FIM Imaging og FIMtrack: To nye redskaber, der giver High-throughput og omkostningseffektiv Locomotion Analysis

Summary

FIM er en roman, omkostningseffektiv imaging system designet til at spore små bevægelige genstande såsom C. elegans, Planaria eller Drosophila-larver. Den medfølgende FIMTrack Programmet er designet til at levere hurtig og effektiv dataanalyse. Tilsammen udgør disse værktøjer giver high-throughput analyse af adfærdstræk.

Abstract

Analysen af ​​neuronal netværk funktionen kræver en pålidelig måling af adfærdstræk. Da adfærd frit bevægelige dyr er variabel til en vis grad, har mange dyr, der skal analyseres, for at opnå statistisk signifikante data. Dette kræver en computer bistået automatiseret kvantificering af bevægelseskomponenter mønstre. For at opnå høj kontrast billeder af næsten gennemsigtige og mindre bevægelige objekter, blev en ny imaging teknik baseret på frustrerede total intern refleksion kaldet FIM udvikles. I denne opsætning er dyrene kun belyst med infrarødt lys i det særlige situation for kontakt med den underliggende crawling overflade. Denne metode resulterer i meget høj kontrast billeder. Efterfølgende er disse høj kontrast billeder forarbejdet ved anvendelse af etablerede kontur sporing algoritmer. Baseret på dette, vi udviklede FIMTrack software, som tjener til at udtrække en række funktioner, der er nødvendige til kvantitativt at beskrive en lang række bevægelseegenskaber. Under udviklingen af ​​denne software pakke, vi fokuseret vores indsats på en open source arkitektur tillader nem tilføjelse af yderligere moduler. Programmet fungerer uafhængig af platform og er ledsaget af en intuitiv GUI vejlede brugeren gennem dataanalyse. Alle bevægelsesevne parameterværdier er givet i form af CSV-filer gør det muligt yderligere dataanalyser. Desuden en Resultater Viewer integreret i tracking software giver mulighed for interaktivt at gennemgå og justere output, som kan være nødvendig under stimulus integration. Effekten af ​​FIM og FIMTrack demonstreres ved at studere bevægelse af Drosophila larver.

Introduction

De fleste dyr har evnen til at bevæge sig i en meget sofistikeret og kontrolleret måde. At dechifrere det genetiske grundlag underliggende bevægelse kontrol er det obligatorisk at kvantitativt vurdere forskellige adfærdsmønstre. I denne henseende kan Drosophila tjene som en ideel model. Sporing af frit flyvende Drosophila er fristende ^1-4 men gennemsøgning af Drosophila larver forekommer i to dimensioner ved relativt lav hastighed og kan således overvåges let. Kamera-baserede setups kombineret med passende belysning bruges til at erhverve billeder ^5. Både hændelse eller transmitteret lys anvendes i adfærdsmæssige eksperimenter ^6,7. På grund af den halvgennemsigtigt krop larver og eventuelle lysreflekser af kravlende overflade trofaste registrering af larver bevægelser, kan dog være en udfordring. For at overvinde sådanne problemer er der blevet udtænkt nogle komplekse metoder. For nylig blev mørkefeltbelysning indført for at forbedre forgrunden / baggrunden contRast ^8. Som et alternativ til kamera-baserede optagelse, linse-mindre optisk billeddannelse og image-sensor-mindre on-chip er blevet indført erhvervelse teknikker ^9-11.

Adskillige tracking programmer er blevet indført for nylig, herunder kommercielt tilgængelige software ¹² og tilpassede løsninger. Eksempler på højt gennemløb tracking programmer er Multi Worm Tracker (MWT) ¹³ og Multianimal gang og Track (Magat) ^8. Begge har til fælles, at flere dyr kan spores i en enkelt åben felt Arenaen, så kolliderende dyr føre til flere nye dyr identiteter. For at overvinde denne begrænsning blev en multi-brønds setup indført adskillelse 12 dyr i individuelle brønde ^14. Præcis kvantificering af bevægelse af enkelte individer kan opnås ved hjælp af en bevægelig sporing fase i kombination med et mikroskop ^15. Men er enten omkostningerne ineffektive alle disse tilgange, manglende tilstrækkelig reopløsning eller for tidskrævende for high throughput fænotypebestemmelse.

For at overvinde de ovennævnte begrænsninger, har vi udviklet FIM (FTIR-baserede Imaging Method) baseret på Frustreret total intern refleksion (FTIR) ¹⁶ (figur 1). Denne nye imaging tilgang giver en hidtil uset høj kontrast og endda tillader flerfarvede optagelse af kravlende dyr ^16. Det underliggende princip i denne handy og effektiv metode er let. En akrylglas plade er oversvømmet med lys (f.eks 875 nm infrarød). På grund af forskellige brydningsindekser akrylglas og luft, lys reflekteres totalt ved glas / luft grænse. Ingen opvarmning af akrylglas bemærkes ^16. Kun hvis objekter med et højere brydningsindeks røre lyse bord, kan lyse ind i disse objekter. Hvis dyrene berøre overfladen, er lys reflekteres og kan opfanges nedefra (figur 1). Som følge heraf kun kontaktenområde af dyrene vises som en lys plet, som giver detaljerede billeder med en samlet sort baggrund. Således FIM-imaging gør det muligt at optage perfekte film til computer vision algoritmer. Den enkle og robuste anvendelse af FIM bringer nu detaljeret high throughput analyse af komplekse adfærd dyr i rækkevidde og kan bruges til at studere informationsbehandling: f.eks lugtesansen ^{8, 16;} vision ¹⁷ eller thermosensation ^18.

Figur 1. FIM setup med varme-stimulus integration og underliggende fysiske principper. (A) FIM setup. Belysning intensitet kan reguleres på frontpanelet. (B) til at levere en varme stimulus, en sort malet aluminium plade, perfunderet med varmt og koldt vand på begge sider, er placeret 2 mm over agaroverfladen somselv er 2 mm tyk. Gradienten er etableret på varmen radiator plade og agaren ved temperaturforskellene (C) Det fysiske princip om frustrerede total intern refleksion:. En akrylglas plade belyst af infrarødt lys. θ _1, θ ₂ og θ ₃ angiver lysrefleksionsmålinger vinkler. n _A, n _{1, n2} og _n3 angiver brydningsindekserne luft, akrylglas, agar og larven henholdsvis og opfylder uligheden n _A <n ₁ <n ₂ <n _3. På grund af brydning, ændrer refleksion vinkel under forandring. Hvis vinklen er under den kritiske vinkel, er lyset ikke reflekteres mere, kan passere gennem lagene og kan fanges nedefra. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Den spectrum af processer, der kan analyseres ved FIM er bred. Uden yderligere justeringer, kan FIM billeddannelse anvendes til at overvåge alle larvestadier af Drosophila (figur 5B) eller kan bruges til at følge mund- udskrifter af voksne Drosophila ^19. Ligeledes baner C. elegans eller flytning af planarian fladorme let kan optages (figur 5C). Selv analyse af svampe hypha eller rod hårvækst forekommer mulig ^19. I vores nuværende FIM setup, er 4 x 16 infrarøde lysemitterende dioder (IR- LED'er) integreret i en 32 x 32 cm ² akrylglas plade, kaldet tracking tabel (figur 1). Intensiteten af ​​IR-LEDs justeres afhængigt af vægten af ​​genstandene på sporing bord, som let kan udføres af en mikro-controller forbundet til kredsløbet via impulsbreddemodulation (PWM). FIM giver meget høj kontrast billeder over en bred vifte af belysning intensiteter. Vigtigt er det, det gende henvender fremragende resultater ved allerede lav samlet infrarød irridation.

Et kamera med et infrarødt filter er placeret under sporing tabel, som giver mulighed for integration af yderligere stimuli i opsætningen. Heat stimuli let kan anvendes af en radiator plade og lette stimuli anvendes af en LCD-projektor. Også duftstoffer kan være indeholdt i farveforløb ved simple låg ^8. For varme gradient eksperimenter er radiator plade perfunderet med varmt og koldt vand på begge sider henholdsvis og placeret 2 mm over larver (figur 1B).

Frembringelsen af høj kontrast, høj kvalitet film åbner mulighed for avancerede computerbaserede billedanalyse, således implementeret vi FIMTrack software til at udtrække en stor sæt af funktioner fra billeder (figur 2). Første seks primære funktioner blev defineret ud fra konturen af dyret (figur 3A). Disse funktioner giver basislinjentil yderligere beregning af seks sekundære funktioner der beskriver dyr form og dens stilling på bestemte stimuli på et givet tidspunkt (figur 3B). I øjeblikket er ni tertiære funktioner beregnet, at der integrerer tidsmæssige aspekter og dermed karakterisere bevægelse af dyret sammen med de primære og sekundære funktioner (figur 3C).

Figur 2. FIMTrack overblik, algoritmisk workflow og larver repræsentation. (A) Sådan bruges FIMTrack. Billederne er indlæst. Grå værdi tærskel og størrelsestærskler larver definerer enkelt larver skal indstilles. Det larver skal ligge i [min-størrelse, max-størrelse]. Tracking er startet af den fremhævede knap. (B) Tracking workflow. Når startknappen klikkes, baggrundsbilledet er calculated (minimal intensiteter over tid). Så længe der er frames tilbage, bliver larverne segmenteres ud fra den grå tærskel og de min- og max-størrelse tærskel. For alle segmenter larvestadiet repræsentationer beregnes (sammenlign til (C)). Hver ny model er forbundet til en given bane, hvis et gyldigt spor er til rådighed. Hvis det sidste billede er nået, er ved at færdiggøre efterbehandling færdig efterfulgt af output generation. (C) Larve repræsentation. Dyret består af et hoved og en hale (H og T). Mellem disse punkter et vilkårligt ulige antal rygsøjlen point s kan _jeg indstilles med en radius r _i. Desuden er centrum for massen m og hoveddelen bøjningsvinkel γ beregnet. Flere motion parametre er skitseret af lilla linjer. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3. Egenskaber beregnet ved FIMTrack. (A) Primære funktioner baseret på konturen af dyrene. (B) Sekundære funktioner, baseret på primære funktioner. (C) Tertiære funktioner, baseret på primære funktioner i hinanden følgende rammer og ekstra indgange Klik her for at se en større udgave af dette figur.

Protocol

BEMÆRK: Her er brugen af ​​FIM præsenteret for praktisk high throughput analyse af larver bevægelse til screening i bevægelige forhold og under indflydelse af en varme stimulus. Andre applikationer såsom analyse af olfaktoriske stimuli afhængig bevægelseskomponenter eller høj opløsning billeddannelse af rullende eller andre adfærd kan have behov for subtile ændringer i protokollen, som leveres efter anmodning.

1. Opstilling af forsøg

1. Brug omkring 100 larver pr genotype i alt (1 hr tid, der kræves) for at opnå statistisk meningsfulde værdier. BEMÆRK: I tilfælde skal sammenlignes og registreres på forskellige dage flere genotyper, registrerer det samme antal larver pr genotype per dag.
2. Til de fleste anvendelser, rekord ved 10 Hz for parameter analyse. For høj opløsning billedbehandlingsprogrammer, varierer billeddannelseshastighed hvis nødvendigt.
3. Til sporing af tredje stadie larver, udføre eksperimenter omkring 120 timer efter æglægning. Gør sure at kulturer giver nok larver i forsøgsperioden (se 4.3).
4. For ikke-stimulus-programmer, udarbejde en kravlende overflade indeholder gennemskinnelige agar (se afsnit 2). At indeholde larver i stimulus interval for varme gradient ansøgning, surround synsfeltet med et afskrækningsmiddel salt agar barriere (se afsnit 3).
   BEMÆRK: Andre anvendelser kan kræve forskellige overflader.
5. Sørg for at bruge et værelse med konstante miljøforhold (temperatur, lys, luft flow, luftfugtighed etc.).

2. Crawling Forbehandling (Gennemsigtig Agar)

BEMÆRK: I FIM setup tilsættes en agar overflade for at give en fugtig gennemgang overflade. Derudover, det forbedrer også belysnings egenskaber.

1. Kog 0,8% fødevarekvalitet agar i deioniseret ultrarent vand. Til screening ansøgning forberede 400 ml.
2. Hæld agar ved 50 ° C (side-hot) på en separat 33 cm x 33 cm acrylic-glasplade. Overfladespændingen af ​​agar og dermed temperaturen vil definere tykkelsen af ​​agar plade. Ved 50 ° C er 2 mm tykke agar plader opnået. Må ikke agitere efter kogning og hæld hele tiden for at undgå bobler. Forbered friske agar plader for hver billeddannelse periode på omkring 4 timer.
3. Fyld standard 6 cm petriskåle med de resterende 0,8% agaropløsning at sortere, ren og vænne larver før forsøget (1 skål pr genotype).
4. Hvis der er behov for et afskrækningsmiddel agar barriere for anvendelsen Fortsæt til afsnit 3.
5. Skær ca. 2 cm af omkredsen af ​​agar plade for at opnå en plan kvadratisk overflade til optagelse. Fjern overskydende agar.
   BEMÆRK: Størrelsen er afhængig af anvendelsen.
6. Overfør agar plade til FIM setup direkte efter afkøling ved forsigtigt at skubbe glidende agar over kanten af ​​akryl glasplade.

3. Valgfrit: Tilføjelse et afskrækningsmiddel Agar Barrier til Crawlange Surface (Salt Agar)

1. Kog 2,5% fødevarekvalitet agar med 3 M NaCI i deioniseret ultrarent vand. Til screening i en varme gradient forberede 200 ml.
   BEMÆRK: Lydstyrken afhænger af anvendelsen.
2. Skær en 2 cm bred hak i den tidligere hældes kravle overflade omgiver synsfeltet (22 x 22 cm).
   BEMÆRK: Forskellige barriere former og synsfelter kan være påkrævet afhængigt af anvendelsen.
3. Fyld hak med salt agar 0,1-0,3 cm højere end sporing overflade.

4. Fly Handling

1. Rear flyver i 25 ° C inkubator med 12 timers lys / mørke cyklus justeret til eksperimentet tid på standard flyve mad på 65% luftfugtighed.
2. For kors, bedøver 30 jomfruelige kvindelige fluer og 8 hanner med CO ₂ og krydse dem i 130 ml kultur hætteglas med 35 ml mad.
   BEMÆRK: En 130 ml kultur hætteglas med 35 ml mad vil give omkring 20-30 lspiste tredje stadie larver i imaging span 4 timer. Imaging og sporing værker for alle larver stadiums etaper.
3. Drop lidt vand i kultur hætteglas til at køre sent tredje stadie larver bevægelse og indsamle det største larver fra hætteglas vægge ved hjælp af en lille pensel.
4. 2-5 min før optagelse, overførsel larver for en video til en Petri-skål indeholdende 0,8% fødevaregodkendt agar i deioniseret ultra rent vand til at vænne og rense dem.

5. Justering af FIM Imaging Opsætning til optagelser (Ikke Stimulus betingelser)

1. Juster kameralinsen fokus og blænde, hvis nødvendigt. Indstil eksponeringstiden for den pågældende kamera.
   BEMÆRK: Disse indstillinger behøver ikke at blive ændret under et eksperiment.
2. Juster belysning intensitet for at opnå god kontrast ved billeddannelse en larve.
3. Hold miljøforhold i rummet konstant under optagelser. Mørkere rummet for ikke at forstyrre larver med retningsbestemt lys.

6. Valgfrit: Justering af FIM Imaging Opsætning til optagelser (Gradvis Temperatur Stimulus betingelser)

BEMÆRK: varme gradient enhed er en 42 x 42 x 0,2 cm ³ aluminiumsplade med en mat sort maling og isolering materiale på toppen stedet. Pladen perfunderet med vand fra to forskellige kredsløb forbundet til kaloriferer / kølere og pumper ved begge ender (se figur 1B). Temperaturerne kan reguleres fra -5 til +50 ° C.

1. Tænd for varmen gradient enhed 1 time før eksperimenterne og placere den over opsætningen for at tillade oprettelse af den ønskede temperatur profil og komponenter i ligevægt.
2. Overfør kravlende overflade agar med salt barriere for opsætningen.
3. Placer radiator plade over agaren og justere afstanden mellem pladen og crawling overflade til 2 mm (~ 1 mm over larver).
4. Etablere en lineær gradient afpå mindst 0,8 ° C / cm fra 34 ° C (ca.. 2 cm fra barriere i synsfeltet) til 18 ° C (ca.. 2 cm fra barrieren ved den modsatte side i synsfeltet) ved at justere Temperaturen af ​​vandkredsløb til 1 ° C og 45 ° C.
   BEMÆRK: Forskellige gradient egenskaber metalpladen kræver forskellige temperaturer, som skal konstateres empirisk. Disse indstillinger behøver ikke at blive ændret i løbet af forsøgene.
5. Juster indstillingerne som beskrevet i afsnit 5.
6. Lad kravlende overflade i ligevægt i gradienten før eksperimenter i 20 min. Test temperaturgradient med et pyrometer.
7. Fortsæt med afsnit 8.

7. FIM Imaging (Ikke Stimulus betingelser)

1. Brug en lille våd pensel til forsigtigt samle 15 larver fra tilvænning petriskåle og overføre dem til midten af ​​sporing overflade. Overfør ikke madrester eller for megetvand (se 7.8).
2. Optag 1-50 larver på en 22 cm x 22 cm sporing område. Brug 15 dyr pr video til de fleste screening applikationer (af statistiske grunde bruge mindst 100 individer pr genotype).
3. Forsigtigt adskille larver og vente ca. 10-20 sek indtil alle larver begyndte at bevæge sig lige før optagelse.
4. Optag larver bevægelse i 2 minutter ved 10 billeder per sekund for ikke stimulus betingelser. Brug ukomprimerede tif billeder som output format.
5. Under optagelse, indsamle larver til den næste video fra hætteglas til at vænne dem Kritisk:. Forstyr ikke indspillet larver med lys.
6. Efter optagelsen fjerne larver med en stor pensel og kassere dem i overensstemmelse med de lokale sikkerheds- og lovgivning regler.
7. Efter fjernelse larver Brug pensel til at rense og fugte den kravlende overflade med ultra rent demineraliseret vand.
8. Kritisk: Hold overfladen fugtig på alle tidspunkter, men undgå overdreven moisture, der kan ses som glorier eller dråber omkring larver i optagelser og forstyrre tracking.

8. Valgfrit: FIM Imaging (Gradvis Temperatur Stimulus betingelser)

1. Efter temperaturgradienten er etableret (se afsnit 6), forberede optagelsen software til øjeblikkelig optagelse inden 20 sek efter anbringelse af larverne på crawling overflade (se 8.2) fx indstille antallet af billeder pr video og definere besparelse sti.
2. Løft radiator pladen lidt og placer larver ved 33 ° C 2 cm fra salt barriere. Se 6. og 7. for yderligere generelle instruktioner. Sænk radiator plade igen og starte optagelse i 3-4 min direkte efter larver begyndte at bevæge sig lige.
3. Efter optagelsen fjerne larver direkte, ren og fugter overfladen. Rør ikke ved salt agar for at undgå spredning af NaCl.
4. Kritisk: Hold overfladen fugtig på alle tidspunkter, men undgåfugt, der kan ses som glorier eller dråber omkring larver i optagelser og forstyrre tracking.
5. Lad agaroverfladen i ligevægt igen efter fugtgivende for 1-2 min, mens du gemmer billeder og indsamle nye dyr, før forberedelserne til næste video. Styr temperaturgradient under anvendelse af en pyrometer hver 5 videoer og justere temperaturen enheden, hvis det er nødvendigt (vandtemperatur, højde og xy orientering i forhold til sporing overflade).

9. Sporing af Larve Locomotion

BEMÆRK: For flere detaljer henvises til den vedlagte manual for FIMTrack (tillæg). For et program rutediagram se figur 2.

1. Juster sporing parametre for de respektive eksperimenter med preview mulighed.
   1. Juster pixel per cm efter kamera og synsfelt.
   2. Juster billeder pr sekund baseret på kameraindstillingerne.
   3. Juster lysstyrke tærskler så thpå alle dyr registreret korrekt (feedback gives i preview).
   4. Juster størrelsestærskler larver område. Bemærk feedback option i preview: enkelte dyr er markeret med gult, kolliderende larver er fremhævet med rødt og området for hvert dyr findes i blå.
2. Begynde at spore ved hjælp af knappen i nederste højre.
   BEMÆRK: Efter en vellykket sporing, er et billede featuring larver spor og en CSV-fil, der indeholder de beregnede bevægelseskomponenter og kropsholdning funktioner gemt i billedet bibliotek.
3. Brug FIM Results viewer modul (Rediger> Resultater Viewer ...) at gennemgå og justere tracking manuelt resultater. Hvis det er nødvendigt, at definere stimulus regionerne at vurdere data i forhold til stimulus regime f.eks kravle orientering i forhold til varme gradient eller afstanden til et lugtstof kilde. For mere detaljeret beskrivelse, så benyt manuel (supplement).

10. Evaluering af data

1. Importer CSV-filen i Excel, Matlab eller ethvert andet program til videre statistisk analyse.

Representative Results

Til billeddannelse flere forskellige kameraer med forskellige egenskaber opløsning blev testet (Figur 4). Alle kameraer hvor udstyret med en passende IR-filter. Ifølge den lave opløsning af det billigste kamera i denne test, er synsfeltet begrænset til 10 cm x 10 cm. De bedste resultater blev opnået ved anvendelse af en 4 megapixel (MP) kamera. Dette fører til en opløsning på 100 pixels per tredje stadie larver længde og fik lov til let genkende interne strukturer. Derudover kan peristaltik af dyret let ekstraheres (figur 4A). Men man kan stadig få høj kontrast film ved hjælp af som også kan analyseres af FIMTrack billigere kameraer,. Ved hjælp af en 1,4 MP kamera med en dybde på 8 bit og en opløsning på 1.392 x 1.040 pixels er omkring halvdelen af ​​prisen og tillader en opløsning på 45 pixels pr tredje stadie larver længde i synsfeltet. Hovedet men ingen andre interne strukturer kan genkendes (figur 4B). Sporing og detektion af peristaltikken er mulig, men nøjagtigheden er reduceret (figur 4B).

Med en endnu billigere 0,8 MP kamera med en rumlig opløsning kan sammenlignes med de 1,4 MP kamera, kan den larve hoved ikke genkendes trofast længere (figur 4C). Sporing og peristaltikken analyse er mulig, men herunder mere jitter baseret på øget støj. Overraskende, selv en lav opløsning USB webcam giver tilstrækkelige kvalitet film til at beregne larvernes baner (0,3 MP kamera, under 20 €, Figur 4D). Peristaltikken kan beregnes ud fra området, men målinger er meget støjende.

I vores setup vi rutinemæssigt bruge 4 MP kamera. For screening tillader dette kamera overvågning af en 22 cm x 22 cm arena, hvilket naturligvis giver mulighed for at analysere et stort antal dyr samtidigt, således at high throughput analyse er mulig. Ved hjælp af denne indstilling, larvernes længde is ved 40 pixels, som stadig tillader registrering og analyse af peristaltikken. Et eksempel billede af 15 larver baner i en varme gradient er givet i figur 5A. Desuden er anvendelsen af en makro linse gør det muligt at billedet larver med meget høj opløsning, hvor mange interne organer bliver synlige og hoved anerkendelse forbedres yderligere (figur 5B). Desuden disse kan bruges til yderligere mere detaljeret analyse af adfærd af en bred vifte ^20. Det samme setup kan nemt bruges til billedet kravle C. elegans orme (figur 5C).

Figur 4. FIM billedbehandling og sporing resultater for forskellige kameraer. (A) Venstre: FIM billeddannelse af tre larver kravler på en 10 cm x 10 cm sporing fase fanget ved hjælp af en 4 MP kamera med 10 fps. Mid:Klipning og tyngdepunkt bane af en enkelt larve. Det område af dyret er angivet. Til højre: Et område med larve plottet over 100 frames. Den røde pil angiver tidspunkt for klippet billede. (B) Svarer til (A), men taget med en 1,4 MP kamera. (C) Svarer til (A), men taget med en 0,8 MP kamera. (D) Svarer til ( A), men taget med en 0,3 MP kamera. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 5. Heat stimulus og høj opløsning applikationer. (A) Heat stimulus ansøgning (sammenlign figur 1). Flyveveje, der beregnes via FIMTrack. (B) Høj opløsning ansøgning billede af en tredje, anden og første stadie larve ved hjælp af et makroobjektiv. Den tredje stadie larver længde er repræsenteret ved 400 pixels i et synsfelt på 2,5 x 2,5 cm. (C) en C. elegans orm taget med FIM billeddannelse. Er angivet Scale barer. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Discussion

I Biologisk psykologi er det obligatorisk at kvantitativt dechifrere komplekse adfærdstræk. Er behov Således må et stort antal personer blive observeret ved høj opløsning og automatiserede procedurer til statistisk analyse. Her er FIM billeddannelse beskrevet, en roman, enkel og robust imaging setup, som giver mulighed for at overvåge bevægelse af en bred vifte af dyr. Effekten af FIM imaging setup blev testet under anvendelse Drosophila larver, planarian fladorme og C. elegans orme. FIM teknologi giver iboende høj kontrast til påvisning selv interne strukturer i de dyr, såsom hjerne, trachea, tarmen eller proventriculus. Vigtigere er disse interne strukturer robust identificeres, således at de kan tjene til automatisk at identificere orienteringen af dyret ^19.

Kvaliteten af ​​film kan påvirkes af overdreven mængde vand på crawling overflade. Således er det vigtigt atstyre fugten i agar. For gammel agar eller for meget vand på overfladen kan forårsage artefakter. Ligeledes sikre, at ingen luftbobler er inkluderet i crawling overflade. Generelt er en velforberedt agaroverfladen tillader optagelse af film i 4 timer.

På grund af de underliggende fysiske principper FIM billeddannelse genererer næsten støjfrit billede optagelser, hvilket resulterer i en fantastisk billedkvalitet. Dette på sin side letter efterfølgende computerbaseret billedanalyse og muliggør high throughput. Imidlertid er metoden begrænset til analyse af dyr, der direkte kontakt agaroverfladen. Den tracking software udfordres af dyr, der udgør en doughnut form. Selv om en binær indikator genkender doughnut form, kan en forkert rygsøjlen beregnes.

På grund af den modulære opbygning af tracking bordet dobbelt og tredobbelt farve imaging er inden for rækkevidde. Desuden kan yderligere stimuli (lys, lugtstoffer, elektrisk eller mekanisk stimuli) nemt være delivered ovenfra. Det FIMTrack program designet til at matche magt FIM billeddannelse kan let vedtaget at spore Drosophila larver, C. elegans eller planarierne. Således og på grund af sin enkle og billige konstruktion (se http://FIM.uni-muenster.de), FIM billeddannelse er muligt for en bred vifte af biomedicinske anvendelser og giver navnlig et presserende behov for højt gennemløb studier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FIM setup	Custom		details for construction or purchase of setups is available upon request
Acrylic glass plate	Custom		Additional for agar pouring
Heat radiator plate	Custom		Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting
Water calorifier/cooling pumps and hoses	Custom		based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013)
Standard Camera (4 MP)	Basler	acA2040-25gm	Camera defaultly used for the FIM setup
Test Camera (1.4 MP)	QImaging	1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO)	Camera used for comparison
Test Camera (0.8 MP)	Point Grey	Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS)	Camera used for comparison
Test Camera (0.3 MP)	Sony	PS Eye USB2.0 camera	Camera used for comparison
Computer	Custom		equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [>1TB]
Standard Fly food	Custom
Standard Fly vials 135 ml	Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany	78,895
Petri dishes 9 cm	Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany	821,473
Ultrapure deionized water	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	Synergy
NaCl	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	3957.2
Food grade agar	AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany	A0917,5000
Paintbrush (small and large)	Milan	Aquarell 310 Size 0 and 2
Pyrometer	Trotec	BP20