Summary
FIM is een nieuwe, voordelige beeldvormingssysteem om kleine bewegende objecten zoals C. bijhouden elegans, planaria of Drosophila larven. De begeleidende FIMTrack programma is ontworpen om snelle en efficiënte data-analyse te leveren. Samen vormen deze tools kunnen high-throughput analyse van gedragskenmerken.
Abstract
De analyse van neuronale netwerk functie vereist een betrouwbare meting van gedragskenmerken. Aangezien het gedrag van vrij bewegende dieren variabele in zekere mate, veel dieren moeten worden geanalyseerd om statistisch significante gegevens te verkrijgen. Dit vereist op zijn beurt een computerondersteund geautomatiseerde kwantificering van de motoriek patronen. Om een hoog contrast van bijna doorschijnend en kleine bewegende objecten te verkrijgen, een nieuwe beeldvormingstechniek op basis van gefrustreerde totale interne reflectie genoemd FIM werd ontwikkeld. In deze opstelling worden de dieren alleen verlicht met infrarood licht op de zeer specifieke positie van het contact met het onderliggende kruipen oppervlak. Deze methode resulteert in een zeer hoog contrast. Vervolgens worden deze contrastrijke beelden verwerkt met behulp van gevestigde contour volgen algoritmen. Op basis hiervan ontwikkelden we de FIMTrack software, waarvan een aantal functies die nodig extract kwantitatief beschrijven een grote verscheidenheid van voortbewegingkenmerken. Tijdens de ontwikkeling van deze software pakket, we onze inspanningen gericht op een open source architectuur waardoor de eenvoudige toevoeging van verdere modules. Het programma werkt platformonafhankelijk en gaat vergezeld van een intuïtieve GUI die de gebruiker door middel van data-analyse. Alle motoriek parameter waarden worden gegeven in de vorm van csv-bestanden waardoor verdere data-analyses. Bovendien a Resultaten Viewer geïntegreerd in de tracking software biedt de mogelijkheid om interactief te beoordelen het uitgangsniveau, zoals nodig kunnen zijn tijdens stimulus integratie. De kracht van FIM en FIMTrack wordt aangetoond door het bestuderen van de beweging van de Drosophila larven.
Introduction
De meeste dieren de mogelijkheid om te bewegen in een zeer geavanceerde gecontroleerde manier. Om de genetische basis onderliggende motoriek controle te ontcijferen is het verplicht om verschillende gedragspatronen kwantitatief te beoordelen. In dit opzicht kan Drosophila dienen als een ideaal model. Tracking van vrij vliegen Drosophila is verleidelijk 1-4 maar kruipen van Drosophila larven gebeurt in twee dimensies bij relatief lage snelheid en kan dus eenvoudig worden gecontroleerd. Camera-gebaseerde opstellingen in combinatie met de juiste belichting worden gebruikt om beelden 5 verwerven. Beide incident of doorgelaten licht wordt gebruikt in gedragsexperimenten 6,7. Echter, als gevolg van de semi-doorschijnend lichaam van de larven en mogelijke licht reflecties van de kruipende oppervlak getrouwe wijze vastleggen van larvale bewegingen kan een uitdaging zijn. Om dergelijke problemen te overwinnen, hebben sommige complexe methoden ontwikkeld. Onlangs werd donker veld verlichting geïntroduceerd op de voorgrond / achtergrond cont verbeterenrast 8. Als alternatief voor cameragebaseerde opname, lens minder optische beeldvorming en-sensorloze on-chip acquisitietechnieken geïntroduceerd 9-11.
Verschillende opsporingsprogramma's zijn onlangs geïntroduceerd, waaronder de handel verkrijgbare software 12 en maatwerkoplossingen. Voorbeelden voor high-throughput opsporingsprogramma's zijn de Multi Worm Tracker (MWT) 13 en Multianimal Gait En Track (Magat) 8. Beide hebben met elkaar gemeen, dat meerdere dieren kunnen worden bijgehouden in een enkele open-veld arena zodat botsende dieren leiden tot meerdere nieuwe dier identiteiten. Om deze beperking te omzeilen, werd een multi-well setup geïntroduceerd scheiden van 12 dieren in de individuele putten 14. Nauwkeurige kwantificering van beweging van afzonderlijke individuen kan worden bereikt door een beweegbare tracking-fase in combinatie met een microscoop 15. Al deze methoden zijn ofwel kosteninefficiënte, onvoldoende reoplossing of te tijdrovend voor high throughput fenotypering.
Om de bovengenoemde beperkingen te overwinnen, ontwikkelden we FIM (FTIR-based Imaging Method) op basis van gefrustreerde totale interne reflectie (FTIR) 16 (Figuur 1). Deze nieuwe imaging benadering biedt een ongekend hoog contrast en maakt zelfs multi-color opname van kruipende dieren 16. Het onderliggende principe van deze handige en effectieve methode is eenvoudig. Een acrylglas plaat wordt overspoeld met licht (bijvoorbeeld 875 nm infrarood). Vanwege de verschillende brekingsindices van acrylglas en lucht, wordt het licht volledig weerspiegeld in het glas / lucht grens. Geen verwarming van het acrylglas wordt opgemerkt 16. Alleen als objecten met een hogere brekingsindex raken de lichte tafel, kan het licht voert deze objecten. Indien de dieren het oppervlak raken, wordt licht gereflecteerd en kan worden opgenomen uit hieronder (figuur 1). Bijgevolg alleen contactgebied van de dieren verschijnt als een lichtpuntje, die een gedetailleerde beeldvorming mogelijk maakt met een totale zwarte achtergrond. Zo FIM-imaging maakt het mogelijk om perfect films voor computer vision algoritmes opnemen. De eenvoudige en robuuste gebruik van FIM brengt nu gedetailleerde hoge doorvoer analyse van complexe dierlijk gedrag in bereik en kan worden gebruikt voor het bestuderen van informatieverwerking: bijvoorbeeld reukzin 8, 16; vision 17 of thermosensation 18.
Figuur 1. FIM setup met warmte-stimulus-integratie en de onderliggende fysische principes. (A) De FIM setup. Lichtintensiteit kan op het voorpaneel worden geregeld. (B) Om een warmte stimulans te leveren, een zwart gelakte aluminium plaat, perfusie met warm en koud water aan beide zijden, wordt geplaatst 2 mm boven de agar oppervlak datzelf is 2 mm dik. De gradiënt is gevestigd op het vuur radiator plaat en de agar door de temperatuurverschillen (C) Het natuurkundige principe van gefrustreerde totale interne reflectie. Een acrylglas plaat wordt verlicht door infrarood licht. θ 1, θ 2, en θ 3 geven de lichtreflectie hoeken. n A, n 1, n 2 en n 3 duiden de brekingsindex van lucht, acrylglas, agar en de larve respectievelijk en voldoen aan de ongelijkheid n A <n 1 <n 2 <n 3. Door breking, verandert de reflectiehoek tijdens de overgang. Als de hoek onder de kritische hoek, wordt het licht niet meer terug te vinden, kan door de lagen en kunnen worden vastgelegd van onderen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
De spectrum processen die kunnen worden geanalyseerd door FIM breed. Zonder verdere aanpassingen kunnen FIM beeldvorming worden gebruikt om alle larvale stadia van Drosophila (Figuur 5B) monitor of kan worden gebruikt om de voetafdrukken van volwassen Drosophila 19 volgen. Ook de banen van C. elegans of de beweging van planarian platwormen kan eenvoudig worden opgenomen (Figuur 5C). Zelfs de analyse van schimmel Schimmeldraad of wortel haar groei lijkt haalbaar 19. In de huidige FIM opstart, worden 4 x 16 infrarood licht emitterende diodes (IR LEDs) geïntegreerd in een 32 x 32 cm 2 acrylglas plaat, genaamd de tabel volgen (figuur 1). De intensiteit van de IR-LED's wordt aangepast afhankelijk van het gewicht van de voorwerpen op de tracking tafel, die gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd door een microcontroller verbonden met het circuit via pulsbreedtemodulatie (PWM). Levert FIM zeer contrastrijke beelden over een breed scala van verlichting intensiteiten. Belangrijker is dat het genteert uitstekende resultaten bij al lage totale infrarood irridation.
Een camera met een infrarood filter onder het volgen tabel, die de integratie van extra stimuli laat in de opstelling geplaatst. Warmte stimuli kan gemakkelijk door een warmte radiator plaat worden toegepast en licht stimuli worden door een LCD-projector toegepast. Ook geurstoffen kunnen in verlopen worden opgenomen door eenvoudige deksels 8. Voor warmte gradiënt experimenten wordt de warmte radiator plaat doorbloed met warm en koud water aan beide zijden respectievelijk geplaatst 2 mm boven de larven (Figuur 1B).
Het produceren van een hoog contrast, hoge kwaliteit films opent de mogelijkheid voor geavanceerde computer gebaseerde beeldanalyse, waardoor implementeerden we de FIMTrack software om een grote reeks van functies uit beelden te extraheren (Figuur 2). Eerste zes primaire functies gedefinieerd van de contour van het dier (Figuur 3A). Deze functies bieden de basislijnvoor verdere berekening zes secundaire functies die de dieren vorm en zijn in bepaalde stimuli op een bepaald tijdstip (Figuur 3B). Momenteel zijn negen tertiaire kenmerken berekend dat integreren temporele aspecten en daarmee karakteriseren de voortbeweging van het dier tezamen met de primaire en secundaire kenmerken (figuur 3C).
Figuur 2. FIMTrack overzicht, algoritmische workflow en larvale vertegenwoordiging. (A) Hoe FIMTrack gebruiken. De afbeeldingen worden geladen. Grijswaarde drempel en larvale drempels definiëren van enkele larven moeten worden ingesteld. De larvale moet gelegen zijn op [min-size, max-size]. Tracking wordt gestart door de gemarkeerde knop. (B) Tracking workflow. Na de start knop wordt geklikt, de achtergrondafbeelding is calculated (minimale intensiteiten in de tijd). Zolang er frames verlaten, worden de larven gesegmenteerd op basis van de grijsdrempelwaarde en de min- en max-drempelwaarde. Voor alle segmentaties de larvale representaties berekend (te vergelijken (C)). Elk nieuw model is gekoppeld aan een bepaald traject als een geldig nummer beschikbaar is. Als het laatste frame is bereikt, wordt de laatste hand nabewerking gedaan, gevolgd door de output genereren. (C) Larvale vertegenwoordiging. Het dier bestaat uit een kop en een staart punt (h en t). Tussen deze punten een willekeurig oneven aantal wervelkolom punten s kan ik worden ingesteld met een straal r i. Bovendien, het centrum van de massa m en het hoofdlichaam buighoek γ berekend. Verschillende motion gerelateerde parameters worden geschetst door paarse lijnen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Kenmerken berekend door FIMTrack. (A) Primaire functies op basis van de contour van de dieren. (B) Secundaire functies, op basis van de primaire functies. (C) Tertiaire functies, op basis van de primaire functies in opeenvolgende frames en extra ingangen Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.
Protocol
OPMERKING: Hier wordt het gebruik van FIM aangeboden voor handige high throughput analyse van larvale voortbeweging voor screening in vrij bewegende omstandigheden onder invloed van warmte stimulus. Andere toepassingen, zoals analyse van olfactorische prikkels afhankelijk voortbeweging of de hoge resolutie beeldvorming van rollen of andere gedragingen kunnen subtiele veranderingen aan het protocol, die worden verstrekt op aanvraag nodig.
1. Set-up van Experimenten
- Gebruik ongeveer 100 larven per genotype in totaal (1 uur tijd nodig) om statistisch betekenisvolle waarden te verkrijgen. OPMERKING: In het geval dat nodig verschillende genotypes worden vergeleken en opgenomen op verschillende dagen, op te nemen hetzelfde aantal larven per genotype per dag.
- Voor de meeste toepassingen plaat bij 10 Hz voor parameter analyse. Voor hoge resolutie imaging-toepassingen, variëren belichtingssnelheid indien nodig.
- Voor het volgen van de derde instar larven, gedrag experimenten ongeveer 120 uur na de eileg. Maak sure dat culturen genoeg larven op in de experimentele periode (zie 4.3).
- Voor niet-stimulus toepassingen, bereiden een kruipende oppervlak met doorschijnende agar (zie paragraaf 2). Om larven bevatten in de stimulus bereik voor hittegradiënt toepassing, omringen het gezichtsveld met een aversieve zout agar barrière (zie paragraaf 3).
OPMERKING: Andere toepassingen kunnen verschillende oppervlakken vereisen. - Zorg ervoor dat u een kamer met constante omgevingsomstandigheden (temperatuur, licht, luchtstroming, luchtvochtigheid etc.) gebruiken.
2. Crawling Oppervlaktebehandeling (Translucent Agar)
Opmerking: In de FIM opstelling een agar oppervlak wordt toegevoegd aan een vochtige kruipen oppervlak. Daarnaast verbetert ook verlichting eigenschappen.
- Kook 0,8% food grade agar in gedeïoniseerd ultrapuur water. Voor screening aanvraag voor te bereiden 400 ml.
- Giet agar bij 50 ° C (handwarm) op een afzonderlijke 33 cm x 33 cm acrylic-glasplaat. De oppervlaktespanning van de agar en dus de temperatuur van de dikte van de agar plaat definiëren. Bij 50 ° C wordt 2 mm agar platen verkregen. Niet schudden na het koken en giet voortdurend om luchtbellen te voorkomen. Bereid verse agar platen voor elke beeldvorming periode van ongeveer 4 uur.
- Vul standaard 6 cm petrischaaltjes met de resterende 0,8% agar oplossing sorteren, schoon en wennen larven voorafgaand aan het experiment (1 gerecht per genotype).
- In het geval dat een aversieve agar barrière is nodig voor de toepassing, gaat u naar hoofdstuk 3.
- Snij ongeveer 2 cm van de omtrek van de agar plaat op een vlak vierkant oppervlak te verkrijgen voor de opname. Verwijder het agar.
OPMERKING: De grootte is afhankelijk van de toepassing. - Breng de agar plaat aan de FIM setup direct na afkoeling door zachtjes te duwen het zweefvliegen agar over de rand van de acrylglas plaat.
3. Optioneel: Het toevoegen van een aversieve Agar Barrier aan de Kropleng Surface (Salt Agar)
- Kook 2,5% food grade agar met 3 M NaCl in gedeïoniseerd ultrapuur water. Voor het screenen op een hittegradiënt bereiden 200 ml.
OPMERKING: Het volume is afhankelijk van de toepassing. - Snijd een 2 cm brede inkeping in het daarvoor gestorte kruipen omgeeft het gezichtsveld (22 x 22 cm).
OPMERKING: Verschillende barrière vormen en gezichtsveld kan nodig zijn afhankelijk van de toepassing. - Vul de inkeping met zout agar 0,1-0,3 cm hoger dan de tracking oppervlak.
4. Fly Handling
- Achterste vliegt in 25 ° C incubator met 12 uur licht / donker cyclus aangepast aan de tijd van het experiment op standaard fly eten bij 65% luchtvochtigheid.
- Voor kruisen, verdoven 30 maagdelijke vrouwtjes en 8 mannetjes met CO 2 en kruis ze in 130 ml cultuur flesjes met 35 ml voedsel.
OPMERKING: Een 130 ml cultuur flacon met 35 ml voedsel zal ongeveer 20-30 l opleverenaten derde instar larven binnen de beeldvorming overspanning van 4 uur. Beeldvorming en het bijhouden van werken voor alle larvale stadia instar. - Laat een beetje water in de cultuur flacons te late derde instar larvale beweging te rijden en het verzamelen van de grootste larven uit flacon muren met behulp van een klein penseel.
- 2-5 min voordat de opname, overdracht larven voor een video naar een Petri-schaaltje met 0,8% food grade agar in gedeïoniseerd ultrapuur water te wennen en maak ze schoon.
5. Instellen van de FIM Imaging Setup voor Recordings (Non Stimulus voorwaarden)
- Pas cameralens focus en diafragma indien nodig. Stel de belichtingstijd voor de betreffende camera.
LET OP: Deze instellingen hoeven niet tijdens een experiment om te worden veranderd. - Pas lichtintensiteit tot een goed contrast te verkrijgen door beeldvorming een larve.
- Houd de milieuomstandigheden in de kamer constant tijdens opnames. Donkerder de ruimte om larven met directionele licht niet storen.
6. Optioneel: Aanpassen van de FIM Imaging Setup voor Recordings (Geleidelijke Temperatuur Stimulus voorwaarden)
OPMERKING: De warmte gradiënt apparaat is een 42 x 42 x 0,2 cm 3 aluminium plaat met een matte zwarte verf en het isoleren van materiaal op de top plaats. De plaat wordt doorbloed met water uit twee verschillende circuits verbonden met boilers / koelers en pompen aan beide uiteinden (zie figuur 1B). De temperatuur kan worden geregeld van -5 tot +50 ° C.
- Schakel de hittegradiënt apparaat 1 uur voorafgaand aan de experimenten en plaats deze boven de setup te laten tot oprichting van de gewenste temperatuur profiel en componenten van het evenwicht.
- Breng de kruipende oppervlak agar met een zout belemmering voor de setup.
- Plaats de radiator plaat over de agar en stel de afstand tussen de plaat en de kruipende oppervlak 2 mm (~ 1 mm boven larven).
- Opzetten van een lineaire gradiënt vanten minste 0,8 ° C / cm vanaf 34 ° C (ong. 2 cm van de barrière in het gezichtsveld) tot 18 ° C (ong. 2 cm vanaf de dam bij de overkant in het gezichtsveld) door aanpassing van de temperatuur van het water circuits tot 1 ° C en 45 ° C.
OPMERKING: Verschillende gradiënt eigenschappen van de metalen plaat vereisen verschillende temperaturen moeten empirisch worden vastgesteld. Deze instellingen hoeft tijdens de experimenten te wijzigen. - Instellingen aan te passen zoals beschreven in hoofdstuk 5.
- Laat het kruipen oppervlak evenwicht in de gradiënt voor experimenten gedurende 20 min. Test de temperatuurgradiënt met een pyrometer.
- Ga verder met paragraaf 8.
7. FIM Imaging (Non Stimulus voorwaarden)
- Gebruik een kleine natte penseel tot 15 larven voorzichtig te verzamelen van de gewenning petrischaaltjes en overbrengen naar het centrum van de tracking oppervlak. Niet overdragen voedsel blijft of te veelwater (zie 7.8).
- Neem 1-50 larven op een 22 cm x 22 cm bijhouden gebied. Gebruik 15 dieren per video voor de meeste screening toepassingen (voor statistische redenen gebruiken ten minste 100 personen per genotype).
- Zachtjes scheiden larven en wacht ongeveer 10-20 sec totdat alle larven begonnen om recht te verplaatsen voordat u opneemt.
- Neem larvale motoriek gedurende 2 minuten bij 10 frames per seconde voor niet stimuluscondities. Gebruik ongecomprimeerde tif beelden als de output formaat.
- Tijdens het opnemen, het verzamelen van larven voor de volgende video van flacons om ze wennen Kritiek:. Heeft opgenomen larven niet storen met licht.
- Na de opname te verwijderen larven met een grote kwast en gooi ze weg in overeenstemming met de plaatselijke veiligheidsvoorschriften en regelgeving.
- Na het verwijderen van larven, gebruikt u de penseel te reinigen en hydrateren de kruipende oppervlak met ultra puur gedemineraliseerd water.
- Kritiek: Houd het oppervlak vochtig te allen tijde, maar vermijd te veel moisture, die kan worden gezien als halo of druppels omringende larven in opnames en verstoren tracking.
8. Optioneel: FIM Imaging (Geleidelijke Temperatuur Stimulus voorwaarden)
- Na de temperatuurgradiënt wordt vastgesteld (zie rubriek 6), de voorbereiding van de opname-software voor het direct opnemen binnen 20 seconden na het plaatsen van de larven op de kruipende oppervlak (zie 8.2), bijvoorbeeld, stelt u het aantal frames per video en bepalen de besparing pad.
- Til de radiator plaat lichtjes en plaats de larven bij 33 ° C 2 cm van het zout barrière. Raadpleeg 6 en 7 voor verdere algemene instructies. Verlaag de radiator plaat opnieuw en start de opname voor 3-4 minuten direct na larven begonnen om rechtdoor te gaan.
- Na de opname te verwijderen larven direct, schoon en hydrateren de oppervlakte. Laat het zout agar niet aan om te voorkomen dat de verspreiding van NaCl.
- Kritiek: Houd het oppervlak vochtig te allen tijde maar vermijdvocht, die gezien kan worden als halo of druppels omringende larven in opnames en verstoren tracking.
- Laat de agar oppervlak na hydraterende voor 1-2 min weer in evenwicht, terwijl het opslaan van afbeeldingen en het verzamelen van nieuwe dieren voor de voorbereiding voor de volgende video. Controle van de temperatuurgradiënt met een pyrometer om 5 video en temperatuurbeveiliging passen indien nodig (watertemperatuur, hoogte en xy oriëntatie ten opzichte van de tracking oppervlak).
9. Tracking van larvale Locomotion
OPMERKING: Voor meer informatie wordt verwezen naar de bijgevoegde handleiding voor FIMTrack (supplement). Voor een programma stroomschema zie figuur 2.
- Pas volgen parameters voor de beide experimenten met de preview-optie.
- Pas pixel per cm volgens de camera en het gezichtsveld.
- Pas frames per seconde op basis van de camera-instellingen.
- Pas lichtsterktedrempels dus thbij alle dieren correct worden gedetecteerd (feedback wordt gegeven in het voorbeeld).
- Pas larvale gebied drempels. Let op de feedback optie in de voorvertoning: enkele dieren zijn in het geel, botsende larven zijn gemarkeerd in rood en de oppervlakte van elk dier wordt gegeven in het blauw.
- Beginnen met het bijhouden via de knop in de rechterbenedenhoek.
OPMERKING: Na het succesvol volgen, wordt een beeld met larvale tracks en een csv-bestand met de berekende motoriek en houding functies opgeslagen in de image map. - Gebruik de FIM Resultaten kijker module (Edit> Resultaten Viewer ...) te herzien en handmatig de tracking resultaten aan te passen. Desgewenst definiëren stimulus gebieden voor het analyseren met betrekking tot de stimulus regime bijvoorbeeld kruipen oriëntatie ten opzichte van de hittegradiënt of afstand tot een geurstof bron. Voor meer gedetailleerde beschrijving kunt u gebruik maken van de handleiding (supplement).
10. Evaluatie van de gegevens
- Importeer het csv-bestand in Excel, Matlab of een ander programma voor verdere statistische analyse.
Representative Results
Voor beeldvorming verschillende camera's met verschillende resolutie eigenschappen werden getest (figuur 4). Alle camera's waar uitgerust met een geschikte IR-filter. Volgens de lage resolutie van de goedkoopste camera in deze test, wordt het gezichtsveld beperkt tot 10 cm x 10 cm. De beste resultaten werden verkregen met een 4 megapixel (MP) camera. Dit leidt tot een resolutie van 100 pixels per derde instar larven lengte en liet inwendige structuren gemakkelijk herkennen. Bovendien kan de peristaltiek van het dier gemakkelijk worden geëxtraheerd (figuur 4A). Echter, men kan nog steeds te verkrijgen hoog contrast films met minder dure camera's, die ook kan worden geanalyseerd door FIMTrack. Met een 1,4 MP camera met een diepte van 8 bit en een resolutie van 1392 x 1040 pixels is ongeveer de helft van de prijs en kan een resolutie van 45 pixels per derde instar larven lengte in het gezichtsveld. De kop maar geen andere inwendige structuren te herkennen (Figuur 4B). Tracking en detectie van de peristaltiek is mogelijk, maar de nauwkeurigheid is verminderd (figuur 4B).
Met een nog goedkoper 0,8 MP camera met een ruimtelijke resolutie vergelijkbaar met de 1.4 MP camera, de larven kop niet getrouw meer herkend (Figuur 4C). Tracking en peristaltiek analyse is mogelijk, maar met inbegrip van meer jitter gebaseerd op de toegenomen lawaai. Verrassend genoeg, zelfs met een lage resolutie USB webcam biedt voldoende kwaliteit films te larvale trajecten berekenen (0.3 MP camera, onder 20 €, Figuur 4D). De peristaltiek kan worden berekend uit het gebied, maar metingen zijn zeer luidruchtig.
In onze opstelling routinematig gebruiken we de 4 MP camera. Voor screening maakt deze camera bewaken van een 22 cm x 22 cm arena, die uiteraard biedt de mogelijkheid om grote aantallen dieren analyseren tegelijkertijd zodat hoge doorvoer analyse haalbaar. Met behulp van deze instelling, larvale lengte is vertegenwoordigd door 40 pixels, waardoor nog altijd registratie en analyse van de peristaltiek. Een voorbeeld van afbeelding 15 larvale trajecten in een warmte gradiënt in figuur 5A. Bovendien, het gebruik van een macro lens toelaat beeld larven met zeer hoge resolutie waar vele interne organen zichtbaar en kop erkenning verder verbeterd (Figuur 5B). Bovendien kunnen deze worden gebruikt voor verdere meer gedetailleerde analyse van het gedrag van een breed assortiment 20. Het zelfde opstelling kan eenvoudig worden gebruikt om beelden kruipen C. elegans wormen (figuur 5C).
Figuur 4. FIM beeldvorming en het bijhouden van de resultaten voor de verschillende camera's. (A) Linker: FIM beeldvorming van drie larven kruipen op een 10 cm x 10 cm bijhouden fase opgenomen met een 4 MP camera met 10 fps. Mid:Knippen en centrum van de massa traject van een enkele larve. Het gebied van het dier is aangegeven. Rechts: De omgeving van de larven uitgezet meer dan 100 frames. De rode pijl geeft het tijdstip van de geknipte afbeelding. (B) Gelijk aan (A), maar gemaakt met een 1.4 MP camera. (C) Equivalent met (A), maar gevangen met behulp van een 0,8 MP camera. (D) Gelijk aan ( A), maar gemaakt met een 0.3 MP camera. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Warmte stimulus, en toepassingen met hoge resolutie. (A) Thermische stimulustoediening (vergelijk figuur 1). Trajecten berekend via FIMtrack. Hoge resolutie toepassing beeld van een derde, tweede en eerste larve met behulp van een macro lens (B). De derde instar larvale lengte wordt vertegenwoordigd door 400 pixels in een zichtsveld van 2,5 x 2,5 cm. (C) A C. elegans worm gevangen met behulp van FIM beeldvorming. Schaalbalken worden aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
In Behavioral Neuroscience is het verplicht om kwantitatief te ontcijferen complexe gedragskenmerken. Zo moet grote aantallen individuen worden waargenomen bij hoge resolutie en geautomatiseerde procedures nodig voor statistische analyse. Hier wordt FIM beeldvorming beschreven, een nieuw, eenvoudig en robuust imaging opstelling, waarbij de middelen om voortbeweging van een groot aantal dieren daarop bepaalt. De werkzaamheid van de FIM beeldvormende opstelling werd getest met Drosophila larven, planarian platwormen en C. elegans wormen. De FIM technologie intrinsiek hoog contrast zelfs interne structuren van de dieren, zoals de hersenen, de luchtpijp, de darm of de bijmaag detecteren. Belangrijk is dat deze interne structuren robuust geïdentificeerd zodat ze kunnen dienen om de oriëntatie van het dier 19 automatisch te identificeren.
De kwaliteit van de films kunnen worden beïnvloed door overmatige hoeveelheid water op het oppervlak kruipen. Aldus is het essentieel omcontrole van de vochtigheid van de agar. Te oud agar of te veel water aan de oppervlakte kunnen artefacten veroorzaken. Ook ervoor zorgen dat er geen luchtbellen zijn opgenomen in het kruipen oppervlak. In het algemeen een goed voorbereide agaroppervlak laat opnemen van films om 4 uur.
Als gevolg van de onderliggende fysische principes FIM beeldvorming genereert bijna ruisvrij beeldopnamen, wat resulteert in een superieure beeldkwaliteit. Dit op zijn beurt faciliteert daaropvolgende computer gebaseerde beeldanalyse en zorgt voor een hoge doorvoersnelheid. Echter, wordt de methodiek beperkt tot het analyseren van dieren die rechtstreeks contact opnemen met de agar oppervlak. De tracking software wordt uitgedaagd door dieren die een donut vorm. Hoewel een binaire indicator erkent de donut vorm, kan een verkeerde wervelkolom worden berekend.
Door de modulaire opbouw van de tracking tafel dual en triple kleur beeldvorming is in handbereik. Bovendien kunnen extra prikkels (licht, geurstoffen, elektrische of mechanische stimuli) gemakkelijk delivered van boven. Het FIMTrack programma dat is ontworpen om de kracht van FIM beeldvorming overeenkomen kan eenvoudig worden vastgesteld om Drosophila larven, C. volgen elegans of planarians. Zo en vanwege de eenvoudige en goedkope constructie (zie http://FIM.uni-muenster.de), FIM beeldvorming haalbaar is voor een brede waaier van biomedische toepassingen en in het bijzonder maakt dringend high throughput studies nodig.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor S. Thomas die dit project heeft geïnitieerd, J. Hermann en U. Burgbacher voor hulp bij de bouw van de FIM setup. Dit werk werd gefinancierd door de DFG (SFB 629 B6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FIM setup | Custom | details for construction or purchase of setups is available upon request | |
| Acrylic glass plate | Custom | Additional for agar pouring | |
| Heat radiator plate | Custom | Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting | |
| Water calorifier/cooling pumps and hoses | Custom | based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013) | |
| Standard Camera (4 MP) | Basler | acA2040-25gm | Camera defaultly used for the FIM setup |
| Test Camera (1.4 MP) | QImaging | 1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO) | Camera used for comparison |
| Test Camera (0.8 MP) | Point Grey | Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS) | Camera used for comparison |
| Test Camera (0.3 MP) | Sony | PS Eye USB2.0 camera | Camera used for comparison |
| Computer | Custom | equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [>1TB] | |
| Standard Fly food | Custom | ||
| Standard Fly vials 135 ml | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 78,895 | |
| Petri dishes 9 cm | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 821,473 | |
| Ultrapure deionized water | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | Synergy | |
| NaCl | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 3957.2 | |
| Food grade agar | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A0917,5000 | |
| Paintbrush (small and large) | Milan | Aquarell 310 Size 0 and 2 | |
| Pyrometer | Trotec | BP20 |
References
- Maimon, G., Straw, A. D., Dickinson, M. H. A Simple Vision-Based Algorithm for Decision Making in Flying Drosophila. Current Biology. 18 (6), 464-470 (2008).
- Frye, M. A., Dickinson, M. H. Closing the loop between neurobiology and flight behavior in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 14 (6), 729-736 (2004).
- Fry, S. N. The Aerodynamics of Free-Flight Maneuvers in Drosophila. Science. 300 (5618), 495-498 (2003).
- Risse, B., Berh, D., Tao, J., Jiang, X., Klette, R., Klämbt, C. Comparison of two 3D tracking paradigms for freely flying insects. EURASIP Journal on Image and Video Processing. 2013 (1), 57 (2013).
- Yilmaz, A., Javed, O., Shah, M. Object tracking: A Survey. ACM Computing Surveys. 38 (4), (2006).
- Pistori, H., et al. Mice and larvae tracking using a particle filter with an auto-adjustable observation model. Pattern Recognition Letters. 31 (4), 337-346 (2010).
- Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PloS one. 3 (5), e2208 (2008).
- Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature Methods. 9 (3), 290-296 (2012).
- Cui, X., et al. Lensless high-resolution on-chip optofluidic microscopes for Caenorhabditis elegans and cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10670-10675 (2008).
- Heng, X., et al. Optofluidic Microscopy - a Method for Implementing a High Resolution Optical Microscope on a Chip. Lab on a chip. 6 (10), 1274-1276 (2006).
- Liu, P., Martin, R. J., Dong, L. Micro-electro-fluidic grids for nematodes: a lens-less, image-sensor-less approach for on-chip tracking of nematode locomotion. Lab on a chip. 13 (4), 650-661 (2013).
- Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. The EthoVision video tracking system--a tool for behavioral phenotyping of transgenic mice. Physiology. 73 (5), 731-744 (2001).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Yu, C. -C. J., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of neuroscience methods. 223, 35-39 (2014).
- Wang, S. J., Wang, Z. -W. Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior. PloS one. 8 (7), e69653 (2013).
- Gomez-Marin, A., Stephens, G. J., Louis, M. Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis. Nature communications. 2, 441 (2011).
- Kane, E. A., et al. Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (40), E3868-E3877 (2013).
- Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. Journal of Neuroscience. 30 (12), 4261-4272 (2010).
- Risse, B., Thomas, S., Otto, N., Löpmeier, T., Valkov, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM, a Novel FTIR-Based Imaging Method for High Throughput Locomotion Analysis. PLoS one. 8 (1), e53963 (2013).
- Risse, B., Otto, N., Jiang, X., Klämbt, C. Quantifying subtle locomotion phenotypes of Drosophila larvae using internal structures based on FIM images. Comput Biol Med. 14, (2014).
