Summary
我们描述了一个协议内侧半月板（DMM）模型小鼠中，一种有效的工具，骨关节炎（OA）研究的不稳定。此外，我们已经证明progranulincan夸大OA的发生和发展利用该模型的不足，表明progranulin的发挥在OA的发病机制中起保护作用。
Abstract
内侧半月板不稳定（DMM）模型是研究在骨关节炎（OA） 在体内的致病众多的关节炎相关分子的病理生理作用的一个重要工具。然而，详细的，尤其是可视化协议，用于在小鼠体内建立这种复杂的模型，无法使用。在此我们利用野生型和progranulin的（PGRN）的 - / - 小鼠为例子来介绍一种协议，用于诱导DMM模型小鼠，与OA相比下成立了这个手术引起的模型的发作。在老鼠身上进行的操作要么假手术，这只是开了关节囊，或数字万用表操作，这将削减MENISCO，胫骨韧带，造成内侧半月板不稳定。用组织学检测（ 如番红O染色），办公自动化相关基因的表达，降解软骨细胞外基质分子和骨赘骨关节炎形式严重性进行评估通报BULLETIN。 DMM操作成功诱导的OA发生和发展中都野生型和PGRN-/ - 小鼠，并导致了在此手术诱导模型更严重的表型OA PGNR生长因子损失。
Introduction
骨关节炎（OA），也称为退行性关节炎，影响到世界人口的15％，超过46万人在美国，并且其特征在于滑膜炎，软骨变性和骨赘形成1。它可以是遗传，代谢，生物力学和生化因素之间复杂的相互作用的结果。 OA的基本机制继续回避科学界。目前有许多动物模型中，可以模仿OA 2,3的发病机制。它建立各种转基因小鼠的两个可用性和实验的成本效益，因为动物模型小鼠中是很重要的。其中各种不同的实验OA模型中，手术引起的内侧半月板（DMM）模型的不稳定是由于其良好的重现性和OA的发展过程中一个相对进展较慢一个广为接受的OA模型。这两个属性有是关键的不同处理或转基因3-8 OA进展的评估。然而，外科手术的OA模型的一致性在外科手术，其结果是受多种因素影响，手术小鼠模型中的应用是有限的。
的progranulin（PGRN）是表示在各种细胞多功能生长因子。它是已知的PGRN起着各种生理和疾病过程，如伤口愈合9，肿瘤10和炎症11-15的关键作用。研究还表明，PGRN的不足可引起神经系统的退化性疾病在人类和小鼠16-18。它是已知的PGRN表达在人关节软骨，其水平是在患者的骨关节炎和类风湿关节炎的19软骨显著升高。此外，PGRN也起着软骨细胞增殖20，分化和软骨内至关重要的作用生长板的发育21,22中骨化。最近，我们报道了PGRN通过结合TNF受体拮抗TNF-α和表现出抗炎作用在炎性关节炎模型13,14,23,24。然而，PGRN的在OA中的作用，特别是在体内 ，仍然是一个谜。在此，我们提出的方法诱导手术DMM模型，并通过在WT和PGRN-/建立数字万用表模型研究PGRN的在OA发展中的作用 - 小鼠。
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Protocol
所有与动物的外科手术应该由本地机构的动物护理和伦理委员会，以尽可能避免疼痛而造成手术的不适努力的批准。
1。准备
- 选择8-12周龄雄性C57BL / 6小鼠体重手术约25g。
- 通过腹膜内注射含有甲苯噻嗪（5毫克/千克）和氯胺酮（40毫克/千克）鸡尾酒的麻醉动物。
- 剃须膝盖用剃刀，然后手术悬垂的动物和消毒手术部位用优碘和酒精（3次）并覆盖鼠标眼睛软膏。
2。手术过程
- 做1厘米的纵向段内侧髌切口，显露膝关节。
- 通过髌骨和髌韧带外侧脱位轻轻打开膝关节。
- 切开膝关节囊纵向通过段内侧髌切口在步骤2.1。
- 解剖膝关节囊用钳子。
- 抓住后爪与左手的远端部分，并执行髌骨和髌韧带与钳的横向错位。按住后爪轻轻的，并确保避免在爪子创伤。关节囊被解剖越好，越少力将被要求作出的错位。
- 操作过程中滴落的关节软骨的表面上的无菌盐水中，以避免干燥出软骨表面。
- 切入内侧meniscotibial韧带其中锚内侧半月板的胫骨平台。避免伤及内侧半月板下方的软骨。
- 确定内侧半月板股骨内侧髁和内侧胫骨平台之间的定位。
- 确定meniscotibial韧带是连接内侧半月板外侧与胫骨髁间嵴。
- 抱喜ND爪子轻轻的手，划破内侧meniscotibial韧带仔细用10号手术刀片。确保不造成损伤关节软骨和韧带等。在许多情况下，覆盖脂肪垫需要被拉到一边而不是为了识别韧带被删除。
- 关闭膝关节囊用6-0可吸收缝线。
- 关闭用6-0丝线缝合皮肤。
3。术后护理
- 申请一滴0.25％布比卡因在每只小鼠以减少手术后疼痛的外科手术部位。
- 离开手术小鼠自由地去水和食物。
4。手术DMM模型组织学评分
- 牺牲小鼠在指定的时间点（ 例如，4周，8周，12周，在这里，我们表明8周的结果作为代表），在手术后。
- 整个膝关节固定，脱钙，EMBE石蜡dded，然后在5微米的间隔连续切片。
- 全切后肢与第10号刀片。
- 解剖后肢的皮肤和肌肉仔细，固定的试样，用4％PFA中于室温3天。
- 取出PFA和清洁水样品。此后，脱钙在EDTA中的样品在4℃下2周。
- 脱水的样品中的乙醇梯度。详细地说，保持样品在70％乙醇中1小时，然后改变它的乙醇，并保持在样品中一组新的70％乙醇的O / N。之后，把样品在80％和90％乙醇因此，并保持1小时后，分别后，再用100％乙醇中的O / N。
- 除去乙醇。保持样品中邻二甲苯1小时，并切换到一组新的邻二甲苯。重复此步骤3次。
- 嵌入样品到使用徕卡包埋中心石蜡模具。之后，将样品用旋转切片机（Leica RM225切片在5微米5，德国），然后收集在玻璃载玻片上。
- 串行矢状切片切成每个样品从外侧髁的内髁的中心的中心跨越的区域。
- 番红O染色进行，然后通过OARSI评分系统计分和统计分析，如先前25所述。
- 首先，deparaffinize的幻灯片中邻二甲苯，和滋润他们在乙醇梯度蒸馏水。此后，幻灯片通过韦格特的铁苏木素液，0.05％快速绿色（FCF）溶液，1％醋酸溶液和0.1％番红O解决方案染色。使用树脂介质安装的幻灯片。
- 评分基于蛋白多糖（红色）的软骨和破坏的软骨结构比例的损失番红Ø染色切片，做统计分析的组织学评分。
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Representative Results
成功建立了小鼠DMM模型，PGRN的缺陷夸大手术引起的OA发展。
老鼠-深水和数字万用表操作（ 图1）WT和PGRN-/执行了。操作8周后，处死小鼠，并番红O染色对从膝关节的部分来进行，随后关节炎得分基于组织学的统计分析。 如图2A所示 ，有软骨的基于番红O染色，这暗示了类似的基线情况（上图），没有明显的退化在两个基因型在假手术组。 8周后数字万用表操作（下图），有蛋白多糖及破坏软骨结构的WT和PGRN-/（亏损） - 小鼠（红色箭头）。两个蛋白多糖和软骨退化的损失表明成功诱导的OA中的表型。 indicat列的条编下面的数字万用表操作组内成员之间的变化。然而，杆比较短，并且PGRN击倒显示更高损耗蛋白多糖和软骨结构进行了更严重相比于野生型品种摧毁。此外，进行如先前所述25软骨得分的统计分析，以及软骨得分显著高于PGRN基因敲除比WT组。我们的研究结果表明，PGRN的损失导致更严重的表型的OA。
图1。外科手术DMM感应。后一个段内侧髌切口在膝关节的皮肤。 湾暴露膝关节间隙关节囊的外侧脱位。 角内structure膝关节。蓝色箭头表示内侧半月板。黄色箭头显示meniscotibial韧带。Ð。内侧半月板被动摇。蓝色箭头表示内侧半月板是从原网站脱臼。黄色箭头显示meniscotibial韧带已被解剖。 的D残留一部分，关节囊被关闭。（六）本皮肤被关闭。 点击这里查看大图。
图2。组织学和统计分析的得分骨关节炎的代表性图片 WT和PGRN-/的A。代表组织图像-以下小鼠8周假手术或数字万用表，通过测定番红O染色。红色箭头表示软骨破坏。红颜色的软骨损失意味着蛋白多糖的损失。比例尺，100微米B.在这两个PGRN-/得分骨性关节炎的统计分析-和野生型小鼠点击这里查看大图。
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Discussion
据报道，小鼠的品系是非常重要的DMM模型诱导，小鼠作为不同菌株有不同的OA严重性DMM后，用在129/SvEv应变水平最高，其次是C57BL6，129/SvInJ然后FVB / Ñ26。转基因的一大部分是建立在C57BL6小鼠，如PGRN-/ - 小鼠，我们在本研究中使用，这是相对容易的DMM。然而，如果转基因是基于不敏感的菌株如FVB / N小鼠，它是必要的回交这些小鼠与DMM诱导前敏感菌株。用于数字万用表诱导小鼠的性别也是非常重要的，因为研究已经表明，雌性小鼠比雄性小鼠27不太敏感。此外，小鼠的年龄数字万用表操作变化从8周龄根据文献29，这也扮演在OA的发病机制中发挥关键作用12周龄。因此，相同年龄的小鼠应被操作以消除这种影响。手术后疼痛控制是必需的，以提高手术后的小鼠的运动。由于DMM模型通过运动介导的磨损和撕裂的软骨，运动不足导致OA的手术后疼痛的结果可能会导致OA的发展不一致。目前没有关于关于是否删除内侧半月板4,28数字万用表的定义存在差异。在我们的研究中，我们仅仅是不稳定的内侧半月板，但没有将其删除。在数字万用表型号病变主要位于在胫骨平台内侧中央负重区和时间过程（未发表资料）在病变的严重程度增加，结果与以前的报道一致5。此外，OARSI得分下列数字万用表的操作是相同的基因组的不同成员之间的相对一致。
PGRN起着软骨发育和关节炎14,21中起重要作用，我们以前报道，PGRN interplays与金属蛋白酶ADAMTS-7和ADAMTS-12，并且保护免受降解19软骨基质蛋白COMP。此外，它是完善的，肿瘤坏死因子-α起着软骨破坏24起关键作用。近来，我们发现，PGRN拮抗TNF-α和在炎性关节炎模型14保护，防止软骨破坏。在这项研究中，我们的DMM诱导模型在WT和PGRN-/ - 小鼠，并如预期，PGRN-/ - 小鼠表现出的OA夸张的进展归纳如下数字万用表，这是在番红O染色显示由蛋白多糖的更严重的损失，以及显著更高关节炎得分基于组织学（ 图2）。此外，分解代谢标志物的表达水平显着升高，PGRN-/ - 组（未发表数据），这表明在PGRN的缺乏加速OA的进展。
总之，我们对建立数字万用表型号S协议uccessfully诱导的OA的表型在WT和PGRN-/ - 小鼠，诱导是一致的和生殖。成功的新一代数字万用表模型C57/B6小鼠为今后评估治疗药物和OA相关基因的OA的有用工具。在目前的研究中，数字万用表模型的结果文档的PGRN在OA开发保护作用。
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Disclosures
我们在此声明，我们没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院的研究经费R01AR062207，R01AR061484，R56AI100901，K01AR053210，并且针对的疾病研究资助由风湿病研究基金会（以CJ刘）部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| No. 10 Surgical blades | Feather | 25-2976#10 | |
| 6-0 suture | Applied Dental | WG-N53133 |
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