 mg / kg）の両方を含むカクテルの腹腔内注射により動物に麻酔。
- カミソリで膝を剃るし、外科的に動物をドレープし、ベータダイン及びアルコール（3×）で手術部位を消毒し、軟膏でマウスの眼をカバーしています。
2。外科的プロセス
- 膝関節を露出させ1センチメートル縦内側パラ膝蓋骨切開する。
- 膝蓋骨の横方向の脱臼と膝蓋靱帯を通してゆっくりと膝関節を開きます。
- 縦方向に膝関節包をカットステップ2.1の内側パラ膝蓋骨切開により。
- ピンセットで膝関節包を解剖。
- 左手で後肢の先端部をつかみ、そしてピンセットで膝蓋骨と膝蓋靭帯の横方向の転位を行う。優しく後肢を持って、足に外傷を避けるようにしてください。関節包を切開し、より良い、より少ない力が転位を行うために必要とされる。
- 軟骨表面の乾燥を避けるために、動作中の関節軟骨の表面に滅菌生理食塩水を滴下する。
- 脛骨プラトーに内側半月板を固定する内側meniscotibial靭帯を切断。内側半月の下に軟骨を痛めないようにしてください。
- 大腿骨の内側顆と脛骨の内側高原の間に位置内側半月板を特定します。
- 脛骨の顆間隆起と内側半月板の側面を接続meniscotibial靭帯を識別します。
- こんにちはを開催ND手で軽くPAW、及び第10外科用メスを使用して丁寧に内側meniscotibial靭帯を切断。関節軟骨や他の靭帯にけがの原因にならないことを確認してください。多くの場合、被覆脂肪パッド側に引っ張られる必要がなく、靭帯を同定するために除去されるべきではない。
- 6-0吸収性縫合糸で膝関節包を閉じます。
- 6-0絹縫合糸で皮膚を閉じます。
3。術後ケア
- 術後の痛みを最小限に抑えるために、各マウスの手術部位に0.25％ブピバカインの一滴を適用する。
- 水や食料を得るために自由に操作したマウスを残す。
4。外科DMMモデルの組織学的スコアリング
- 示された時点で、マウスを生け贄に捧げる手術後（ 例えば 4週間、8週間、12週間。ここでは、代表として8週間の結果を示した）。
- 全体膝関節は、脱灰し、embe固定されているパラフィンでddedしてから5ミクロン間隔で連続的に切断した。
- 第10ブレードを全体後肢を切った。
- 慎重に後肢の皮膚や筋肉を解剖し、RTに3日間、4％PFAでサンプルを固定します。
- PFAを外し、水でサンプルを清掃してください。その後、2週間、4℃で、EDTAのサンプルを脱灰。
- エタノール勾配でサンプルを脱水する。具体的には、エタノールを変更するO / Nの70％エタノールの新しいセット内のサンプルを維持、1時間70％エタノール中でサンプルを保つその後、結果として80％および90％エタノールに試料を入れて、O / Nを100％エタノール、続いて、それぞれ、1時間に残し
- エタノールを除去。 1時間o-キシレン中のサンプルを保持し、o-キシレンの新しいセットに変更します。このステップ3回繰り返します。
- ライカ埋め込むセンターを使用してパラフィン型の中にサンプルを埋め込む。その後、試料を回転式ミクロトーム（ライカRM225を使用して5μmに区画され、5、ドイツ）、次いでガラススライド上に集めた。
- シリアル矢状セクションは内側顆の中心に外側顆の中心から領域に及ぶ各サンプルのために切断されています。
- サフラニンO染色は、以前に行わ25記載のようにOARSI採点システムを介して採点し、統計分析が続く。
- まず、o-キシレン中でスライドを脱パラフィンし、蒸留水に対するエタノールの勾配でそれらを水和する。その後、スライドをワイゲルト鉄ヘマトキシリン溶液、0.05％ファストグリーン（FCF）溶液、1％酢酸溶液、および0.1％サフラニンO溶液を介して染色する。樹脂製のメディアを使用してスライドをマウントします。
- 組織学的スコアの統計分析を行う、軟骨と軟骨構造の破壊の割合のプロテオグリカン（赤色）の損失に基づいてサフラニンO染色スライドのスコア。
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Representative Results
DMMモデルが正常マウスに設立され、PGRNの欠乏は外科的に誘発されるOAの開発を誇張した。
マウス-偽とDMMの操作（ 図1）は 、WTおよびPGRN - /で行った。 8週間運転した後、マウスを屠殺し、サフラニンO染色は、組織学に基づいて、関節炎スコアの統計的分析、続いて、膝関節の切片上で実施した。 図2Aに示すように、同様のベースライン条件（上のパネル）を暗示サフラニンO染色に基づいて、偽手術群の両方の遺伝子型における軟骨の明らかな変性が存在しなかった。マウス（赤い矢印） - 8週間DMM動作（下のパネル）の後に、WT及びPGRN - /の両方でプロテオグリカンおよび軟骨構造の破壊の損失があった。両方のプロテオグリカンおよび軟骨の劣化の損失は、OAの表現型が正常に誘導を示唆している。 indicat列のバーDMM動作を次のイントラグループメンバー間の変動を編しかし、バーは比較的短く、PGRNノックアウトは高いプロテオグリカンの損失および軟骨構造はより厳しく、野生型品種と比較して破壊されたと表示される。また先に説明したように25、軟骨スコアのための統計分析を行い、軟骨スコアは、WT群よりPGRNノックアウトマウスにおいて有意に高かった。我々の結果は、PGRNの損失がより重度OA表現型をもたらすことを実証した。
図1。 DMM誘導のための外科的処置。 。内側パラ膝蓋骨切開膝関節の皮膚で作られています。B。関節包の横脱臼後の膝関節腔の露出。C。インナーS膝関節のtructure。青い矢印は、内側半月板を示している。黄色の矢印はmeniscotibial靭帯を示しています。D。内側半月板が不安定になる。青い矢印は、元のサイトからずれて内側半月板を示している。黄色の矢印は、解剖されていますmeniscotibial靭帯の残存部分を示している。D。関節包が。F閉じています。肌が閉じられている。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2。変形性関節症のスコアのための組織学および統計分析の代表的な写真 WT及びPGRN - /のA.代表組織像-マウス偽手術や、DMMを次の8週間、サフラニンO染色により分析した。赤い矢印は、軟骨破壊を示している。軟骨中の赤色の損失はプロテオグリカンの損失を意味します。スケールバー、PGRN - /の両方で、変形性関節症のスコアを100ミクロンB.統計的分析-とWTマウスで拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
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Discussion
これは、マウスの異なる株はC57BL6、129/SvInJ、その後FVB続く、129/SvEv株では最高レベルで、DMMの後にOAの重症度を変化させてきたようにマウスの系統は、DMMモデルの誘導のために非常に重要であることが報告されている/ N 26。 DMMに比較的影響を受けやすい我々は本研究で使用したマウス、 - 導入遺伝子の大部分は、PGRN - /などのC57BL6マウスで確立されている。導入遺伝子は、このようなFVB / Nマウスのような小文字を区別しない株に基づいている場合は、それは、DMM誘導前の感受性株で、これらのマウスを戻し交配することが必要である。研究は既に雌マウスは、雄マウス27よりも感度が低いことが示されているように、DMMの誘導のために使用したマウスの性別も非常に重要です。また、DMMの動作のためのマウスの年齢はまた、OAの病因に重要な役割を果たしている文献29に基づいて、12週齢の古い8週間ごとに異なります。したがって、同じ年齢のマウスは、この影響を排除するために操作すべき。術後疼痛管理、手術後のマウスの動きを向上させるために必要とされる。 DMMモデルは術後の痛みの結果、軟骨、不適切な動きの運動媒介損耗を通じて、OAにつながるなどのOA発展の矛盾が発生することがあります。現在、内側半月4,28を削除するかどうかについて、DMMの定義に関する不一致があります。我々の現在の研究では、単に内側半月を不安定化だけで、取り外しませんでした。 DMMモデルにおける病変は、主に内側脛骨プラトーの中央の荷重負荷領域に位置し、病変の重症度は、時間経過（未発表データ）の間に増加し、その結果は、以前の報告と一致していた5。さらに、DMM操作に続いOARSIのスコアが同じ遺伝グループの異なるメンバーの間で比較的一致していた。
PGRNは、軟骨の発達および関節炎14,21において重要な役割を果たしている。我々以前に報告されたメタロプロテアーゼADAMTS-7およびADAMTS-12、19および分解から軟骨マトリックスタンパク質COMPを保護するとともにPGRN interplays。また、TNF-αは、軟骨破壊24において重要な役割を果たしていることが十分に確立されている。最近では、PGRNは、TNF-α拮抗し、炎症性関節炎モデル14に軟骨破壊から保護することを見出した。本研究では、WT及びPGRN - /でDMMモデルを誘発した - マウス、および予想されるように、PGRN - / - マウスは、サフラニンO染色でプロテオグリカンのより深刻な損失によって示された、DMM、誘導後OAの誇張された進行を示し、組織学に基づいて、有意に高い関節炎スコア（ 図2）。 PGRNの不足で加速OA進行を示唆し、グループ（未発表データ） - また、異化のマーカーの発現を劇的にPGRN - /において上昇した。
結論として、DMMモデルSの確立のための我々のプロトコルuccessfully誘起のOA WT及びPGRN - /における表現 - マウス、および誘導は一貫性があり、生殖た。 C57/B6マウスにおけるDMMモデルの成功の世代は、将来的にはOAの治療薬とOA関連遺伝子を評価するための有用なツールを提供しています。現在の研究では、DMMモデルの結果は、OA開発におけるPGRNの保護的な役割について説明します。
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Disclosures
私たちはここに、我々は利害関係のないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品はR01AR062207、R01AR061484、R56AI100901、K01AR053210、そして病気が（CJ劉へ）リウマチ研究財団から研究助成を狙っNIHの研究助成金によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| No. 10 Surgical blades | Feather | 25-2976#10 | |
| 6-0 suture | Applied Dental | WG-N53133 |
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