Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für die Destabilisierung des medialen Meniskus (DMM)-Modell bei Mäusen, ein wirksames Instrument für Osteoarthritis (OA) Forschung. Darüber hinaus haben wir diesen Mangel an progranulincan übertreiben OA Entwicklung und Progression von mit diesem Modell gezeigt, das anzeigt, dass progranulin spielt eine schützende Rolle in der Pathogenese der OA.
Abstract
Destabilisierung des medialen Meniskus (DMM) Modell ist ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung der pathophysiologischen Rollen von zahlreichen Arthritis assoziierten Molekülen in der Pathogenese von Osteoarthritis (OA) in vivo. Allerdings ist die detaillierte, vor allem die visualisiert Protokoll für die Einrichtung dieses kompliziertes Modell bei Mäusen, ist nicht verfügbar. Dabei nutzten wir die Wildtyp-und progranulin (PGRN) - / - Mäuse als Beispiele ein Protokoll zur Induktion DMM Modell bei Mäusen, und verglichen das Auftreten von OA folgende Einrichtung dieser chirurgisch induzierten Modell einzuführen. Die an Mäusen durchgeführten Operationen waren entweder Schein-Operation, die gerade geöffnet Gelenkkapsel oder DMM-Operation, die die menisco-Schienbeinbandes geschnitten und verursachte Destabilisierung des medialen Meniskus. Schwere Arthrose wurde mit histologischen Test (z. B. Safranin-O-Färbung), Ausdrücke der OA-assoziierten Gene, Abbau von Knorpel extrazellulären Matrix-Moleküle und Osteophyten Form ausgewertetation. Mäuse, und der Verlust der PGNR Wachstumsfaktor führte zu einer schweren OA Phänotyp in dieser chirurgisch induzierten Modell - DMM Vorgang erfolgreich OA Initiierung und Progression sowohl in Wildtyp-und PGRN-/ induziert.
Introduction
Osteoarthritis (OA), auch als degenerative Arthritis bekannt ist, betrifft 15% der Weltbevölkerung und mehr als 46 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten und wird von Synovitis, Knorpeldegeneration und Osteophytenbildung 1 gekennzeichnet. Es kann ein Ergebnis eines komplexen Zusammenspiels von genetischen, metabolischen, biomechanischen und biochemischen Faktoren. Die zugrunde liegenden Mechanismen der OA auch weiterhin die wissenschaftliche Gemeinschaft zu entziehen. Derzeit gibt es zahlreiche Tiermodelle, die die Pathogenese der OA 2,3 nachahmen kann. Es ist wichtig zu Tiermodellen bei Mäusen, weil sowohl die Verfügbarkeit von verschiedenen genetisch veränderten Mäusen und die Wirtschaftlichkeit Experimentieren herzustellen. Unter den verschiedenen Arten von Versuchs OA Modellen ist die chirurgisch induzierten Destabilisierung des medialen Meniskus (DMM)-Modell ein gut angenommen OA-Modell aufgrund seiner guten Reproduzierbarkeit und einem relativ langsamer Progression bei OA Entwicklung. Beide dieser Attributeder Schlüssel für die Bewertung der Progression OA in verschiedenen Behandlungen oder Transgene 3-8. Jedoch wird die Konsistenz der chirurgischen OA Modell durch verschiedene Faktoren während der Operation und als Ergebnis beeinflusst, ist die Anwendung von chirurgischen Mausmodell beschränkt.
Progranulin (PGRN) ist ein multifunktionales Wachstumsfaktor in verschiedenen Zellen exprimiert. Es ist bekannt, dass PGRN spielt eine entscheidende Rolle bei unterschiedlichen physiologischen und Krankheitsprozessen wie der Wundheilung 9, Tumorgenese 10, 11-15 und Entzündungen. Studien auch gezeigt, dass unzureichende PGRN können degenerative Erkrankungen des Nervensystems bei Menschen und Mäusen 16-18 führen. Es ist bekannt, dass PGRN in menschlichen Gelenkknorpel ausgedrückt, und der Wert ist signifikant im Knorpel des Patienten mit Arthrose und rheumatoide Arthritis 19 erhöht. Darüber hinaus spielt PGRN auch eine entscheidende Rolle in Chondrozytenproliferation 20, Differenzierung und endochondralenVerknöcherung der Wachstumsfuge während der Entwicklung 21,22. Vor kurzem berichteten wir, dass PGRN TNF-α antagonisiert durch Bindung an TNF-Rezeptoren und zeigten eine entzündungshemmende Funktion bei entzündlichen Arthritis-Modellen 13,14,23,24. Jedoch ist die Rolle der PGRN in OA, insbesondere in vivo, bleibt ein Rätsel sein. Hier stellen wir das Verfahren zur chirurgischen DMM Modell zu induzieren, und untersuchen die Rolle der PGRN in OA Entwicklung durch Gründung DMM Modell in WT-und PGRN-/ - Mäusen.
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Protocol
Alle chirurgischen Verfahren in Bezug auf die Tiere sollten durch lokale Institution Tierpflege-und Ethik-Kommission, mit einer Anstrengung, um Schmerzen und Beschwerden durch die Operation zu minimieren genehmigt werden.
1. Vorbereitung
- Wählen 8-12 Wochen alten männlichen C57BL / 6 Mäusen mit einem Körpergewicht von ca. 25 g für eine Operation.
- Betäuben die Tiere durch intraperitoneale Injektion eines Cocktails, die sowohl Xylazin (5 mg / kg) und Ketamin (40 mg / kg).
- Rasieren Sie die Knie mit Rasierer, dann chirurgisch drapieren das Tier sterilisieren und die Operationsstelle mit Betadine und Alkohol (3x) und decken die Augen mit der Maus Salbe.
2. Chirurgische Verfahren
- Machen Sie eine 1 cm medial Längs para-Patella-Inzision Kniegelenk aus.
- Öffnen Sie vorsichtig das Kniegelenk durch seitliche Luxation der Kniescheibe und Kniescheibenbandes.
- Schneiden Sie das Kniegelenk Kapsel längsdurch den medialen Kniescheiben para-Schnitt im Schritt 2.1.
- Dissect Knie Gelenkkapsel mit einer Pinzette.
- Nimm den distalen Teil des Hinterpfote mit der linken Hand und führen seitliche Verschiebung der Kniescheibe und Kniescheibenbandes mit einer Pinzette. Halten Sie die Hinterpfote vorsichtig und stellen Sie sicher, Trauma in der Pfote zu vermeiden. Je besser die Gelenkkapsel wird seziert, desto weniger Kraft erforderlich, um die Verschiebung zu machen.
- Tropfen steriler Salz auf der Oberfläche des Gelenkknorpels im Betrieb Austrocknen Knorpeloberfläche zu vermeiden.
- Messer durch die mediale meniskotibialen Band, das mediale Meniskus zum Tibiaplateau verankert. Nicht zu verletzen, den Knorpel unter der medialen Meniskus.
- Identifizieren Sie die Innenmeniskus, der zwischen medialen Kondylus des Oberschenkelknochens und des medialen Plateau der Tibia lokalisiert.
- Identifizieren Sie die meniskotibialen Band, das mit Eminentia intercondylaris der Tibia lateralen Seite des medialen Meniskus verbindet.
- Halten Sie die hallond Pfote sanft mit der Hand, und schneiden durch die mediale meniskotibialen Bänder vorsichtig mit einem Skalpell Nr. 10. Achten Sie darauf, nicht zu verletzen bewirken, Knorpel und andere Bänder des Gelenkknorpels. In vielen Fällen muss die Abdeckung Fettpolster zur Seite gezogen werden, jedoch nicht, um das Band zu identifizieren entfernt werden.
- Schließen Sie das Kniegelenk Kapsel mit einem 6:0-resorbierbares Nahtmaterial.
- Schließen Sie die Haut mit 6-0 Seidenfaden.
3. Postoperative Pflege
- Einen Tropfen 0,25% Bupivacain in der Operationsstelle jeder Maus, um postoperative Schmerzen zu minimieren.
- Lassen Sie die betrieben Mäusen frei, Wasser und Nahrung zu erhalten.
4. Die histologische Bewertung der chirurgischen DMM Modell
- Opfere die Mäuse zu den angegebenen Zeitpunkten (zB 4 Wochen, 8 Wochen und 12 Wochen. Hier zeigten wir Ergebnisse von 8 Wochen Vertreter) nach der Operation.
- Die gesamte Kniegelenk fixiert, entkalkt, embevon Paraffin dded und dann seriell auf 5 um Intervall geschnitten.
- Schneiden Sie die ganze Hinterbeine mit der Nr. 10 Klingen.
- Präparieren Sie die Haut und die Muskeln der Hinterbeine vorsichtig, und fixieren Sie die Proben mit 4% PFA für 3 Tage in der RT.
- Entfernen Sie die PFA, und reinigen Sie die Proben mit Wasser. Danach entkalken die Proben in EDTA bei 4 ° C für 2 Wochen.
- Entwässern der Proben in einem Ethanol-Gradienten. Im Einzelnen halten die Proben in 70% Ethanol für 1 Stunde, dann ändern Sie das Ethanol und halten Sie die Proben in einem neuen Satz von 70% Ethanol für O / N. Danach setzen Sie die Proben in 80% und 90% Ethanol daher und halten sie für 1 Stunde, jeweils gefolgt von 100% Ethanol für O / N.
- Entfernen Sie das Ethanol. Bewahren Sie die Proben in o-Xylol 1 h, und wechseln Sie in einer neuen Reihe von o-Xylol. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
- Betten Sie die Proben in einem Paraffin Form mit der Leica Einbettung Zentrum. Anschließend werden die Proben bei 5 &mgr; m unter Verwendung eines Rotations Mikrotom (Leica RM225 Schnitt5, Deutschland) und anschließend auf Glasobjektträgern gesammelt.
- Serien Sagittalschnitte werden für jede Probe überspannt einen Bereich von der Mitte der lateralen Kondylus an der Mitte des medialen Kondylus geschnitten.
- Safranin-O-Färbung durchgeführt wird, gefolgt von Ritzen und statistische Analysen durch OARSI Scoring-System 25, wie vorher beschrieben.
- Zunächst entparaffinieren Folien in o-Xylol, und Hydrat sie in einem Ethanol-Gradienten zu destilliertem Wasser. Danach werden die Folien durch Weigert Eisenhämatoxylin Lösung, 0,05% Fast Green (FCF) Lösung, 1% Essigsäure-Lösung und 0,1% Safranin O Lösung gefärbt. Montieren Sie die Folien mit harzigen Medium.
- Ergebnis der Safranin O gefärbten Objektträger, basierend auf Verlust von Proteoglykan (rote Farbe) im Knorpel und den Prozentsatz der Zerstörung im Knorpelstruktur, tun statistischen Analyse für die histologische Score.
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Representative Results
DMM Modell wurde erfolgreich an Mäusen etabliert und Mangel an PGRN übertrieben chirurgisch-induzierten OA Entwicklung.
Mäuse - Sham und DMM-Operationen (Abbildung 1) wurden in WT-und PGRN / durchgeführt. 8 Wochen nach der Operation wurden die Mäuse getötet, und Safranin-O-Färbung wurde in den Kniegelenken von Abschnitten durchgeführt wird, gefolgt von einer statistischen Analyse der Arthritis-Score auf Basis der Histologie. Wie in 2A gezeigt, gab es keinen offensichtlichen Degeneration von Knorpel in beiden Genotypen in Scheinoperation Gruppen auf Safranin-O-Färbung, die die ähnlichen Ausgangsbedingungen (obere Felder) impliziert. 8 Wochen nach DMM-Betrieb (untere Felder) gab es Verlust von Proteoglykan und die Zerstörung der Knorpelstruktur sowohl in WT-und PGRN-/ - Mäusen (rote Pfeile). Sowohl der Verlust von Proteoglycan und Abbau von Knorpel schlagen die erfolgreiche Induktion der OA-Phänotyp. Die Stäbe der Spalten indicated die Variation zwischen intra Gruppenmitglieder folgende DMM Betrieb. Allerdings ist die Bar relativ kurz und PGRN Knockouts angezeigt, einen höheren Verlust von Proteoglykan und die Knorpelstruktur wurde stärker im Vergleich zum Wildtyp Rasse zerstört. Darüber hinaus wurde die statistische Analyse für die Knorpel Punktzahl wie zuvor beschrieben 25 durchgeführt und Knorpel-Score war signifikant höher in PGRN Knockouts als die WT-Gruppe. Unsere Ergebnisse zeigen, dass ein Verlust von PGRN Folge schwerer OA Phänotyp.
Fig. 1 ist. Chirurgische Verfahren zur DMM Induktion. ein. Eine mediale para-Patella-Schnitt in der Haut des Kniegelenks gemacht. b. Exposition von Kniegelenk Leerzeichen nach seitlichen Verschiebung der Gelenkkapsel. c. Inner struktur des Kniegelenks. Blauer Pfeil zeigt medialen Meniskus. Gelber Pfeil zeigt meniskotibialen Band. D. Innenmeniskus wird destabilisiert. Blauer Pfeil zeigt die Innenmeniskus, die von ursprünglichen Standort verschoben wird. Gelber Pfeil zeigt Rest Teil der Band, das meniskotibialen worden. D seziert hat. Die Gelenkkapsel wird geschlossen. F. Die Haut wird geschlossen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
2. Repräsentative Bilder der Histologie und statistische Analyse für Gäste von Osteoarthritis A. Repräsentative histologische Bilder von WT und PGRN-/ -. Mäusen 8 Wochen nach Scheinoperation oder DMMVon Safranin-O-Färbung analysiert. Rote Pfeile zeigen Knorpelzerstörung. Verlust der roten Farbe in Knorpel bedeutet Verlust von Proteoglykan. Maßstabsbalken 100 um B. Statistische Analyse für Gäste der Arthrose in beiden PGRN-/ -.. Und WT-Mäusen Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
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Discussion
Es wird berichtet, dass der Stamm von Mäusen ist sehr wichtig für DMM Modell Induktion, als verschiedene Stämme von Mäusen haben unterschiedliche Schwere der OA nach DMM, mit höchstem Niveau in der 129/SvEv Stamm, gefolgt von C57BL6, 129/SvInJ und dann FVB / n 26. Mäuse, die wir in der vorliegenden Studie eingesetzt, die relativ anfällig für DMM sind - Ein großer Teil der Transgene in C57BL/6-Mäuse, wie PGRN-/ etabliert. Wenn das Transgen auf Stamm unempfindlich wie FVB / N-Mäusen basiert, ist es jedoch notwendig, diese Mäuse mit empfindlichen Stämmen vor DMM Induktionsrückkreuzung. Das Geschlecht der Mäuse für DMM Induktion verwendet wird, ist auch sehr wichtig, wie Studien haben bereits gezeigt, dass weibliche Mäuse sind weniger empfindlich als 27 männlichen Mäusen. Darüber hinaus, das Alter der Mäuse DMM Betrieb variiert von 8 Wochen bis 12 Wochen alt basierend auf Literatur 29, die auch eine kritische Rolle in der Pathogenese von OA. Daher sollte Mäusen gleichen Alters betätigt, um diesen Effekt zu beseitigen,. Postoperative Schmerzkontrolle erforderlich ist, um die Bewegung der Mäuse nach der Operation zu verbessern. Wie DMM Modell führt zu OA durch Bewegung vermittelt Verschleiß im Knorpel, unzureichende Bewegung als Folge der postoperativen Schmerzen können Inkonsistenz der OA Entwicklung verursachen. Derzeit gibt es eine Diskrepanz über die Bestimmung des DMM darüber, ob oder nicht, um den medialen Meniskus 4,28 entfernen. In unserer vorliegenden Studie haben wir nur medialen Meniskus destabilisiert, aber nicht entfernen. Läsionen in der DMM-Modell wurden hauptsächlich auf dem zentralen Gewicht tragenden Bereich des medialen tibialen Plateau, und die Schwere der Läsionen während des Zeitverlaufs (unveröffentlichte Daten) erhöht, und die Ergebnisse waren konsistent mit früheren Berichten, 5. Darüber hinaus die folgenden OARSI Punktzahl DMM Betrieb war relativ konsistent zwischen verschiedenen Mitgliedern der gleichen genetischen Gruppe.
PGRN spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung und Knorpel Arthritis 14,21. Wirzuvor berichtet, dass PGRN Wechselspiel mit Metalloproteasen ADAMTS-7 und ADAMTS-12, und schützt die Knorpelmatrixproteins COMP 19 vor Abbau. Darüber hinaus ist es gut etabliert, dass TNF-α eine wichtige Rolle bei der Zerstörung des Knorpels 24 spielt. Kürzlich fanden wir, dass PGRN TNF-α bekämpft und gegen Knorpelzerstörung bei entzündlichen Arthritis-Modellen 14 geschützt. In dieser Studie induzierte wir DMM Modell in WT-und PGRN-/ - Mäuse, und wie erwartet, PGRN-/ - Mäuse zeigten übertriebene Progression der OA nach Induktion von DMM, die von mehr schweren Verlust der Proteoglykan in Safranin-O-Färbung angedeutet wurde, und deutlich höher Arthritis Punktzahl basierend auf Histologie (Abbildung 2). Darüber hinaus wurden die Ausdrücke der Abbaumarker dramatisch PGRN-/ erhöht - Gruppe (unveröffentlichte Daten), was auf beschleunigte Progression bei OA Mangel PGRN.
Abschließend unserem Protokoll für die Gründung von DMM Modell sOA uccessfully induzierte Phänotyp in WT-und PGRN-/ - Mäusen, und die Induktion war konsistent und Reproduktions. Die erfolgreiche Generation der DMM-Modell in Mäusen C57/B6 ein nützliches Instrument für die Beurteilung therapeutischer Wirkstoffe und OA Genen für OA in der Zukunft. In der aktuellen Studie dokumentiert das Ergebnis der DMM Modell eine schützende Rolle von PGRN in OA Entwicklung.
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Disclosures
Wir erklären, dass wir hier keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH Forschungsstipendien R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210 und eine Krankheit gezielte Forschungsstipendium Rheumatologie Forschungsgemeinschaft (CJ Liu) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| No. 10 Surgical blades | Feather | 25-2976#10 | |
| 6-0 suture | Applied Dental | WG-N53133 |
References
- Herndon, J. H., Davidson, S. M., Apazidis, A. Recent socioeconomic trends in orthopaedic practice. J. Bone Joint Surg. Am. 83, 1097-1105 (2001).
- Johnson, K., et al. A stem cell-based approach to cartilage repair. Science. 336, 717-721 (2012).
- Yang, S., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha is a catabolic regulator of osteoarthritic cartilage destruction. Nat. Med. 16, 687-693 (2010).
- Glasson, S. S., et al. Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis. Nature. 434, 644-648 (2005).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthr. Cart. 15, 1061-1069 (2007).
- Chia, S. L., et al. Fibroblast growth factor 2 is an intrinsic chondroprotective agent that suppresses ADAMTS-5 and delays cartilage degradation in murine osteoarthritis. Arthritis Rheum. 60, 2019-2027 (2009).
- Miller, R. E., et al. CCR2 chemokine receptor signaling mediates pain in experimental osteoarthritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20602-20607 (2012).
- Wang, Q., et al. Identification of a central role for complement in osteoarthritis. Nat. Med. 17, 1674-1679 (2011).
- He, Z., Ong, C. H., Halper, J., Bateman, A. Progranulin is a mediator of the wound response. Nat. Med. 9, 225-229 (2003).
- Bateman, A., Bennett, H. P. The granulin gene family: from cancer to dementia. Bioessays. 31, 1245-1254 (2009).
- Kessenbrock, K., et al. Proteinase 3 and neutrophil elastase enhance inflammation in mice by inactivating antiinflammatoryprogranulin. J. Clin. Invest. 118, 2438-2447 (2008).
- Yin, F., et al. Exaggerated inflammation, impaired host defense, and neuropathology in progranulin-deficient mice. J. Exp. Med. 207, 117-128 (2010).
- Liu, C. J. Progranulin: A promising therapeutic target for rheumatoid arthritis. FEBS Lett. , (2011).
- Tang, W., et al. The growth factor progranulin binds to TNF receptors and is therapeutic against inflammatory arthritis in mice. Science. 332, 478-484 (2011).
- Zhu, J., et al. Conversion of proepithelin to epithelins: roles of SLPI and elastase in host defense and wound repair. Cell. 111, 867-878 (2002).
- Baker, M., et al. Mutations in progranulin cause tau-negative frontotemporal dementia linked to chromosome 17. Nature. 442, 916-919 (2006).
- Cruts, M., et al. Null mutations in progranulin cause ubiquitin-positive frontotemporal dementia linked to chromosome 17q21. Nature. 442, 920-924 (2006).
- Wils, H., et al. Cellular ageing, increased mortality and FTLD-TDP-associated neuropathology in progranulin knockout mice. J. Pathol. , (2012).
- Guo, F., et al. Granulin-epithelin precursor binds directly to ADAMTS-7 and ADAMTS-12 and inhibits their degradation of cartilage oligomeric matrix protein. Arthritis Rheum. 62, 2023-2036 (2010).
- Xu, K., et al. Cartilage oligomeric matrix protein associates with granulin-epithelin precursor (GEP) and potentiates GEP-stimulated chondrocyte proliferation. J. Biol. Chem. 282, 11347-11355 (2007).
- Bai, X. H., et al. ADAMTS-7, a direct target of PTHrP, adversely regulates endochondral bone growth by associating with and inactivating GEP growth factor. Mol. Cell. Biol. 29, 4201-4219 (2009).
- Feng, J. Q., et al. Granulinepithelin precursor: a bone morphogenic protein 2-inducible growth factor that activates Erk1/2 signaling and JunB transcription factor in chondrogenesis. FASEB J. 24, 1879-1892 (2010).
- Liu, C. J., Bosch, X. Progranulin: A growth factor, a novel TNFR ligand and a drug target. Pharmacol. Therap. 133, 124-132 (2012).
- Wu, H., Siegel, R. M. Progranulin Resolves Inflammation. Science. 332, 427-428 (2011).
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Den Berg, W. B. V. an, Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthr. Cart. 18, 17-23 (2010).
- Glasson, S. S. In vivo osteoarthritis target validation utilizing genetically-modified mice. Curr. Drug Targets. 8, 367-376 (2007).
- Ma, H. L. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthr. Cart. 15, 695-700 (2007).
- Lin, A. C., et al. Modulating hedgehog signaling can attenuate the severity of osteoarthritis. Nat. Med. 15, 1421-1425 (2009).
- Malfait, A. M., et al. ADAMTS-5 deficient mice do not develop mechanical allodynia associated with osteoarthritis following medial meniscal destabilization. Osteoarthr. Cart. 18, 572-580 (2010).
