Summary
इस प्रोटोकॉल का पता लगाने के लिए एक विस्तृत पद्धति का वर्णन करता है H2O2 स्थानीयकरण के भीतर Solea senegalensis शुक्राणु का उपयोग कर एक संवेदनशील fluorochrome DCFH के लिए-DA, ROS के लिए एक जीवित mitochondria दाग mitochondria के लिए, और DAPI नाभिक के लिए दृश्य, क्रमशः । प्रोटोकॉल के लिए या तो ताजा या गल शुक्राणु के साथ 2 घंटे के भीतर प्रदर्शन किया जा बनाया गया है ।
Abstract
ऑक्सीडेटिव तनाव शुक्राणु की गुणवत्ता को कम करने में महत्वपूर्ण कारकों में से एक है । शुक्राणु में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) का पता लगाने के लिए कुशल प्रोटोकॉल का विकास करना किसी भी प्रजाति में उच्च महत्व का है, लेकिन इन तरीकों का शायद ही कभी उपयोग किया जाता है और teleost में भी कम । Cryopreservation विभिंन प्रयोजनों के लिए जलीय कृषि में एक उपयोगी तकनीक है, जीन बैंकिंग और गारंटी शुक्राणु उपलब्धता सहित साल भर । ठंड/गल प्रक्रियाओं ROS उत्पादन और शुक्राणु कोशिकाओं को नुकसान हो सकता है । भावी क्षति को ध्यान में रखते हुए कि ROS उत्पादन के एक अतिरिक्त शुक्राणु में अपने स्थानीयकरण के आधार पर हो सकता है, यहां एक विस्तृत पद्धति एच2ओ2 का पता लगाने और फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा अपनी intracellular स्थानीयकरण का मूल्यांकन करने के लिए उपलब्ध कराई गई है । इस प्रयोजन के लिए, 3 fluorochromes (2 ′, 7 ′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), एक लाइव mitochondria दाग और 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)) का संयोजन करने के लिए एच2ओ 2 के सह-स्थानीयकरण का मूल्यांकन किया जाता है शुक्राणु नाभिक या mitochondria में Solea senegalesis शुक्राणु के नमूनों के साथ ।
Introduction
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन शुक्राणु की गुणवत्ता के साथ हाल ही में जोड़ा गया है1। हालांकि mitochondria में ROS उत्पादन एक सामांय शारीरिक प्रक्रिया माना जा सकता है, ROS उत्पादन की एक अतिरिक्त द्वारा ऑक्सीडेटिव तनाव विभिंन स्तरों पर शुक्राणु में नुकसान का एक स्पष्ट कारण है । मनुष्यों में, ऑक्सीडेटिव तनाव पुरुष बांझपन के साथ जुड़ा हुआ है, फेरबदल गतिशीलता और क्षमता से गुजरना करने के लिए2; स्तनधारी, जमे हुए शुक्राणु नमूनों में डीएनए अखंडता के परिवर्तन भी एच2हे23के संश्लेषण से संबंधित किया गया है ।
Cryopreservation जलीय कृषि में जीन बैंकिंग के लिए एक आम तकनीक है । यह तकनीक Solea senegalensisजैसी प्रजनन समस्याओं के साथ प्रजातियों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । बाजार में इस मूल्यवान प्रजातियों अदालत की कमी के कारण कैद में पैदा हुए व्यक्तियों में प्रजनन रोग से पता चलता है । इस तथ्य को शुक्राणु cryopreservation कृत्रिम निषेचन के लिए शुक्राणु की उपलब्धता आवश्यक बनाता है । हालांकि, cryopreservation ऑक्सीडेटिव तनाव का एक स्रोत है कि शुक्राणु4 के लिए हानिकारक हो सकता है के रूप में अध्ययन एंटीऑक्सीडेंट पूरकता का एक लाभकारी प्रभाव की सूचना दी है हो सकता है । mitochondrial के माध्यम से ROS निषेध-लक्षित एंटीऑक्सीडेंट पीला कैटफ़िश में शुक्राणु cryopreservation के लिए कथित तौर पर फायदेमंद था5.
इसलिए, शुक्राणु के नमूनों में ROS के स्तर को जानने के लिए महत्वपूर्ण हैं, विशेष रूप से cryopreservation के बाद6,7 क्योंकि इन अणुओं शुक्राणु अस्तित्व और प्रजनन8के लिए एक खामी के रूप में मांयता प्राप्त किया गया है । इसके अलावा, सेल के भीतर ROS के वितरण का अध्ययन करने के लिए संभावित नुकसान के स्तर का अनुमान महत्वपूर्ण हो सकता है । एक उदाहरण के रूप में, mitochondria में ROS के निंन स्तर सामांय और शुक्राणु समारोह के साथ संगत ग्रहण किया जा सकता है, लेकिन नाभिक के भीतर ROS के उच्च स्तर शुक्राणु डीएनए क्षति के संकेतक हो सकता है । एच2हे2 सबसे अधिक प्रासंगिक ROS में से एक है कि mitochondria से जारी किया जा सकता है और नाभिक घुसना क्योंकि यह एक छोटे और आरोप कम अणु9है । Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) विशेष रूप से हरी प्रतिदीप्ति उत्सर्जक intracellular पेरोक्साइड प्रकट कर सकते हैं । इस अनुच्छेद में, एक विस्तृत प्रोटोकॉल का पता लगाने के लिए एच2ओ2 intracellular स्थानीयकरण Solea senegalensis में फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर प्रस्तुत किया है ।
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Protocol
नोट: Fluorochrome और फोकल विश्लेषण एक नियंत्रण और एक इलाज के नमूने के लिए कम से कम 2-3 एच ले जाएगा । डेटा संसाधन इस समय परिकलन में शामिल नहीं है । आवश्यक सामग्री सामग्री की तालिकामें पाया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल को ताज़ा या cryopreserved शुक्राणु पर लागू किया जा सकता है । Solea senegalensis एक मछली प्रजातियों है कि ठंडे पानी में अंडे, ठंडी परिस्थितियों में हमेशा काम (४-७ डिग्री सेल्सियस) है । प्रोटोकॉल के सामांय दृश्य के लिए चित्र 1 देखें ।
1. प्रयोग से पहले प्रारंभिक कार्य
- एक 1 मिमी mitochondria विश्लेषण ग्रेड DMSO में दाग स्टॉक समाधान तैयार करें ।
- एक 1 μg/एमएल 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) पानी में स्टॉक समाधान तैयार करें ।
- एक 200 mOsm/kg रिंगर समाधान (116 mm NaCl, 2.9 mm KCl, 1.8 mm CaCl2, 5 mm HEPES, pH 7.7) तैयार करें
- एक 4 मिमी 2 ', 7 '-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-डीए) विश्लेषणात्मक ग्रेड मेथनॉल में शेयर समाधान तैयार करें ।
नोट: aliquots में स्टॉक समाधान रखें-20 ° c जब तक की जरूरत है । - microcentrifuge को ४-७ डिग्री सेल्सियस पर सेट करें ।
2. नमूना तैयारी Fluorochrome गर्मी से पहले
नोट: शुक्राणु की कोमल हैंडलिंग वांछनीय है जब pipetting और reसस्पैंड ।
- अगर cryopreserved कोशिकाओं के साथ काम करना, Solea senegalensis शुक्राणु10के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर गल के लिए एक जल स्नान तैयार करते हैं । भूसे के नमूनों को जल स्नान में विसर्जित कर 7 एस.
- काटने के लिए कैंची का उपयोग करना, एक microfuge ट्यूब में नमूना खाली और 1000 x g पर, 7 ° c 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
- pipetting द्वारा cryopreserved नमूना से cryoprotectants के साथ लाभदायक प्लाज्मा या लाभदायक प्लाज्मा निकालें किसी भी घटक है कि दाग प्रोटोकॉल के साथ हस्तक्षेप कर सकता है त्यागने के लिए ।
- 4 डिग्री सेल्सियस 200 mOsm/केजी रिंगर सॉल्यूशन के कैलरी μL में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड कर दीजिये.
- एक Neubauer या एक त्रिविम माइक्रोस्कोप के तहत एक समान गिनती चैंबर के साथ शुक्राणु एकाग्रता का निर्धारण ।
- 4 ° c रिंगर समाधान में 0.5 मिलीलीटर के अंतिम खंड में 1-2 x 106 कोशिकाओं/एमएल के लिए सेल निलंबन को पतला ।
3. Fluorochrome की मशीन
नोट: Fluorochromes कम प्रकाश स्थितियों में संभाला जाना चाहिए, विशेष रूप से जब समाधान में ।
- जोड़ें ३.१२५ μL का DCFH-DA स्टॉक समाधान (अंतिम के नमूने में एकाग्रता: 25 माइक्रोन) कार्य नमूना कमजोर पड़ने के लिए । अंधेरे में 40 मिनट के लिए 7 ° c पर मशीन10।
- 30 मिनट के बाद, DAPI स्टॉक समाधान के 0.5 μL जोड़ें (नमूने में अंतिम एकाग्रता: 2 माइक्रोन) और 0.5 μL mitochondria के दाग स्टॉक समाधान (नमूना में अंतिम एकाग्रता: 100 एनएम) नमूने के लिए । गर्मी अंधेरे में 10 मिनट के लिए दोनों fluorochromes ।
4. फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयारी
- मशीन समय के बाद, 1000 x g, 4-7 ° c 1 मिनट के लिए पर सेल निलंबन केंद्रापसारक ।
- pipetting द्वारा supernatant सावधानी से त्यागें.
- 200 mOsm/किलो रिंगर समाधान के 10-20 μL जोड़ें ।
- प्लेस 5 μL एक केंद्रित सेल निलंबन की एक स्लाइड पर छोड़ दें ।
- ध्यान से, तैयारी पर एक कवर स्लाइड रखो और पॉलिश के साथ सील । एक बार पॉलिश सूखी है, तैयारी फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार है ।
5. फोकल सेटअप प्रयोग करने से पहले
नोट: माइक्रोस्कोप पर निर्भर करता है, DCFH-दा "जला" हो सकता है । एक गैर बहुमूल्य नमूना पहले के साथ सबसे अच्छी स्थिति की स्थापना ।
- माइक्रोस्कोप पर मुड़ें, पराबैंगनीकिरण, कैमरा और माइक्रोस्कोप चलाने कंप्यूटर.
- उत्तेजना और प्रत्येक fluorochrome के उत्सर्जन अधिकतम खाते में ले उत्तेजना पराबैंगनीकिरण सेट करें:
- DAPI के लिए, 358 एनएम के एक उत्तेजना अधिकतम और 465 एनएम के उत्सर्जन अधिकतम का उपयोग करें ।
- mitochondrial दाग के लिए, 644 एनएम के एक उत्तेजना अधिकतम और 662 एनएम के उत्सर्जन अधिकतम का उपयोग करें ।
- DCFH के लिए-डीए, 504 एनएम के एक उत्तेजना अधिकतम और 525 एनएम के उत्सर्जन अधिकतम का उपयोग करें ।
- शुक्राणु पर ध्यान केंद्रित करने के लिए 25X उद्देश्य के साथ काम करना शुरू करें । ध्यान केंद्रित करने के लिए DAPI चैनल चुनें क्योंकि यह fluorochrome उच्चतम तीव्रता की रिपोर्ट करता है । एक बार कोशिकाओं को ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, एक गहन मूल्यांकन के लिए एक 63X या 100X उद्देश्य का उपयोग करें क्योंकि Solea senegalensis शुक्राणु आकार के आसपास है 2 माइक्रोन.
- प्रत्येक चैनल के लिए, pinhole, लाभ और वोल्टेज का अनुकूलन । उसी तरह, पृष्ठभूमि को कम करने के लिए डिजिटल ऑफ़सेट समायोजित करें । एक बार सभी मापदंडों fluorochrome इस्तेमाल के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, सेटिंग्स को बचाने के । एक नियमित प्रयोग के लिए एक Solea senegalensis शुक्राणु सेल हम निंनलिखित का इस्तेमाल किया (इन मापदंडों प्रत्येक प्रयोग में बदल सकते हैं): 1 के pinhole और लाभ वोल्टेज के 750 वी ।
6. छवियों का अधिग्रहण
- छवि प्राप्ति के लिए इच्छित गुणवत्ता शर्तों का चयन करें । बिट गहराई, छवि प्रारूप, प्रकाश शीट मोटाई, और एक तरफा रोशनी का चयन की तरह अधिग्रहण सेटिंग्स को परिभाषित करें । एक नियमित प्रयोग के लिए एक Solea senegalensis शुक्राणु हम निंनलिखित का इस्तेमाल किया (इन मापदंडों प्रत्येक प्रयोग में बदल सकते हैं): 1024 पिक्सल के फ्रेम आकार; बिट्स प्रति पिक्सेल 16; 2-4 की गति स्कैन) ।
- खोलें और फ़ील्ड की छवि प्रारंभ करने और लेने के लिए स्कैन क्षेत्र को मध्य करें ।
- फसल उपकरण का उपयोग करना, ब्याज के क्षेत्र का चयन करें और लाइव दबाएं ।
- श्रेणी संकेतक उपकरण की मदद से, पृष्ठभूमि को कम करने के लिए डिजिटल ऑफ़सेट समायोजित करें । प्रत्येक चैनल के लिए यह मत करो और छवि ले ।
- प्रत्येक fluorochrome और उनके संयोजनों के लिए व्यक्तिगत चैनलों की गुणवत्ता की जांच करें ।
7. एक 3 डी छवि वीडियो बनाना
- Z-स्टैक प्राप्ति सेटिंग्स ।
- सॉफ़्टवेयर में Z-स्टैक विकल्प चुनें ।
- एकल कक्ष, कक्षों के समूह या रुचि के क्षेत्र का चयन करें और उसे ध्यान दें.
- z-स्टैक को ' प्रथम स्लाइस ' और ' अंतिम स्लाइस ' विकल्पों के साथ सीमांकित करें और z चरण को ठीक फ़ोकस की सहायता से 0.2 µm तक अंतराल के लिए स्थापित करें । ध्यान केंद्रित करने के लिए DAPI चैनल चुनें क्योंकि यह fluorochrome उच्चतम तीव्रता की रिपोर्ट कर सकता है और आप आसानी से पूरे शुक्राणु सिर का चयन कर सकते हैं । प्रत्येक चैनल के लिए इष्टतम प्राप्ति पैरामीटर चुनें और प्रयोग चलाएं ।
- Z-स्टैक प्रयोग चलाएं । चैनलों भाजित और कोशिकाओं के भीतर प्रत्येक संकेत के स्थानीयकरण का पालन ।
- Z-स्टैक प्रक्रिया ।
- वॉल्यूम रेंडर: प्रयोग समाप्त होने के बाद, Z-स्टैक प्रोसेसिंग सॉफ़्टवेयर के विकल्पों का चयन करें और वॉल्यूम रेंडर विकल्प चुनें. चरणों की संख्या और रोटेशन डिग्री (360 °) का चयन करें । फ़ाइल को वीडियो एक्सटेंशन से सहेजें.
- स्टीरियो anaglyph: विकल्प प्रक्रिया विंडो में स्टीरियो anaglyph चुनें. इस उपकरण के विभाजन चैनल के साथ एक 3 डी छवि वीडियो बनाने के लिए अनुमति देता है ।
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Representative Results
फोकल माइक्रोस्कोपी teleost शुक्राणु में intracellular ROS मूल्यांकन के लिए एक आदर्श विधि है । इस अध्ययन में प्रस्तुत तीन fluorochromes (DAPI, एक mitochondria दाग और DCFH-दा) के संयोजन (चित्रा 1) कई उपयोगी जानकारी है कि बुनियादी अनुसंधान में लागू किया जा सकता है और में इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं में सुधार करने में आवेदन कर सकते हैं प्रदान करता है औद्योगिक जलीय कृषि संयंत्रों, जैसे cryopreservation प्रोटोकॉल । गतिशीलता, व्यवहार्यता, अच्छे और बुरे प्रजनकों के बीच अलग पैटर्न, कई अंय लोगों के बीच गतिशीलता या मौसमी शुक्राणु रूपांतरों के सक्रियकरण: विश्लेषण के विभिंन प्रकार के क्रम में किया जा सकता है intracellular ROS उपस्थिति और अंय मापदंडों सहसंबंधी बनाना । वर्तमान काम में, शुक्राणु के भीतर intracellular एच2ओ2 वितरण के दो अलग पैटर्न दिखाए जाते हैं: mitochondrion या नाभिक में प्रसार के साथ collocated (आंकड़े 2, 3) । उन शुक्राणु कम संभावित ROS द्वारा उत्पादित नुकसान दिखा DCFH-केवल mitochondria में दा लेबलिंग जबकि उन दुख डीएनए नुकसान दिखाया DCFH-दा लेबलिंग भी नाभिक में । फोकल माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर उपयोगी वीडियो बनाने के लिए और आसान और तेजी से colocalization रेखांकन प्रदान करने के लिए अनुमति देता है ।
चित्र 1 . प्रोटोकॉल का सामांय ओवरव्यू । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 . फोकल छवि अधिग्रहण का उदाहरण । क. योजना का नमूना B. DAPI चैनल (्र dsDNA) । C. Mitochondria दाग चैनल (्र mitochondrion) । D. Mitochondria दाग चैनल DAPI चैनल के साथ विलय कर । ई. DCFA-डीएच नाडी (्र intracellular H2O2). F. DCFA-डीएच चैनल DAPI चैनल के साथ विलय कर. तीनों चैनलों की जी मर्जी. संक्षिप्त: n: नाभिक, मीट्रिक टन: mitochondria, एफ: flagellum और एमबी: झिल्ली । स्केल बार: 5 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 . intracellular एच के विभिंन पैटर्न2O2 में Solea senegalensis शुक्राणु (मात्रा रेंडर) । शुक्राणु के परिणामस्वरूप चैनल परमाणु खात और mitochondrion (ए, सी, ई) में intracellular ROS दिखा रहा है. intracellular एच2ओ2 भी नाभिक (बी, डी, एफ) के भीतर दिखा शुक्राणु के परिणामस्वरूप चैनल । अ आणि ब: DAPI. सी एण्ड डी: DCFH-डा. ई आणि एफ: Mitochondria दाग. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
यह सर्वविदित है कि mitochondria शुक्राणु गतिशीलता और समारोह के लिए महत्वपूर्ण organelles हैं । इन organelles ROS उत्पादन में समवर्ती सीधे शामिल हैं । दिलचस्प है, ROS के नियंत्रित स्तर उचित शुक्राणु समारोह1के लिए आवश्यक हैं । प्रजनन और ऑक्सीडेटिव तनाव के बीच सकारात्मक संबंधों स्तनधारी11 में दिखाया गया है, लेकिन अत्यधिक स्तर शुक्राणु गुणवत्ता12प्रभावित करते हैं । एक महत्वपूर्ण कारक है कि एक सकारात्मक या नकारात्मक प्रभाव के प्रति निर्णायक हो सकता है न केवल ROS स्तर पर भी ROS intracellular स्थानीयकरण है । ROS के बचके प्रभाव में से एक डीएनए क्षति9 उत्पादन और इसलिए ROS की परमाणु उपस्थिति नाभिक में संभावित क्षति का एक संकेतक हो सकता है ROS स्तर जबकि mitochondria में सामांय हो सकता है । यह ROS intracellular स्थानीयकरण के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है कि फोकल माइक्रोस्कोप की तरह तकनीकों के साथ मौजूदा मात्रात्मक तरीकों (उदाहरणके लिए, प्रवाह cytometry) के पूरक आवश्यक है.
फोकल माइक्रोस्कोपी ROS के intracellular स्थानीयकरण कल्पना करने के लिए एक इष्टतम विकल्प है । एक जीवित mitochondria दाग और DAPI के रूप में विशिष्ट fluorochromes का उपयोग क्रमशः mitochondria और नाभिक के दृश्य की अनुमति देता है और DCFH के साथ इन अणुओं के संयोजन-DA पेरोक्साइड के intracellular स्थानीयकरण की अनुमति देता है ।
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम fluorochrome मशीन और फोकल सेटअप कर रहे हैं । दोनों कदम और अनुकूलित किया जाना चाहिए ध्यान से reproducible और लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन किया । पद्धति संशोधनों का इस्तेमाल किया लाभदायक प्लाज्मा के आधार पर इन दो स्तरों पर किया जाना चाहिए । इसलिए, fluorochrome गर्मी अनुकूलित किया जाना चाहिए । तापमान और भंडारण की स्थिति काफी शुक्राणु नमूनों के बीच अलग है, और प्रोटोकॉल के सबसे स्तनधारियों के लिए अनुकूलित कर रहे हैं ।
यहां, teleost शुक्राणु नमूनों के लिए एक प्रोटोकॉल, विशेष रूप से Solea senegalensis शुक्राणु के लिए, (चित्रा 1) वर्णित है । नाभिक के सफल लेबलिंग और mitochondria वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया है और ROS उपस्थिति DCFH का उपयोग कर प्रकट किया गया है-DA (चित्रा 2) । परिणाम संकेत मिलता है कि एच2ओ2 के सह स्थानीयकरण शुक्राणु के नमूने (चित्रा 3) के आधार पर नाभिक या mitochondria में पाया गया है । के रूप में पहले से समझाया, शुक्राणु के एक उच्च प्रतिशत नाभिक के भीतर ROS के उच्च स्तर को प्रदर्शित करने के साथ उन नमूनों डीएनए क्षति होने का खतरा होगा । इस प्रोटोकॉल एक अद्वितीय सीमा है, महंगे उपकरणों की आवश्यकता (फोकल माइक्रोस्कोप), लेकिन यह cryopreservation प्रयोजनों के लिए नाभिक के भीतर ROS की कम उपस्थिति के साथ शुक्राणु के नमूनों के चयन में भविष्य उपयोगिता हो सकता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम AQUAGAMETE एफए १२०५ लागत कार्रवाई का शुक्र है । यह कार्य वित्तीय रूप से AGL201568330-C2-1-R परियोजना (MINECO/FEDER) द्वारा समर्थित था । डेविड जी Valcarce जंटा de Castilla y León (EDU1084/2012) और Fondo सामाजिक Europeo द्वारा वित्त पोषित किया गया । लेखक डॉ एना Riaza और Stolt सागर फार्म S.A., डॉ Paulino de पाज़, डॉ Ignacio मार्टिनेज Montero और जोस रामोन Guiérrez स्वीकार करते हैं । हम भी वीडियोग्राफी के लिए पाउला Fernández Colado धंयवाद ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
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