Summary
Vi beskriver ett protokoll för en destabilisering av den mediala menisken (DMM) modell hos möss, ett effektivt verktyg för artros (OA) forskning. Dessutom har vi visat att brist på progranulincan driva OA utvecklingen och fortgången med hjälp av denna modell, vilket indikerar att progranulin spelar en skyddande roll i patogenesen av OA.
Abstract
Destabilisering av mediala menisken (DMM) modell är ett viktigt verktyg för att studera patofysiologiska roller många artrit associerade molekyler i patogenesen av osteoartrit (OA) in vivo. Men den detaljerade, särskilt den visualiserade protokoll för upprättande av denna komplicerade modell i möss är inte tillgänglig. Häri tog vi nytta av vildtyp och progranulin (PGRN) - / - möss som exempel att införa ett protokoll för att framkalla DMM modell hos möss, och jämförde uppkomsten av OA efter inrättandet av denna kirurgiskt inducerad modell. De operationer som utförs på möss var antingen skenoperation, som just öppnat ledkapsel eller DMM drift, vilket skär menisk-tibia ligament och orsakade destabilisering av mediala menisken. Artros svårighetsgrad utvärderades med hjälp av histologiska analys (t.ex. Safranin O färgning), uttryck av OA-associerade gener, nedbrytning av brosk cellulära matrixmolekyler, och osteophyte formuläration. DMM operation framgångsrikt inducerad OA initiering och progression i både vildtyp och PGRN-/ - möss, och förlust av PGNR tillväxtfaktor lett till en mer allvarlig OA fenotyp i detta kirurgiskt inducerad modell.
Introduction
Artros (OA), även kallad degenerativ artrit, drabbar 15% av världens befolkning och mer än 46 miljoner människor i USA, och kännetecknas av synovit, brosk degeneration, och osteofytbildning 1. Det kan vara ett resultat av ett komplext samspel mellan genetiska, metaboliska, biomekaniska och biokemiska faktorer. De bakomliggande mekanismerna för OA att undgå det vetenskapliga samfundet. Det finns för närvarande ett stort antal djurmodeller som kan efterlikna patogenesen av OA 2,3. Det är viktigt att skapa djurmodeller i möss på grund av såväl tillgången på olika genetiskt modifierade möss och kostnadseffektiviteten för experimenterande. Bland de olika typer av experimentella OA-modeller, är det kirurgiskt inducerad destabilisering av mediala menisken (DMM) modell en väl accepterad OA-modell på grund av dess goda reproducerbarhet och en relativt långsam progression under OA utveckling. Båda dessa attribut harvarit avgörande för utvärderingen av OA progression i olika behandlingar eller transgener 3-8. Emellertid är konsistensen av kirurgisk OA modell påverkas av olika faktorer under operationen och som ett resultat, är tillämpningen av kirurgisk musmodell begränsas.
Progranulin (PGRN) är en multifunktionell tillväxtfaktor uttrycks i olika celler. Det är känt att PGRN spelar en kritisk roll vid olika fysiologiska och sjukdomsprocesser såsom sårläkning 9, tumörgenes 10 och inflammation 11-15. Studier visar också att otillräckliga PGRN kan orsaka degenerativa sjukdomar i nervsystemet hos både människor och möss 16-18. Det är känt att PGRN uttrycks i humant ledbrosk, och dess nivå är signifikant förhöjda i brosk hos patienter med artros och reumatoid artrit 19. Dessutom PGRN spelar också en avgörande roll i chondrocyte proliferation 20, differentiering och endokondralförbening av tillväxtplattan under utveckling 21,22. Nyligen rapporterade vi att PGRN antagoniserade TNF-α genom bindning till TNF-receptorer och uppvisar en anti-inflammatorisk funktion i inflammatoriska artritmodeller 13,14,23,24. Emellertid, i synnerhet in vivo, förblir roll PGRN i OA att vara en gåta. Häri presenterar vi proceduren för att framkalla en kirurgisk DMM modell, och undersöka vilken roll PGRN i OA utveckling genom upprättandet DMM modell i WT och PGRN-/ - möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla kirurgiska ingrepp för djuren bör godkännas av den lokala institutionens Animal Care och etikkommittén, med en ansträngning gjorts för att minimera smärta och obehag av operationen.
1. Framställning
- Välj 8-12 veckor gammal hane C57BL / 6 möss med en kroppsvikt på ca 25 g för operation.
- Söva djuren genom intraperitoneal injektion av en cocktail innehållande både xylazin (5 mg / kg) och ketamin (40 mg / kg).
- Raka knäet med rakhyvlar, då kirurgiskt drapera djuret och sterilisera operationsområdet med Betadine och alkohol (3x) och täcka mus ögonen med salva.
2. Kirurgiska processen
- Gör en 1 cm longitudinell mediala para-patellar snitt för att exponera knäleden.
- Öppna knäleden försiktigt genom lateral förskjutning av knäskålen och patellar ligament.
- Skär knäleden kapseln längsledgenom den mediala para-patellar snitt i steg 2,1.
- Dissekera knäleden kapsel med pincett.
- Ta den distala delen av baktass med vänster hand, och utföra sido förskjutning av knäskålen och patellar ligament med pincett. Håll i baktassen försiktigt och se till att undvika trauma i tassen. Ju bättre ledkapseln dissekeras, desto mindre kraft krävs för att göra störningen.
- Droppa steril koksaltlösning på ytan av ledbrosk under drift för att undvika uttorkning av broskytan.
- Skär genom den mediala meniscotibial ligament som förankrar mediala menisken till tibiaplatån. Undvik att skada brosket under den mediala menisken.
- Identifiera den mediala menisken som lokaliserar mellan mediala kondyl av lårbenet och mediala platå av skenbenet.
- Identifiera meniscotibial ligament som förbinder laterala sidan av mediala menisken med intercondylar överlägsenhet av skenbenet.
- Håll hind tass försiktigt med handen, och skär igenom det mediala meniscotibial ligamentet försiktigt med hjälp av en nr 10 kirurgiskt blad. Se till att inte orsaka injure ledbrosk och andra ligament. I många fall behöver täcker fettkudden dras åt sidan, men inte tas bort i syfte att identifiera ligamentet.
- Stäng knäleden kapsel med en 6-0 resorberbar sutur.
- Stäng huden med 6-0 silke sutur.
3. Postoperativ vård
- Applicera en droppe av 0,25% bupivakain i operationsområdet på varje mus för att minimera post-operativ smärta.
- Låt drivs möss gratis att få vatten och mat.
4. Histologisk Scoring av Kirurgisk DMM modell
- Offra mössen vid angivna tidpunkter (t.ex. 4 veckor, 8 veckor och 12 veckor. Här visade vi resultat från 8 veckor som representant) efter operationen.
- Hela knäleder är fasta, avkalkat embedded av paraffin och snittades i serie på 5 um intervall.
- Skär hela bakbenen med nr 10 blad.
- Dissekera huden och musklerna i bakbenen noga, och fixera proverna med 4% PFA i 3 dagar i RT.
- Avlägsna PFA, och rengör prover med vatten. Efteråt avkalka proverna i EDTA vid 4 ° C under 2 veckor.
- Torka proven i en etanol-gradient. I detalj, hålla proverna i 70% etanol i 1 timme, sedan ändra etanol och hålla proverna i en ny uppsättning av 70% etanol för O / N. Efteråt satte proverna i 80% och 90% etanol alltså, och hålla dem i 1 timme, respektive, följt av 100% etanol för O / N.
- Ta bort etanolen. Förvara proverna i oxylen i 1 timme, och byta till en ny uppsättning oxylen. Upprepa detta steg 3x.
- Bädda in proverna i en paraffin mögel med hjälp av Leica bädda centrum. Efteråt är proverna sektione på 5 ^ m med användning av en roterande mikrotom (Leica RM2255, Tyskland), och uppsamlades därefter på objektglas.
- Seriella sagittala sektioner skärs för varje prov som spänner över ett område från mitten av den laterala kondylen till centrum av den mediala kondylen.
- Safranin O färgning utförs, följt av scoring och statistisk analys genom OARSI poängsystem som beskrivits tidigare 25.
- Först Avparaffinera objektglasen i oxylen, och återfukta dem i en etanol gradient till destillerat vatten. Därefter glasen färgades genom Weigerts Iron Hematoxylin Solution, 0,05% Fast Green (FKF)-lösning, 1% ättiksyralösning, och 0,1% Safranin O Solution. Montera bilderna med hjälp av harts medium.
- Betyg de Safranin O färgade diabilder som baseras på förlust av proteoglykan (röd färg) i brosk och andelen förstörelse i brosk struktur, göra statistisk analys för den histologiska poäng.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DMM-modellen verkligen skett i möss, och brist på PGRN överdrivna kirurgiskt inducerad OA utveckling.
Sham och DMM verksamhet (Figur 1) utfördes i WT och PGRN-/ - möss. 8 veckor efter operationen, avlivades mössen, och Safranin O-färgning utfördes på sektioner från knäleder, följt av statistisk analys av artrit poäng baserad på histologi. Som visas i figur 2A, det fanns inga uppenbara degeneration av brosk i båda genotyper i skenoperation grupper utifrån Safranin O färgning, vilket innebar liknande scenariot (övre paneler). 8 veckor efter DMM drift (lägre paneler), fanns det förlusten av proteoglykan och förstöring av broskstruktur i både WT och PGRN-/ - möss (röda pilar). Både förlusten av proteoglykan och nedbrytning av brosk tyder det framgångsrika induktion av OA fenotypen. Barerna i kolonnerna vilket visared variationen mellan koncerninterna medlemmar efter DMM operation. Dock är det bar relativt kort, och PGRN knockouts visade en högre förlust av proteoglykan och broskstrukturen var mer allvarligt förstördes i jämförelse med vildtypen rasen. Dessutom har den statistiska analys för broskPoäng utfördes såsom beskrivits tidigare 25 och brosk poäng var signifikant högre i PGRN knockouts än WT-gruppen. Våra resultat visade att en förlust av PGRN medfört strängare OA fenotyp.
Figur 1. Kirurgiskt ingrepp för DMM induktion. a. En medial para-patellar snitt görs i huden på knäleden. b.. Exponering av knäleden utrymme efter lateral förskjutning av ledkapsel. c.. Inre sTRUKTUR av knäleden. Blå pil anger mediala menisken. Gula pilen visar meniscotibial ligament. D.. Medial menisk destabiliseras. Blå pil visar den mediala menisken som är ur led från ursprungliga plats. Gula pilen visar resterande del av meniscotibial ligament som har dissekeras. D.. Ledkapseln är stängd. F.. Huden är stängd. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Representativa bilder av histologi och statistisk analys för värdering av artros A. Representativa histologiska bilder på WT och PGRN-/ -. Möss 8 veckor efter simulerad operation eller DMM, Analyserad med Safranin O färgning. Röda pilar indikerar broskdestruktion. Förlust av röd färg i brosk innebär förlust av proteoglykan. Skala bar, 100 nm B. Statistisk analys för värdering av artros i båda PGRN-/ -.. Och WT möss Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det har rapporterats att den stam av möss är mycket viktigt för DMM modell induktion, har så olika stammar av möss varierande svårighetsgrad av OA efter DMM, med högsta nivå i 129/SvEv stammen, följt av C57BL6, 129/SvInJ och sedan FVB / n 26. En stor del av transgener är etablerade i C57BL6 möss, såsom PGRN-/ - möss som vi använt i den aktuella studien, som är relativt känsliga för DMM. Men om transgenen är baserad på okänslig stam såsom FVB / N-möss, är det nödvändigt att återkorsnings dessa möss med känsliga stammar före DMM induktion. I kön av möss som används för DMM induktion är också mycket viktigt eftersom studier redan har visat att kvinnliga möss är mindre känsliga än hanmöss 27. Dessutom en ålder av möss för DMM operation varierar från 8 veckor till 12 veckor baseras på litteratur 29, som också spelar en avgörande roll i patogenes av OA. Därför bör möss av samma ålder drivas för att eliminera denna effekt. Postoperativ smärtlindring är nödvändig för att förbättra rörligheten för möss efter kirurgi. Som DMM modell leder till OA genom rörelse medierad slitage i brosk, otillräcklig rörelse till följd av postoperativ smärta kan leda till inkonsekvens av OA utveckling. För närvarande finns det en diskrepans om definitionen av DMM om huruvida eller inte att ta bort den mediala menisken 4,28. I vår nuvarande studie, vi bara destabiliserat mediala menisken, men inte ta bort den. Lesioner i DMM-modellen var huvudsakligen belägen på den centrala viktbärande regionen mediala tibiala platån, och svårighetsgraden av lesioner ökade under tidsförloppet (opublicerade data), och resultaten var i överensstämmelse med tidigare rapporter 5. Dessutom OARSI poäng efter DMM operation var relativt konsekvent mellan olika medlemmar i samma genetiska grupp.
PGRN spelar en viktig roll i brosk utveckling och artrit 14,21. Vitidigare rapporterat att PGRN samspelar med metalloproteaser ADAMTS-7 och ADAMTS-12 och skyddar brosk-matrisprotein COMP från nedbrytning 19. Dessutom är det väl etablerat att TNF-α spelar en avgörande roll i brosk förstörelse 24. Nyligen fann vi att PGRN antagonized TNF-α och skyddas mot broskdestruktion vid inflammatoriska artritmodeller 14. I denna studie har vi inducerad DMM modellen i WT och PGRN-/ - möss, och som väntat, PGRN-/ - möss uppvisade överdriven fortskridandet av OA efter induktion av DMM, som indikerades genom mer allvarlig förlust av proteoglykan i Safranin O-färgning och betydligt högre artrit poäng baserad på histologi (Figur 2). Dessutom är de uttryck för katabola markörer dramatiskt förhöjda i PGRN-/ - gruppen (opublicerade data), vilket tyder på accelererad OA progression i brist på PGRN.
Sammanfattningsvis våra protokoll för etablering av DMM modell successfully inducerade OA fenotyp i WT och PGRN-/ - möss, och induktion var konsekvent och reproduktiv. Den framgångsrika generationen DMM modell i C57/B6 möss ger ett användbart verktyg för att utvärdera terapeutiska medel och OA relaterade gener för OA i framtiden. I den aktuella studien, dokumenterar resultatet av DMM modell en skyddande roll PGRN i OA utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi förklarar här att vi inte har någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av NIH forskningsanslag R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210, och en sjukdom riktade forskningsbidrag från Rheumatology Research Foundation (till CJ Liu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| No. 10 Surgical blades | Feather | 25-2976#10 | |
| 6-0 suture | Applied Dental | WG-N53133 |
References
- Herndon, J. H., Davidson, S. M., Apazidis, A. Recent socioeconomic trends in orthopaedic practice. J. Bone Joint Surg. Am. 83, 1097-1105 (2001).
- Johnson, K., et al. A stem cell-based approach to cartilage repair. Science. 336, 717-721 (2012).
- Yang, S., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha is a catabolic regulator of osteoarthritic cartilage destruction. Nat. Med. 16, 687-693 (2010).
- Glasson, S. S., et al. Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis. Nature. 434, 644-648 (2005).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthr. Cart. 15, 1061-1069 (2007).
- Chia, S. L., et al. Fibroblast growth factor 2 is an intrinsic chondroprotective agent that suppresses ADAMTS-5 and delays cartilage degradation in murine osteoarthritis. Arthritis Rheum. 60, 2019-2027 (2009).
- Miller, R. E., et al. CCR2 chemokine receptor signaling mediates pain in experimental osteoarthritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20602-20607 (2012).
- Wang, Q., et al. Identification of a central role for complement in osteoarthritis. Nat. Med. 17, 1674-1679 (2011).
- He, Z., Ong, C. H., Halper, J., Bateman, A. Progranulin is a mediator of the wound response. Nat. Med. 9, 225-229 (2003).
- Bateman, A., Bennett, H. P. The granulin gene family: from cancer to dementia. Bioessays. 31, 1245-1254 (2009).
- Kessenbrock, K., et al. Proteinase 3 and neutrophil elastase enhance inflammation in mice by inactivating antiinflammatoryprogranulin. J. Clin. Invest. 118, 2438-2447 (2008).
- Yin, F., et al. Exaggerated inflammation, impaired host defense, and neuropathology in progranulin-deficient mice. J. Exp. Med. 207, 117-128 (2010).
- Liu, C. J. Progranulin: A promising therapeutic target for rheumatoid arthritis. FEBS Lett. , (2011).
- Tang, W., et al. The growth factor progranulin binds to TNF receptors and is therapeutic against inflammatory arthritis in mice. Science. 332, 478-484 (2011).
- Zhu, J., et al. Conversion of proepithelin to epithelins: roles of SLPI and elastase in host defense and wound repair. Cell. 111, 867-878 (2002).
- Baker, M., et al. Mutations in progranulin cause tau-negative frontotemporal dementia linked to chromosome 17. Nature. 442, 916-919 (2006).
- Cruts, M., et al. Null mutations in progranulin cause ubiquitin-positive frontotemporal dementia linked to chromosome 17q21. Nature. 442, 920-924 (2006).
- Wils, H., et al. Cellular ageing, increased mortality and FTLD-TDP-associated neuropathology in progranulin knockout mice. J. Pathol. , (2012).
- Guo, F., et al. Granulin-epithelin precursor binds directly to ADAMTS-7 and ADAMTS-12 and inhibits their degradation of cartilage oligomeric matrix protein. Arthritis Rheum. 62, 2023-2036 (2010).
- Xu, K., et al. Cartilage oligomeric matrix protein associates with granulin-epithelin precursor (GEP) and potentiates GEP-stimulated chondrocyte proliferation. J. Biol. Chem. 282, 11347-11355 (2007).
- Bai, X. H., et al. ADAMTS-7, a direct target of PTHrP, adversely regulates endochondral bone growth by associating with and inactivating GEP growth factor. Mol. Cell. Biol. 29, 4201-4219 (2009).
- Feng, J. Q., et al. Granulinepithelin precursor: a bone morphogenic protein 2-inducible growth factor that activates Erk1/2 signaling and JunB transcription factor in chondrogenesis. FASEB J. 24, 1879-1892 (2010).
- Liu, C. J., Bosch, X. Progranulin: A growth factor, a novel TNFR ligand and a drug target. Pharmacol. Therap. 133, 124-132 (2012).
- Wu, H., Siegel, R. M.
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Den Berg, W. B. V. an, Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthr. Cart. 18, 17-23 (2010).
- Glasson, S. S. In vivo osteoarthritis target validation utilizing genetically-modified mice. Curr. Drug Targets. 8, 367-376 (2007).
- Ma, H. L. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthr. Cart. 15, 695-700 (2007).
- Lin, A. C., et al. Modulating hedgehog signaling can attenuate the severity of osteoarthritis. Nat. Med. 15, 1421-1425 (2009).
- Malfait, A. M., et al. ADAMTS-5 deficient mice do not develop mechanical allodynia associated with osteoarthritis following medial meniscal destabilization. Osteoarthr. Cart. 18, 572-580 (2010).
