Summary
Nós descrevemos um protocolo para a desestabilização do menisco medial modelo (DMM) em camundongos, uma ferramenta eficaz para a osteoartrite (OA) de pesquisa. Além disso, temos demonstrado que a deficiência de exagerar desenvolvimento OA progranulincan e progressão usando esse modelo, indicando que progranulin desempenha um papel protetor na patogênese da OA.
Abstract
Desestabilização do menisco medial (DMM) modelo é uma importante ferramenta para estudar os papéis fisiopatológicos da artrite inúmeras moléculas associadas na patogênese da osteoartrite (OA) in vivo. No entanto, o pormenorizada, especialmente o protocolo visualizado para o estabelecimento deste modelo complicado em ratinhos, não está disponível. Aqui aproveitamos tipo selvagem e progranulin (PGRN) - / - ratos como exemplos para introduzir um protocolo para a indução do modelo DMM em camundongos, e comparou o início da OA após o estabelecimento deste modelo induzida cirurgicamente. As operações realizadas em ratos eram ou operação simulada, que acaba de abrir cápsula articular, ou operação DMM, que cortou o ligamento menisco-tibial e causou desestabilização do menisco medial. Osteoartrite gravidade foi avaliada utilizando o ensaio histológico (por exemplo, coloração de Safranina O), manifestações de genes OA-associados, a degradação de cartilagem moléculas de matriz extracelular, e forma de osteófitosção. Operação DMM induzida com sucesso a iniciação e progressão da OA em tanto o tipo selvagem e PGRN-/ - ratinhos, e a perda de factor de crescimento PGNR levou a um fenótipo OA mais grave neste modelo induzido cirurgicamente.
Introduction
A osteoartrite (OA), também conhecida como artrite degenerativa, afeta 15% da população mundial e mais de 46 milhões de pessoas nos Estados Unidos, e é caracterizada por sinovite, degeneração da cartilagem e formação de osteófitos 1. Ele pode ser um resultado de uma interacção complexa de factores genéticos, metabólicos, bioquímicos e biomecânicos. Os mecanismos subjacentes da OA continuar a iludir a comunidade científica. Existem atualmente vários modelos animais que podem imitar a patogênese da OA 2,3. É importante estabelecer modelos animais em ratos por causa tanto da disponibilidade de vários ratinhos geneticamente modificados e a relação custo-eficácia da experimentação. Entre os diferentes tipos de modelos experimentais de OA, a desestabilização induzida cirurgicamente de menisco medial modelo (DMM) é um modelo bem aceite OA por causa da sua boa reprodutibilidade e uma progressão relativamente lenta durante o desenvolvimento de OA. Ambos os atributos têmsido importantes para a avaliação de progressão da OA em diferentes tratamentos ou transgenes 3-8. No entanto, a consistência do modelo OA cirúrgica é afetada por vários fatores durante a cirurgia e, como resultado, a aplicação do modelo cirúrgico do mouse é limitado.
Progranulin (PGRN) é um factor de crescimento multi-funcional expressa em várias células. Sabe-se que PGRN desempenha um papel crucial em diversos processos fisiológicos e patológicos tais como cicatrização de feridas 9, 10 tumorigénese, e inflamação 11-15. Estudos também mostraram que a insuficiência de PGRN pode causar doenças degenerativas do sistema nervoso, em seres humanos e ratinhos 16-18. Sabe-se que PGRN é expresso na cartilagem articular humana, e o seu nível é significativamente elevado na cartilagem dos pacientes com OA e de artrite reumatóide 19. Além disso, PGRN também desempenha um papel fundamental na proliferação de condrócitos 20, diferenciação e endocondralossificação da placa de crescimento durante o desenvolvimento 21,22. Recentemente, informamos que PGRN TNF-α antagonizou através da ligação a receptores de TNF e exibiu uma função anti-inflamatória em modelos de artrite inflamatória 13,14,23,24. No entanto, o papel de PGRN na OA, especialmente in vivo, continua a ser um enigma. Aqui, apresentamos o procedimento para induzir um modelo DMM cirúrgico, e investigar o papel do PGRN no desenvolvimento OA através do estabelecimento de modelo DMM no WT e PGRN-/ - ratos.
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Protocol
Todos os procedimentos cirúrgicos relativos aos animais devem ser aprovados pelo Animal Care e Comitê de Ética da Instituição local, com um esforço feito para minimizar a dor eo desconforto causado pela cirurgia.
1. Preparação
- Escolha de 8-12 semanas de idade macho C57BL / 6 com um peso corporal de cerca de 25 g para a cirurgia.
- Anestesiar os animais por meio de injecção intra-peritoneal de um coquetel contendo tanto xilazina (5 mg / kg) e cetamina (40 mg / kg).
- Raspar o joelho com lâminas de barbear, então armar cirurgicamente o animal e esterilizar o local da cirurgia com betadine e álcool (3x) e cobrir os olhos do rato com pomada.
2. Processo cirúrgico
- Faça de 1 cm longitudinal medial para-patelar incisão para expor articulação do joelho.
- Abra a articulação do joelho suavemente através de deslocamento lateral da patela e do ligamento patelar.
- Corte a cápsula articular do joelho longitudinalmenteatravés da incisão medial para-patelar no passo 2.1.
- Dissecar joelho cápsula articular com uma pinça.
- Pegue a parte distal da pata traseira com a mão esquerda, e realizar o deslocamento lateral da patela e do ligamento patelar com uma pinça. Segure a pata traseira com cuidado e certifique-se de evitar o trauma na pata. O melhor da cápsula articular é dissecado, menos força será necessária para fazer o deslocamento.
- Gotejamento salina estéril na superfície da cartilagem articular durante o funcionamento, para evitar a secagem da superfície da cartilagem.
- Corte através do ligamento medial meniscotibial que ancora menisco medial do platô tibial. Evite ferir a cartilagem sob o menisco medial.
- Identificar o menisco medial, que localiza entre côndilo medial do fêmur e platô medial da tíbia.
- Identificar o ligamento meniscotibial que liga face lateral do menisco medial com eminência intercondilar da tíbia.
- Segure o oiª pata suavemente com a mão, ea atravessar o ligamento medial meniscotibial cuidadosamente usando uma lâmina cirúrgica n º 10. Certifique-se de não causar ferir a cartilagem articular e outros ligamentos. Em muitos casos, a almofada de gordura de cobertura tem de ser puxado para o lado, mas não para ser removida, a fim de identificar o ligamento.
- Feche a cápsula articular do joelho com uma sutura absorvível 6-0.
- Feche a pele com seda 6-0.
3. Cuidados pós-operatórios
- Aplique uma gota de bupivacaína a 0,25% no sítio cirúrgico de cada rato para minimizar a dor pós-operatória.
- Deixe os ratos operados livre para conseguir água e comida.
4. Scoring histológica da Surgical Modelo DMM
- Sacrificar os ratos em pontos indicados tempo (por exemplo, quatro semanas, 8 semanas e 12 semanas. Aqui nós mostramos os resultados de oito semanas como representante) após a cirurgia.
- As articulações do joelho são inteiros fixos, descalcificadas, embedded por parafina e seccionados em série no intervalo de 5 um.
- Cortar toda a membros posteriores com No. 10 lâminas.
- Dissecar a pele e músculos dos membros posteriores com cuidado, e fixar as amostras com PFA 4% para 3 dias em RT.
- Retire a PFA, e limpar as amostras com água. Posteriormente, as amostras descalcificar em EDTA a 4 ° C durante 2 semanas.
- Desidratar as amostras em um gradiente de etanol. Em detalhe, manter as amostras em etanol 70% por 1 hora, em seguida, mudar o etanol e manter as amostras em um novo conjunto de 70% de etanol para O / N. Em seguida, colocar as amostras de 80% e etanol a 90%, por conseguinte, e mantê-los durante 1 hora, respectivamente, seguido de etanol a 100% para S / N.
- Remover o etanol. Mantenha as amostras em oxylene por 1 hora, e mudar para um novo conjunto de oxylene. Repita este passo 3x.
- Incorporar as amostras em um molde de parafina utilizando o centro incorporar a Leica. Em seguida, as amostras são seccionados a 5 mM usando um micrótomo rotativo (Leica RM2255, Alemanha) e, em seguida, recolhidos em lâminas de vidro.
- Sagitais em série são cortados de cada amostra medindo a região a partir do centro do côndilo lateral para o centro do côndilo medial.
- Safranina O coloração é realizada, seguida pela pontuação e análise estatística por meio do sistema de pontuação OARSI como descrito previamente 25.
- Em primeiro lugar, Retire a parafina os slides em oxylene e hidratá-los em um gradiente de etanol para água destilada. Depois disso, as lâminas são coradas através de hematoxilina de ferro de Weigert solução, de 0,05% Fast Green (FCF) solução, solução de ácido acético a 1%, e 0,1% de Safranina O Solução. Montar as lâminas utilizando meio resinoso.
- Marque as lâminas coradas safranina O baseados em perda de proteoglicanos (cor vermelha) na cartilagem e porcentagem de destruição na estrutura da cartilagem, fazer uma análise estatística para o escore histológico.
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Representative Results
Modelo DMM foi estabelecida com sucesso em camundongos, e deficiência de PGRN exagerado desenvolvimento OA induzida cirurgicamente.
Operações Sham e DMM (Figura 1) foram realizadas em WT e PGRN-/ - ratinhos. 8 semanas após a operação, os ratos foram sacrificados, e Safranina O coloração foi realizada em secções de articulações do joelho, seguido de análise estatística da pontuação de artrite, com a histologia. Como mostrado na Figura 2A, houve nenhuma degeneração de cartilagem evidente em ambos os genótipos, os grupos de operação simulada com base em Safranina O coloração, o que implica as condições da linha de base semelhantes (painéis superiores). 8 semanas após a operação DMM (painéis inferiores), houve perda de proteoglicanos e destruição da estrutura da cartilagem em ambos WT e PGRN-/ - ratos (setas vermelhas). Tanto a perda de proteoglicano e degradação da cartilagem sugere a indução bem sucedida do fenótipo OA. As barras das colunas indicandoed a variação entre os membros do grupo intra seguinte operação DMM. No entanto, a barra é relativamente curto, e knockouts PGRN exibida uma maior perda de proteoglicano e da estrutura da cartilagem foi mais severamente destruído em comparação com o tipo selvagem da raça. Além disso, a análise estatística para a pontuação da cartilagem foi realizada como descrito anteriormente 25, e pontuação da cartilagem foi significativamente mais elevada nos orifícios PGRN que o grupo WT. Os nossos resultados demonstraram que a perda de PGRN resultou em mais grave fenótipo OA.
Figura 1. O procedimento cirúrgico para a indução DMM. a. Uma incisão para-patelar medial é feita em pele de articulação do joelho. b. exposição de espaço articular do joelho após luxação lateral da cápsula articular. c. Inner sstrutura da articulação do joelho. Seta azul indica menisco medial. A seta amarela mostra ligamento meniscotibial. D. Menisco medial é desestabilizado. Seta azul indica que o menisco medial, que é deslocado do local original. A seta amarela mostra parte residual do ligamento meniscotibial que foi dissecado. D. A cápsula articular é fechado. F. A pele é fechada. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Fotos representativas de histologia e análise estatística para a pontuação da osteoartrite A. Representante fotos histológicas do WT e PGRN-/ -. Camundongos oito semanas após operação simulada ou DMM, Ensaiada por Safranina O coloração. As setas vermelhas indicam a destruição da cartilagem. A perda da cor vermelha na cartilagem implique perda de proteoglicanos. Barra de escala, 100 mm B. A análise estatística para a pontuação da osteoartrite em ambos PGRN-/ -.. Ratos e WT Clique aqui para ver imagem ampliada.
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Discussion
É relatado que a linhagem de ratos é muito importante para a indução do modelo DMM, com diferentes linhagens de camundongos têm diferentes gravidade da OA após DMM, com alto nível na cepa 129/SvEv, seguido por C57BL6, 129/SvInJ e FVB / n 26. Uma grande parte dos transgenes são estabelecidos em ratos C57BL6, como PGRN-/ - ratos foram utilizados no presente estudo, que são relativamente suscetíveis a DMM. No entanto, se o transgene é baseado na estirpe insensível como FVB / n murganhos, é necessário retrocruzamento estes ratinhos com estirpes sensíveis antes da indução de DMM. O sexo de ratos utilizados para a indução DMM também é muito importante, estudos já demonstraram que camundongos fêmeas são menos sensíveis do que os ratos do sexo masculino 27. Além disso, a idade de ratinhos para a operação DMM varia de 8 semanas de idade e 12 semanas de idade, com base na literatura 29, que também desempenha um papel crucial na patogénese da OA. Portanto, os ratinhos da mesma idade deve ser operado para eliminar este efeito. Controlo da dor pós-operatória é necessária para aumentar o movimento de ratinhos após a cirurgia. Como modelo DMM leva a OA através desgaste movimento mediada e desgaste na cartilagem, o movimento inadequado, como resultado de dor pós-operatória pode causar inconsistência de desenvolvimento OA. Atualmente existe uma discrepância relativa à definição de DMM sobre se deve ou não remover o menisco medial 4,28. Em nosso estudo, apenas desestabilizou menisco medial, mas não removê-lo. As lesões no modelo DMM estavam localizados principalmente na região central de suporte de peso do planalto tibial medial, e da gravidade das lesões aumentada durante o decurso do tempo (dados não publicados), e os resultados foram consistentes com os relatórios anteriores 5. Além disso, a pontuação OARSI seguinte operação DMM foi relativamente consistente entre os diferentes membros do mesmo grupo genético.
PGRN desempenha um papel importante no desenvolvimento da cartilagem e artrite 14,21. Nósrelatado anteriormente que interplays PGRN com metaloproteases ADAMTS-7 e ADAMTS-12, e protege a cartilagem COMP proteína da matriz da degradação 19. Além disso, é bem estabelecido que o TNF-α desempenha um papel crítico na destruição de cartilagem 24. Recentemente, descobrimos que PGRN TNF-α antagonizou e protegidos contra a destruição da cartilagem em modelos de artrite inflamatória 14. Neste estudo, foram induzidas modelo DMM em WT e PGRN-/ - ratinhos, e como esperado, PGRN-/ - ratinhos exibiram a progressão da OA exageradas após a indução da DMM, o qual foi indicado pela perda mais grave de proteoglicano em Safranina O e coloração significativamente mais elevado grau de artrite, com a histologia (Figura 2). Além disso, as expressões dos marcadores catabólicos foram elevados drasticamente em PGRN-/ - grupo (dados não publicados), sugerindo a progressão acelerada OA na deficiência de PGRN.
Em conclusão, nosso protocolo para criação do modelo DMM sinduzida uccessfully fenótipo OA no WT e PGRN-/ - ratos, ea indução foi consistente e reprodutiva. A geração de sucesso do modelo DMM em camundongos C57/B6 fornece uma ferramenta útil para avaliar agentes terapêuticos e genes relacionados para OA OA no futuro. No estudo atual, o resultado do modelo DMM documenta um papel protetor da PGRN no desenvolvimento de OA.
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Disclosures
Nós aqui declaramos que não temos nenhum conflito de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH bolsas de investigação R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210, e uma doença Targeted Research Grant da Fundação de Pesquisa de Reumatologia (para CJ Liu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| No. 10 Surgical blades | Feather | 25-2976#10 | |
| 6-0 suture | Applied Dental | WG-N53133 |
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