Summary
हम चूहों में औसत दर्जे का meniscus (डी एम एम) मॉडल, पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस (OA) अनुसंधान के लिए एक प्रभावी उपकरण की अस्थिरता के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इसके अलावा, हम progranulin OA के रोगजनन में एक सुरक्षात्मक भूमिका निभाता है, यह दर्शाता है इस मॉडल का उपयोग करके progranulincan अतिरंजना OA के विकास और प्रगति की है कि कमी का प्रदर्शन किया है.
Abstract
औसत दर्जे का meniscus की अस्थिरता (डी एम एम) मॉडल विवो में पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस (OA) के रोगजनन में कई गठिया जुड़े अणुओं के pathophysiological भूमिकाओं के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है. हालांकि, विस्तृत, विशेष रूप से चूहों में इस जटिल मॉडल स्थापित करने के लिए कल्पना प्रोटोकॉल उपलब्ध नहीं है. इस के साथ साथ हम wildtype और progranulin (PGRN) का फायदा उठाया - / - उदाहरण चूहों में डी एम एम मॉडल उत्प्रेरण के लिए एक प्रोटोकॉल, और इस शल्य चिकित्सा द्वारा प्रेरित मॉडल की स्थापना के बाद OA की तुलना में शुरुआत को पेश करने के रूप में चूहों. चूहों पर किया आपरेशन सिर्फ menisco-tibial बंधन में कटौती और औसत दर्जे का meniscus की अस्थिरता के कारण जो संयुक्त कैप्सूल, या डी एम एम आपरेशन, जो खोला नकली आपरेशन, या तो थे. ऑस्टियोआर्थराइटिस गंभीरता ऊतकीय परख (जैसे सैफरैनीन हे धुंधला), OA जुड़े जीन की अभिव्यक्ति, उपास्थि बाह्य मैट्रिक्स अणुओं की गिरावट, और osteophyte फार्म का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया थासमझना. चूहों, और इस शल्य चिकित्सा द्वारा प्रेरित मॉडल में एक और अधिक गंभीर OA phenotype के लिए नेतृत्व PGNR वृद्धि कारक की हानि - डी एम एम आपरेशन सफलतापूर्वक wildtype और PGRN-/ दोनों में OA दीक्षा और प्रगति प्रेरित किया.
Introduction
भी अपक्षयी गठिया के रूप में जाना जाता है पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस (OA), दुनिया की आबादी का 15% को प्रभावित करता है और संयुक्त राज्य अमेरिका के भीतर 46000000 से अधिक लोगों को, और synovitis, उपास्थि अध: पतन, और osteophyte गठन 1 की विशेषता है. यह आनुवंशिक चयापचय, biomechanical और जैव रासायनिक कारकों की एक जटिल परस्पर क्रिया का परिणाम हो सकता है. OA के अंतर्निहित तंत्र वैज्ञानिक समुदाय से बचने के लिए जारी है. OA 2,3 के रोगजनन नकल कर सकते हैं जो कई पशु मॉडल ऐसे हैं. यह क्योंकि विभिन्न आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की उपलब्धता और प्रयोग की लागत प्रभावशीलता दोनों के चूहों में पशु मॉडल की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण है. प्रयोगात्मक OA मॉडल के विभिन्न प्रकार के अलावा, औसत दर्जे का meniscus (डी एम एम) मॉडल की शल्य चिकित्सा द्वारा प्रेरित अस्थिरता की वजह से अपनी अच्छी reproducibility और OA विकास के दौरान एक अपेक्षाकृत धीमी प्रगति की एक अच्छी तरह से स्वीकार OA मॉडल है. इन विशेषताओं के दोनों हैविभिन्न उपचार या transgenes 3-8 में OA प्रगति का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण हो गया. हालांकि, शल्य OA मॉडल की स्थिरता सर्जरी के दौरान और एक परिणाम के रूप में विभिन्न कारकों से प्रभावित होता है, शल्य माउस मॉडल के आवेदन सीमित है.
Progranulin (PGRN) विभिन्न कोशिकाओं में व्यक्त एक बहुआयामी विकास कारक है. यह PGRN ऐसे घाव भरने 9, tumorigenesis 10, और सूजन 11-15 के रूप में विभिन्न शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि जाना जाता है. अध्ययनों से यह भी PGRN की कमी मनुष्यों और चूहों 16-18 दोनों में तंत्रिका तंत्र के अपक्षयी रोग हो सकता है कि दिखाया गया है. यह PGRN मानव जोड़ कार्टिलेज में व्यक्त किया है कि जाना जाता है, और उसका स्तर काफी OA और रुमेटी गठिया 19 के साथ रोगियों की उपास्थि में ऊपर उठाया है. इसके अलावा, PGRN भी उपास्थिकोशिका प्रसार 20, भेदभाव और endochondral में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता हैविकास 21,22 दौरान विकास प्लेट की हड्डी बन जाना. हाल ही में, हम PGRN TNF रिसेप्टर्स के बंधन के माध्यम से TNF-α नाराजगी और भड़काऊ गठिया मॉडल 13,14,23,24 में एक विरोधी भड़काऊ समारोह प्रदर्शन की सूचना दी. हालांकि, OA में PGRN की भूमिका, विशेष रूप से vivo में, एक पहेली की बात है. चूहों - साथ साथ, हम एक शल्य डी एम एम मॉडल प्रेरित, और गुम्मट और PGRN-/ में डी एम एम मॉडल की स्थापना के माध्यम से OA विकास में PGRN की भूमिका की जांच करने के लिए प्रक्रिया मौजूद है.
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Protocol
जानवरों से संबंधित सर्जिकल प्रक्रियाओं के सभी दर्द और सर्जरी के कारण परेशानी को कम करने के लिए किए गए प्रयास के साथ स्थानीय संस्था के पशु की देखभाल और आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए.
1. तैयारी
- शल्य चिकित्सा के लिए लगभग 25 ग्राम की एक शरीर के वजन के साथ 8-12 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL 6 / चूहों का चयन करें.
- Xylazine (5 मिलीग्राम / किग्रा) और ketamine (40 मिलीग्राम / किग्रा) दोनों युक्त कॉकटेल के intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से पशुओं anesthetize.
- छुरा के साथ घुटने दाढ़ी, तो शल्य चिकित्सा पशु कपड़ा और betadine और शराब (3x) के साथ शल्य साइट बाँझ और मरहम साथ माउस आँखों को कवर किया.
2. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया
- संयुक्त घुटने का पर्दाफाश करने के लिए एक 1 सेमी अनुदैर्ध्य औसत दर्जे का पैरा पटेलर चीरा.
- वुटने की चक्की और patellar बंधन के पार्श्व अव्यवस्था के माध्यम से धीरे घुटने संयुक्त खोलें.
- अनुलंबीय घुटने संयुक्त कैप्सूल कट2.1 चरण में औसत दर्जे का पैरा पटेलर चीरा के माध्यम से.
- संदंश के साथ संयुक्त घुटने कैप्सूल काटना.
- बाएँ हाथ के साथ हिंद पंजा के बाहर का हिस्सा ले लो, और संदंश के साथ वुटने की चक्की और patellar बंधन के पार्श्व अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं. धीरे हिंद पंजा पकड़ और पंजा में आघात से बचने के लिए सुनिश्चित करें. संयुक्त कैप्सूल विच्छेदित है बेहतर, कम बल अव्यवस्था बनाने के लिए आवश्यक हो जाएगा.
- उपास्थि सतह से बाहर सुखाने से बचने के लिए ऑपरेशन के दौरान जोड़ कार्टिलेज की सतह पर बाँझ खारा ड्रिप.
- Tibial पठार को औसत दर्जे का meniscus एंकर जो औसत दर्जे का meniscotibial बंधन के माध्यम से कट. औसत दर्जे का meniscus के नीचे उपास्थि घायल बचें.
- फीमर की औसत दर्जे का कंद और टिबिया के औसत दर्जे का पठार के बीच रेखांकित जो औसत दर्जे का meniscus पहचानें.
- टिबिया के intercondylar श्रेष्ठता के साथ औसत दर्जे का meniscus के पार्श्व पक्ष जोड़ता है जो meniscotibial बंध पहचानें.
- हाय पकड़ोND हाथ से धीरे पंजा, और एक नहीं 10 सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करके ध्यान से औसत दर्जे का meniscotibial बंधन के माध्यम से काटा. उपास्थि और अन्य स्नायुबंधन जोड़ को घायल पैदा करने के लिए नहीं सुनिश्चित करें. कई मामलों में, कवर वसा पैड ओर करने के लिए खींच लिया हो लेकिन बंध की पहचान करने के क्रम में हटाये जाने की जरूरत नहीं है.
- एक 6-0 absorbable सीवन के साथ संयुक्त घुटने कैप्सूल बंद करें.
- 6-0 रेशम सीवन के साथ त्वचा को बंद करें.
3. पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल
- पोस्ट ऑपरेटिव दर्द को कम करने के लिए प्रत्येक माउस की शल्य साइट में 0.25% bupivacaine की एक बूंद लागू करें.
- पानी और भोजन पाने के लिए स्वतंत्र रूप से संचालित चूहों छोड़ दें.
4. सर्जिकल डी एम एम मॉडल के histological स्कोरिंग
- संकेत समय बिंदुओं पर चूहों बलिदान सर्जरी के बाद (उदाहरण के लिए 4 सप्ताह, 8 सप्ताह, और 12 हफ्तों. यहाँ हम प्रतिनिधि के रूप में 8 सप्ताह के परिणामों से पता चला है).
- पूरे घुटने के जोड़ों, decalcified, embe तय कर रहे हैंआयल द्वारा dded और फिर 5 माइक्रोन अंतराल पर क्रमानुसार sectioned.
- सं 10 ब्लेड के साथ पूरे हिंद अंग काट दिया.
- ध्यान से हिंद अंग की त्वचा और मांसपेशियों को काटना, और आरटी में 3 दिनों के लिए 4% पीएफए के साथ नमूनों को ठीक.
- पीएफए निकालें, और पानी के नमूनों के साथ साफ. बाद में, 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर EDTA में नमूने अम्लो व्दारा कैल्सियम.
- एक इथेनॉल ढाल में नमूने निर्जलीकरण. विस्तार में, तो इथेनॉल बदलने और ओ / एन के लिए 70% इथेनॉल का एक नया सेट में नमूने रखने के लिए, 1 घंटे के लिए 70% इथेनॉल में नमूने रखना बाद में, 80% नमूनों में डाल दिया है और 90% इथेनॉल के फलस्वरूप, और ओ / एन के लिए 100% इथेनॉल के द्वारा पीछा किया, क्रमशः, 1 घंटे के लिए उन्हें रखना
- इथेनॉल निकालें. 1 घंटे के लिए oxylene में नमूने रखें, और oxylene का एक नया सेट करने के लिए बदल जाते हैं. इस कदम 3x दोहराएँ.
- Leica embedding केंद्र का उपयोग कर एक आयल मोल्ड में नमूने शामिल करें. बाद में, नमूने एक रोटरी सूक्ष्म (Leica RM225 का उपयोग 5 माइक्रोन पर sectioned हैं5, जर्मनी) और फिर गिलास स्लाइड पर एकत्र की.
- सीरियल बाण के समान वर्गों औसत दर्जे का कंद के केंद्र के लिए पार्श्व स्थूलक के केंद्र से एक क्षेत्र में फैले प्रत्येक नमूने के लिए काट रहे हैं.
- सैफरैनीन हे धुंधला, प्रदर्शन किया जैसा कि पहले 25 के रूप में वर्णित OARSI स्कोरिंग प्रणाली के माध्यम से स्कोरिंग और सांख्यिकीय विश्लेषण के बाद है.
- सबसे पहले, oxylene में स्लाइड्स deparaffinize, और आसुत जल के लिए एक इथेनॉल ढाल में उन्हें हाइड्रेट. इसके बाद, स्लाइड Weigert के आयरन Hematoxylin समाधान, 0.05% फास्ट ग्रीन (FCF) समाधान है, 1% एसिटिक एसिड समाधान, और 0.1% सैफरैनीन ओ समाधान के माध्यम से दाग रहे हैं. राल माध्यम का उपयोग कर स्लाइड माउंट.
- ऊतकीय स्कोर के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं, उपास्थि और उपास्थि संरचना में विनाश के प्रतिशत में proteoglycan (लाल रंग) के नुकसान पर आधारित सैफरैनीन हे दाग स्लाइड स्कोर.
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Representative Results
डी एम एम मॉडल को सफलतापूर्वक चूहों में स्थापित है, और PGRN की कमी शल्य चिकित्सा द्वारा प्रेरित OA विकास अतिरंजित था.
चूहों - शाम और डी एम एम आपरेशन (चित्रा 1) WT और PGRN-/ में प्रदर्शन किया गया. 8 सप्ताह के आपरेशन के बाद, चूहों बलिदान थे, और सैफरैनीन हे धुंधला घुटने के जोड़ों से वर्गों पर प्रदर्शन किया गया था, ऊतक विज्ञान पर आधारित गठिया स्कोर का सांख्यिकीय विश्लेषण के बाद. चित्रा 2A में दिखाया गया है, इसी तरह की आधारभूत शर्तों (ऊपरी पैनल) गर्भित जो सैफरैनीन हे धुंधला, के आधार पर नकली आपरेशन समूहों में दोनों जीनोटाइप में उपास्थि की कोई स्पष्ट अध: पतन नहीं था. चूहों (लाल तीर) - 8 सप्ताह डी एम एम आपरेशन (कम पैनल) के बाद, गुम्मट और PGRN-/ दोनों में proteoglycan और उपास्थि संरचना के विनाश का नुकसान हुआ था. दोनों proteoglycan और उपास्थि की गिरावट के नुकसान OA phenotype के सफल प्रेरण सुझाव देते हैं. indicat स्तंभों की सलाखोंडी एम एम आपरेशन के बाद इंट्रा समूह के सदस्यों के बीच भिन्नता एड. हालांकि, बार अपेक्षाकृत कम है, और PGRN knockouts एक उच्च proteoglycan के नुकसान और उपास्थि संरचना अधिक गंभीर रूप से जंगली प्रकार नस्ल की तुलना में नष्ट हो गया था प्रदर्शन किया. इसके अलावा, उपास्थि स्कोर के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण वर्णित पहले 25 के रूप में प्रदर्शन किया, और उपास्थि स्कोर गुम्मट समूह से PGRN knockouts में काफी अधिक था. हमारे परिणाम PGRN का नुकसान अधिक गंभीर OA phenotype में कहा कि परिणाम का प्रदर्शन किया.
चित्रा 1. डी एम एम शामिल होने के लिए शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया. घुटने संयुक्त अंतरिक्ष के एक. एक औसत दर्जे का पैरा पटेलर चीरा संयुक्त घुटने की त्वचा में किया जाता है. बी. एक्सपोजर संयुक्त कैप्सूल के पार्श्व अव्यवस्था के बाद. सी. इनर हैसंयुक्त घुटने की tructure. नीले तीर औसत दर्जे का meniscus इंगित करता है. पीले तीर meniscotibial बंध. डी से पता चलता है. औसत दर्जे का meniscus अस्थिर है. नीले तीर मूल साइट से उखड़ गई है, जो औसत दर्जे का meniscus इंगित करता है. पीले तीर. डी विच्छेदित कर दिया गया है जो meniscotibial बंध के अवशिष्ट भाग से पता चलता है. संयुक्त कैप्सूल. च बंद हो गया है. त्वचा बंद कर दिया है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के स्कोर के लिए ऊतक विज्ञान और सांख्यिकीय विश्लेषण के प्रतिनिधि चित्रों WT और PGRN-/ ए प्रतिनिधि ऊतकीय चित्र -. चूहों 8 सप्ताह के नकली आपरेशन या डी एम एम निम्नलिखित, सैफरैनीन हे धुंधला द्वारा assayed. लाल तीर उपास्थि विनाश का संकेत मिलता है. उपास्थि में लाल रंग के नुकसान proteoglycan के नुकसान निकलता है. स्केल बार, दोनों PGRN-/ में पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के स्कोर के लिए 100 माइक्रोन बी सांख्यिकीय विश्लेषण -.. और WT चूहों बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
यह चूहों का तनाव डी एम एम मॉडल शामिल होने के लिए, चूहों के रूप में अलग अलग उपभेदों / फिर C57BL6, 129/SvInJ और FVB द्वारा पीछा किया, 129/SvEv तनाव में उच्चतम स्तर के साथ, डी एम एम के बाद OA की गंभीरता को बदलती है बहुत महत्वपूर्ण है कि सूचना दी है n 26. डी एम एम के लिए अपेक्षाकृत जल्दी हो जाता है जो हम वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल चूहों, - transgenes का एक बड़ा हिस्सा ऐसे PGRN-/ रूप C57BL6 चूहों में स्थापित कर रहे हैं. Transgene ऐसे FVB / एन चूहों के रूप में असंवेदनशील तनाव पर आधारित है हालांकि, अगर यह डी एम एम प्रेरण पहले अतिसंवेदनशील उपभेदों के साथ इन चूहों backcross करने के लिए आवश्यक है. पढ़ाई पहले से ही मादा चूहों नर चूहों 27 से भी कम संवेदनशील होते हैं कि पता चला है के रूप में डी एम एम शामिल होने के लिए इस्तेमाल चूहों का लिंग भी बहुत महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, डी एम एम आपरेशन के लिए चूहों की उम्र 8 सप्ताह पुरानी से भी OA के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जो साहित्य 29 के आधार पर पुराने 12 सप्ताह तक होती है. इसलिए, एक ही उम्र के चूहों में इस प्रभाव को खत्म करने के लिए संचालित किया जाना चाहिए. पोस्ट ऑपरेटिव दर्द नियंत्रण सर्जरी के बाद चूहों की आवाजाही बढ़ाने के लिए आवश्यक है. डी एम एम मॉडल पोस्ट ऑपरेटिव दर्द का एक परिणाम के रूप में उपास्थि, अपर्याप्त आंदोलन में आंदोलन की मध्यस्थता पहनते हैं और आंसू के माध्यम से OA के लिए सुराग के रूप में OA विकास की विसंगति पैदा कर सकता है. वर्तमान में औसत दर्जे का meniscus 4,28 दूर करने के लिए किया जाए या नहीं के बारे में डी एम एम की परिभाषा के विषय में एक विसंगति है. हमारे अध्ययन में मौजूद है, हम केवल औसत दर्जे का meniscus अस्थिर लेकिन इसे दूर नहीं किया. डी एम एम मॉडल में घावों मुख्य रूप से औसत दर्जे का tibial पठार के मध्य वजन असर क्षेत्र पर स्थित थे, और घावों की गंभीरता को समय कोर्स (अप्रकाशित डेटा) के दौरान वृद्धि हुई है, और परिणाम पिछली रिपोर्टों 5 के साथ संगत कर रहे थे. इसके अलावा, डी एम एम आपरेशन के बाद OARSI स्कोर ही आनुवंशिक समूह के विभिन्न सदस्यों के बीच अपेक्षाकृत अनुरूप था.
PGRN उपास्थि विकास और गठिया 14,21 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. हमजैसा कि पहले बताया कि metalloproteases ADAMTS-7 और ADAMTS-12, और गिरावट 19 से उपास्थि मैट्रिक्स प्रोटीन के COMP की रक्षा करता है के साथ PGRN interplays. इसके अलावा, यह TNF-α उपास्थि विनाश 24 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि अच्छी तरह से स्थापित है. हाल ही में, हम PGRN TNF-α नाराजगी और भड़काऊ गठिया मॉडल 14 में उपास्थि विनाश के खिलाफ संरक्षित पाया. इस अध्ययन में, हम WT और PGRN-/ में डी एम एम मॉडल प्रेरित - चूहों, और उम्मीद के रूप में, PGRN-/ - चूहों सैफरैनीन हे धुंधला में proteoglycan के और अधिक गंभीर नुकसान से संकेत दिया गया था जो डी एम एम की प्रेरण निम्नलिखित OA के अतिरंजित प्रगति का प्रदर्शन और ऊतक विज्ञान पर आधारित काफी अधिक गठिया स्कोर (चित्रा 2). PGRN की कमी में त्वरित OA प्रगति, सुझाव समूह (अप्रकाशित डेटा) - इसके अलावा, catabolic मार्करों की अभिव्यक्ति में नाटकीय रूप से PGRN-/ में बुलंद थे.
अंत में, डी एम एम एस मॉडल की स्थापना के लिए हमारे प्रोटोकॉलuccessfully प्रेरित OA WT और PGRN-/ में फेनोटाइप - चूहों, और प्रेरण सुसंगत और प्रजनन था. C57/B6 चूहों में डी एम एम मॉडल का सफल पीढ़ी भविष्य में OA के लिए चिकित्सीय एजेंट और OA संबंधित जीन के मूल्यांकन के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है. वर्तमान अध्ययन में, डी एम एम मॉडल का परिणाम OA विकास में PGRN की एक सुरक्षात्मक भूमिका दस्तावेजों.
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Disclosures
हम साथ साथ हम ब्याज की कोई संघर्ष है कि घोषणा.
Acknowledgments
इस काम एनआईएच अनुसंधान अनुदान R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210, और (सीजे लियू) संधिवातीयशास्त्र रिसर्च फाउंडेशन से एक रोग लक्षित अनुसंधान अनुदान द्वारा आंशिक रूप से समर्थन किया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| No. 10 Surgical blades | Feather | 25-2976#10 | |
| 6-0 suture | Applied Dental | WG-N53133 |
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