Summary
Bu iletişim kuralı H2O2 Yerelleştirme Solea senegalensis sperm hücreleri hassas fluorochrome DCFH-DA ROS, mitokondri için canlı mitokondri leke ve DAPI için çekirdek için kullanma içinde algılamak için detaylı bir metodoloji açıklar görselleştirme, anılan sıraya göre. Protokol taze ya da çözdürülen sperm hücreleri ile 2 saat içinde yapılması için tasarlanmıştır.
Abstract
Oksidatif stres sperm kalitesini azalan en önemli faktörlerden biridir. Reaktif oksijen türleri (ROS) sperm hücreleri içinde algılamak için etkin iletişim kuralları geliştirme herhangi bir tür yüksek öneme sahip olduğunu, ancak bu yöntemler sık kullanılmayan ve teleost içinde daha az. Dondurma gen bankacılık dahil olmak üzere farklı amaçlar için yararlı bir yöntem su ürünleri içinde ve sperm kullanılabilirlik yıl boyunca garantili. Yordamlar donma/çözülme ROS üretimin neden ve sperm hücrelerine de zarar. Göz önüne alındığında bu potansiyel zarar ROS üretim aşırı onların yerelleştirme bağlı olarak sperm H2O2 algılamak ve hücre içi onun yerelleştirme tarafından confocal mikroskobu değerlendirmek için detaylı bir metodoloji neden sağlanır. Bu amaçla, 3 fluorochromes (2 ', 7 '-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), bir canlı mitokondri leke ve 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)) bir arada ortak Yerelleştirme2 H2O değerlendirmek için kullanılır sperm hücreleri çekirdek veya mitokondri Solea senegalesis sperm örnekleri ile.
Introduction
Reaktif oksijen türleri üretim sperm kalitesi ile bağlantılı son zamanlarda1. Ne kadar ROS üretim mitokondri içinde normal bir fizyolojik süreç olarak, ROS üretim aşırı Oksidatif Stresin farklı düzeylerde sperm hücreleri hasara açık bir nedenidir. İnsanlarda, oksidatif stres hareketliliği ve yetenek capacitation2geçmesi için değiştirme erkek infertilitesi ile ilişkilidir; Memelilerde, DNA bütünlük içinde donmuş sperm örnekleri değişikliği de H2O23sentezi için ilgili olmuştur.
Dondurma yetiştiricilik bankacılık gen için ortak bir tekniktir. Bu teknoloji özellikle türlerin Solea senegalensisgibi üreme sorunları ile önemlidir. Piyasada değerli bu türün üreme disfonksiyon bireylerde tutsak Kur eksikliği nedeniyle tarihi gösterir. Bu gerçeği sperm dondurma sperm durumu Yapay döllenme için gerekli kılar. Ancak, dondurma gibi çalışmalar antioksidan takviyesi faydalı etkisini bildirdin bu spermlerin4 için zararlı olabilir oksidatif stres kaynağı olacaktır. ROS inhibisyonu yoluyla mitokondrial hedefli antioksidan bildirildi sperm dondurma sarı yayın balığı5için faydalıdır.
Bu nedenle, ROS seviyelerinde sperm örnekleri bu moleküller sperm hayatta kalma ve üreme8için bir dezavantaj olarak kabul edilmiş, özellikle dondurma6,7 sonra bilmek önemlidir. Ayrıca, ROS dağıtım hücre içinde eğitim potansiyel hasar düzeyi anlaması çok önemli olabilir. Örnek olarak, ROS seviyesinin düşük mitokondri içinde normal ve uyumlu sperm fonksiyonu ile kabul edilebilir ama ROS yüksek düzeyde çekirdek içinde Sperm DNA hasarı belirtileri olabilir. H2O2 mitokondri yayımlanan olabilir ve bir küçük ve ücret daha az molekül9olduğu için çekirdek nüfuz en alakalı ROS biridir. Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) özellikle hücre içi peroksit yeşil Floresans yayan ortaya çıkarabilir. Bu makalede, H2O2 hücre içi Yerelleştirme Solea senegalensis sperm confocal mikroskobu kullanılarak tespit için detaylı bir protokol sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Fluorochrome kuluçka ve confocal analiz en az 2-3 h bir kontrol ve bir tedavi örnek alacak. Veri işleme bu zaman hesaplamaya dahil değil. Gerekli malzemeler Malzemeler tablobulunabilir. Bu iletişim kuralı için taze veya cryopreserved sperm uygulanabilir. Solea senegalensis soğuk suda, iş her zaman soğuk koşullarda (4-7 ° C) olarak çoğaltılır bir balık türüdür. Protokol genel görebilmek için bkz: şekil 1 .
1. hazırlık çalışmaları daha önce deneme
- 1 bir mitokondri leke mM analitik sınıfta DMSO hisse senedi çözüm hazırlamak.
- 1 μg/mL ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) hisse senedi çözüm deiyonize su hazır olun.
- Bir 200 mOsm/kg zil çözüm (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7,7) hazırlamak
- 4 mM 2 ', 7 '-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) hisse senedi çözüm analitik sınıf metanol içinde hazır olun.
Not: stok çözümleri-20 ° C de ihtiyaç kadar aliquots içinde tutun. - 4-7 ° C'de microcentrifuge ayarla
2. numune hazırlama Fluorochrome kuluçka önce
Not: Pipetting ve resuspending nazik sperm kullanımı tercih edilir.
- Eğer cryopreserved hücrelerle çalışma, bir su banyosu Solea senegalensis sperm1040 ° C'de çözdürme için hazır olun. Su banyosu için 7 saman örneklerinde bırakın s.
- Kesmek için makas kullanırken, örnek bir microfuge tüp içine boşaltın ve vasıl 1000 x g, 4-7 ° C için 1 dk santrifüj kapasitesi.
- Seminal plazma veya cryoprotectants ile seminal plazma cryopreserved örnekten boyama protokolüyle engelleyebilir herhangi bir bileşeni atmak için pipetting tarafından kaldırın.
- 50-100 μL 4 ° C 200 mOsm/kg zil çözüm hücrelerde resuspend.
- Bir Neubauer veya bir stereoskopik mikroskop altında benzer bir sayım odası ile sperm konsantrasyonu belirlemek.
- 1-2 x 106 hücre/mL 0.5 mL 4 ° C'de zil çözüm son hacmi kadar hücre süspansiyon oranında seyreltin.
3. fluorochrome kuluçka
Not: Fluorochromes, düşük ışık koşullarında, çözümde özellikle ne zaman ele gerekir.
- DCFH-DA hisse senedi çözüm 3.125 μL ekleyin (örnekteki son konsantrasyonu: 25 mikron) çalışma Numune dilüsyonu için. 4-7 ° C'de karanlık1040 min için kuluçkaya.
- 30 dakika sonra 0.5 μL DAPI hisse senedi çözüm ekleyin (örnekteki son konsantrasyonu: 2 mikron) ve hisse senedi çözüm leke 0.5 μL mitokondri, (örnekteki son konsantrasyonu: 100 nM) örnek. Her iki fluorochromes 10 dk için karanlıkta kuluçkaya.
4. numune hazırlama için Confocal mikroskobu
- Kuluçka süresi sonra santrifüj kapasitesi 1000 x g, 4-7 ° C için 1 dk de hücre süspansiyon.
- Süpernatant dikkatle pipetting tarafından atmak.
- 10-20 μL 200 mOsm/kg zil çözüm ekleyin.
- Yer 5 μL konsantre hücre süspansiyon, bir slayt üzerinde bırakın.
- Dikkatle, hazırlık kapak slaytta koymak ve Lehçe ile kapatın. Lehçe kuru olduğunda, hazırlık confocal mikroskopi için hazırdır.
5. confocal Kur deneme önce
Not: mikroskop bağlı olarak DCFH-DA "yanmış". En iyi koşullarda bir sigara çok değerli örnek ile önce kurun.
- Mikroskop, lazerler, kamera ve mikroskop bilgisayarı açın.
- Her fluorochrome uyarma ve emisyon maximums dikkate alarak uyarma lazerler ayarlayın:
- Bir uyarma en çok 358 DAPI için kullanmak nm ve emisyon en fazla 465 nm.
- Mitokondrial leke için bir uyarma en çok 644 kullanmak nm ve emisyon en fazla 662 nm.
- DCFH-DA, bir uyarma en çok 504 kullanmak nm ve emisyon en fazla 525 nm.
- Sperm hücreleri üzerinde odaklanmak için 25 X amacı ile çalışmaya başlamak. Bu fluorochrome en yüksek yoğunluk raporları, çünkü odak DAPI kanala seçin. Hücreleri odaklandık sonra Solea senegalensis sperm hücreleri boyutu yaklaşık 2 mikron olduğundan, 63 X veya 100 X amacı ayrıntılı bir değerlendirme için kullanabilirsiniz.
- Her kanal için iğne deliği ve sondaj, kazanç ve gerilim en iyi duruma getirme. Aynı şekilde, arka plan azaltmak için dijital ofset ayarlayın. Bir kez tüm parametreleri kullanılan fluorochrome için optimize edilmiş, ayarları kaydedin. Tek bir için bir rutin deney Solea senegalensis sperm hücresi (Bu parametreler her deneyde değişebilir) aşağıdaki kullanılan: 1 ve kazanç gerilimi 750 V iğne deliği.
6. görüntüleri edinimi
- Resim alma için istenen kalite koşullarını seçin. Bit derinliği, görüntü biçimi, hafif levha kalınlığı gibi satın alma ayarlarını tanımlayın ve tek taraflı aydınlatma seçin. Tek bir için bir rutin deney Solea senegalensis sperm hücreleri (Bu parametreler her deneyde değişebilir) aşağıdaki kullandık: çerçeve boyutu 1024 piksel; 16 bit / piksel; tarama hızı 2-4).
- Açın ve başlamak ve alan görüntüsünü almak için tarama alanını Merkezi.
- Kırpma aracını kullanarak, ilgi bölge seçin ve canlı basın.
- Aralığı gösterge aracı yardımıyla arka plan azaltmak için dijital ofset ayarlayın. Her kanal için bunu ve görüntü al.
- Her fluorochrome ve onların birleştirme için bireysel kanalları kalitesini kontrol edin.
7. bir 3D görüntü Video oluşturma
- Z-yığın alma ayarları.
- Yazılımda Z-yığın seçeneği.
- Tek hücre, hücre grubunu veya bölge ilgi seçin ve odaklanır.
- Z-yığın 'First Slice' ve 'Son dilim' seçenekleri ile sınırlandırmak ve aralığı iyi odak yardımıyla 0.2 µm için z adıma kurmak. Bu fluorochrome en yüksek yoğunluk bildirebilir ve kolayca tüm sperm kafa seçebilirsiniz çünkü odaklanmaya DAPI kanalını seçin. Her kanal için en iyi satın alma parametrelerini seçin ve deneme çalıştırın.
- Z-yığın denemeyi çalıştırmak. Kanalları bölünmüş ve her sinyal hücrelerindeki lokalizasyonu gözlemlemek.
- Z-yığın işlemi.
- Birim render: deneme tamamlandığında, Z-yığın işleme yazılımı seçenekleri seçin ve toplu oluşturun seçeneğini seçin. Adımlar ve döndürme derece (360 °) sayısını seçin. Dosyayı bir video uzantısı ile kaydedin.
- Anaglify: anaglify seçeneği process penceresine. Bu araç bir 3D görüntü split kanallı video oluşturmanızı sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Confocal mikroskobu teleost sperm hücre içi ROS değerlendirme için ideal bir yöntemdir. Bu çalışmada (şekil 1) sunulan üç fluorochromes (DAPI, bir mitokondri leke ve DCFH-DA) temel araştırma uygulanabilir ve uygulama içinde kullanılan yordamlar geliştirmeye sahip olamaz birçok yararlı bilgi sağlar endüstriyel su ürünleri tesisleri, dondurma iletişim kuralları gibi. Analiz türleri farklı yürütülen hücre içi ROS varlığı ve diğer parametreleri ilişkilendirmek için: hareketliliği, canlılığı, iyi ve kötü doğurmak, harekete geçirmek hareketliliği veya mevsimlik sperm varyasyonları arasında diğerleri arasında farklı desenler. Mevcut çalışma, hücre içi H2O2 dağıtım sperm hücreleri içinde iki farklı desen gösterilir: mitokondri veya formada (Şekil 2, 3) çekirdeği ile collocated. ROS tarafından üretilen düşük olası hasara gösterilen bu spermlerin DNA hasar olanlara DCFH-DA da çekirdekleri içinde etiketleme gösterdi, ancak yalnızca mitokondri içinde DCFH-DA etiketleme gösterdi. Confocal mikroskobu yazılım yararlı videoları oluşturmak ve kolay ve hızlı colocalization grafikler sağlamak için sağlar.
Resim 1 . Protokol genel bir bakış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Confocal resim alma örneği. Örnek B. A. düzeni DAPI kanal (dsDNA etiketleme). C. kanal (mitokondri etiketleme) mitokondri leke. ö Mitokondri DAPI kanal ile birleştirilmiş kanal leke. E. DCFA-DH kanal (hücre içi H2O2etiketleme). F. DCFA-DH kanal DAPI kanal ile birleştirilir. G. üç kanallarını birleştirme. Kısaltmalar: n: hücre çekirdeği, mt: mitokondri, f: kamçı ve mb: membran. Ölçek çubuğu: 5 mikron. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Hücre içi H2farklı desenlerO2 içinde Solea senegalensis sperm hücreleri (birim render). Hücre içi ROS nükleer fossa ve mitokondri (A, C, E) gösterilen sperm elde edilen kanalları. Elde edilen kanalları gösteren hücre içi H2O2 (B, D, F) hücre çekirdeği içinde de sperm. A ve B: DAPI. C ve D: DCFH-savcı E ve F: mitokondri leke. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İyi mitokondri sperm motilitesi ve fonksiyon için anahtar organelleri vardır bilinmektedir. Bu organelleri aynı anda doğrudan ROS üretim söz konusu. İlginçtir, ROS kontrollü düzeyde uygun sperm fonksiyonu1için ihtiyaç vardır. Doğurganlık ve oksidatif stres arasında olumlu ilişkiler memeliler11 ' de gösterilen ama sperm kalitesi12aşırı düzeyleri etkiler. Doğru pozitif veya negatif etkisi belirleyici olabilir bir önemli bir faktör sadece ROS düzeyleri aynı zamanda ROS hücre içi yerelleştirme çünkü. ROS zararlı etkilerinden biri DNA hasarı9 üretiyor ve ROS düzeyleri mitokondri içinde normal olabilir, ancak bu nedenle ROS nükleer varlığı çekirdeği potansiyel zarar bir göstergesi olabilir. ROS hücre içi yerelleştirme hakkında bilgi sağlayan confocal mikroskobu gibi teknikler ile mevcut nicel yöntemler (örneğin, Akış Sitometresi) tamamlamak gereklidir.
Confocal mikroskobu ROS hücre içi lokalizasyonu görselleştirmek için en uygun bir seçenektir. Bir canlı mitokondri leke ve DAPI gibi belirli fluorochromes kullanımı mitokondri ve çekirdek görselleştirme sırasıyla ve peroksit hücre içi lokalizasyonu DCFH-DA bu moleküller kombinasyonu sağlar.
İletişim kuralına kritik adımlar fluorochrome kuluçka ve confocal kurulum içindir. Her iki adım optimize ve dikkatli bir şekilde tekrarlanabilir ve tutarlı sonuçlar elde etmek için yapılır. Metodoloji değişiklikler, bu iki düzeyde kullanılan seminal plazma bağlı olarak yapılmalıdır. Bu nedenle, fluorochrome kuluçka adapte olmalıdır. Sıcaklıklar ve saklama koşulları sperm örnekleri arasında önemli ölçüde farklılık gösterebilir ve iletişim kurallarının çoğu memeliler için optimize edilmiştir.
Burada, teleost sperm örnekleri, Solea senegalensis sperm hücreleri, özellikle için bir protokol anlatılan (şekil 1). Başarılı etiketleme çekirdekleri ve mitokondri gerçekleştirdik açıklanan protokolünü kullanarak ve ROS varlığı ortaya edilmiş DCFH-DA (Şekil 2) kullanarak. Sonuçlar gösterir o eş yerelleştirme H2O2 bulundu çekirdeği veya mitokondri bağlı olarak sperm örneği (şekil 3). Daha önce açıklandığı gibi bu örnekleri ROS yüksek düzeyde çekirdek içinde görüntüleme sperm oranı yüksek olan DNA hasar eğilimli olacaktır. Bu iletişim kuralının bir benzersiz sınırlama, pahalı ekipman (confocal mikroskop), şartı vardır ama ROS düşük varlığı içinde dondurma amaçlar için çekirdek ile sperm örnekleri seçiminde gelecekteki yarar olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
AQUAGAMETE SK 1205 maliyet eylem teşekkür ediyoruz. Bu eser mali AGL201568330-C2-1-R project (MINECO/FEDER) tarafından desteklenmiştir. David G. Valcarce cunta de tarafından finanse edilen Castilla y Leon (EDU1084/2012) ve Fondo sosyal Europeo. Yazar Dr. Ana Riaza ve Stolt deniz çiftlik S.A., Dr Paulino de Paz, Dr Ignacio Martínez Montero ve José Ramón Guiérrez kabul edersiniz. Biz de videografisi için Paula Fernández Colado teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O'Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
- Zhu, Z., et al. Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action. PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).
- Fang, L., et al. Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish. Cryobiology. 69 (3), (2014).
- Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
- Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm. Theriogenology. 73 (3), (2010).
- Guthrie, H. D., Welch, G. R. Effects of reactive oxygen species on sperm function. Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).
- Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
- Valcarce, D. G., Robles, V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa. Reproduction. 152 (5), (2016).
- Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
- Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).
