Summary
ويصف هذا البروتوكول منهجية مفصلة للكشف عن ح2س2 التعريب داخل المني سنغالية سمك استخدام حساسة فلوروتشرومي دا دكفه روس، وصمة عار الميتوكوندريا لايف الميتوكوندريا، و DAPI للنوى التصور، على التوالي. تم تصميم البروتوكول التي يتعين القيام بها داخل ح 2 مع المني أما طازجة أو المذابة.
Abstract
الأكسدة أحد العوامل الهامة في انخفاض جودة الحيوانات المنوية. وضع بروتوكولات فعالة للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) في المني ذو أهمية عالية في أي من الأنواع، ولكن هذه الأساليب نادراً ما تستخدم وحتى أقل في تيليوست. للواسمات هو تقنية مفيدة في تربية الأحياء المائية لأغراض مختلفة، بما في ذلك الجينات المصرفية وضمان توافر الحيوانات المنوية طوال السنة. تجميد/ذوبان إجراءات يمكن أن يسبب إنتاج روس وتلف خلايا الحيوانات المنوية. نظراً للضرر المستقبل أن فائض إنتاج روس يمكن أن يسبب في المني اعتماداً على الترجمة، هنا منهجية مفصلة للكشف عن ح2س2 وتقييم به التعريب داخل الخلايا عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل] يتم توفيرها. ولهذا الغرض، تستخدم مزيجاً من فلوروتشروميس 3 (2 '، اسيتات 7'-ديتشلوروديهيدروفلوريسسين (دكفه-دا)، وصمة عار يعيش الميتوكوندريا و 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي هيدروكلوريد (DAPI)) لتقييم التعريب المشارك من ح2س2 مع نويات المني أو الميتوكوندريا في عينات الحيوانات المنوية سينيجاليسيس سمك .
Introduction
ارتبط إنتاج الأنواع الأكسجين التفاعلية مع نوعية الحيوانات المنوية مؤخرا1. على الرغم من أن إنتاج روس في الميتوكوندريا يمكن أن يعتبر عملية فيزيولوجية طبيعية، الأكسدة بفائض في إنتاج روس سببا واضحا للضرر في المني على مختلف المستويات. في البشر، والأكسدة يرتبط بالعقم عند الذكور، تغيير حركية وقدرة على الخضوع تأهيلية2؛ في الثدييات، وقد تغير من سلامة الحمض النووي في عينات الحيوانات المنوية المجمدة ترتبط أيضا بتوليف ح2س23.
للواسمات تقنية شائعة للجينات المصرفية في تربية الأحياء المائية. هذه التكنولوجيا بأهمية خاصة في الأنواع مع مشاكل الإنجاب مثل سمك سنغالية. ويبين هذه الأنواع القيمة في السوق خلل الإنجابية في الأفراد المولودين في الأسر بسبب نقص في فترة الخطوبة. وهذه الحقيقة تجعل تجميد الحيوانات المنوية اللازمة لتوافر الحيوانات المنوية للاخصاب الاصطناعي. ومع ذلك، يمكن أن نعد مصدرا للأكسدة التي يمكن أن تكون ضارة للمني4 كما أفادت الدراسات أثر مفيد لمكملات مضادات الأكسدة. تثبيط روس عن طريق مضادات الأكسدة المتقدرية المستهدفة كان يقال أن مفيد لتجميد الحيوانات المنوية في سمك السلور الأصفر5.
ولذلك، مستويات روس في عينات الحيوانات المنوية من المهم أن نعرف، لا سيما بعد تجميد6،7 لأنه تم الاعتراف بهذه الجزيئات كعيب لبقاء الحيوانات المنوية والخصوبة8. وعلاوة على ذلك، دراسة توزيع روس داخل الخلية يمكن أن تكون حاسمة بالنسبة للاستدلال مستوى الأضرار المحتملة. على سبيل مثال، يمكن الافتراض بمستويات منخفضة من روس في الميتوكوندريا العادي ومتوافقة مع وظيفة الحيوانات المنوية، ولكن مستويات عالية من روس داخل النواة يمكن أن تكون مؤشرات تلف الحمض النووي المني. ح2س2 هو واحد من روس الأكثر أهمية التي يمكن إصدارها من الميتوكوندريا واختراق النواة لأنها جزيء صغير وأقل مقابل9. يمكن أن تكشف ديتشلوروفلوريسسين اسيتات (دكفه-دا) على وجه التحديد بيروكسيد داخل الخلايا التي تنبعث منها الفلورية الخضراء. ويرد في هذه المادة، بروتوكول مفصل لكشف ح2س2 التعريب داخل الخلايا في الحيوانات المنوية سنغالية سمك استخدام الفحص المجهري [كنفوكل].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: حضانة فلوروتشرومي والتحليل [كنفوكل] سوف تتخذ على الأقل 2-3 ح لعنصر تحكم وعينه معالجة. لا يتم تضمين معالجة البيانات في عملية الحساب هذه المرة. يمكن الاطلاع على المواد المطلوبة في الجدول للمواد. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على المني الطازج أو cryopreserved. سمك سنغالية هو أنواع أسماك التي يولد في المياه الباردة، والعمل دائماً تحت الظروف الباردة (4-7 درجة مئوية). انظر الشكل 1 نظرة عامة على البروتوكول.
1-العمل التحضيري قبل التجربة
- إعداد 1 مم الميتوكوندريا وصمة عار الأسهم حل في المرتبة التحليلية [دمس].
- إعداد 4 1 ميكروغرام/مل، حل الأسهم هيدروكلوريد 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) في المياه.
- إعداد حل المسابقة موسم/كغ 200 (ملم كلوريد الصوديوم، 2.9 مم بوكل، 1.8 مم كاكل2، 5 ملم حبيس، الأس الهيدروجيني 7.7 من 116)
- إعداد 2 '4 مم، 7' ديتشلوروديهيدروفلوريسسين اسيتات (دكفه-دا) حل الأسهم في المرتبة التحليلية من الميثانول.
ملاحظة: الاحتفاظ حلول الأسهم في مختبرين في-20 درجة مئوية إلى حين الحاجة. - تعيين في ميكروسينتريفوجي في 4-7 درجة مئوية.
2-نموذج إعداد قبل الحضانة فلوروتشرومي
ملاحظة: التعامل مع لطيف من المني من المرغوب فيه عندما بيبيتينج وريسوسبيندينج.
- إذا كان يعمل مع cryopreserved الخلايا، إعداد حمام مائي تذويب عند 40 درجة مئوية سمك سنغالية المني10. تزج العينات القش في حمام المياه ل 7 s.
- استخدام مقص لقص، إفراغ العينة في أنبوب [ميكروفوج] والطرد المركزي في 1000 غ س، 4-7 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
- إزالة البلازما المنوية أو البلازما المنوية مع المنتجة من العينة كريوبريسيرفيد بيبيتينج إلى تجاهل أي المكونات التي يمكن أن تتداخل مع البروتوكول المصبوغة.
- ريسوسبيند الخلايا في 50-100 ميكروليتر من 4 درجات مئوية 200 موسم/كغ حل المسابقة.
- تحديد تركيز الحيوانات المنوية مع نويباور أو دائرة عد مماثلة تحت مجهر مجسمة.
- تمييع تعليق الخلية تصل إلى 1-2 × 106 خلايا/مل في حجم 0.5 مل في 4 درجات مئوية في المسابقة الحل نهائي.
3-فلوروتشرومي الحضانة
ملاحظة: يجب معالجة فلوروتشروميس في ظروف الإضاءة الخافتة، خصوصا عندما تكون في الحل.
- إضافة ميكروليتر 3.125 دا دكفه حل الأسهم (التركيز النهائي في العينة: 25 ميكرومتر) إلى تمييع عينة العامل. تبني في 4-7 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة في الظلام10.
- بعد 30 دقيقة، إضافة 0.5 ميكروليتر من الحل DAPI الأسهم (التركيز النهائي في العينة: 2 ميكرومتر) و 0.5 ميكروليتر من الميتوكوندريا وصمة عار حل الأسهم (التركيز النهائي في العينة: 100 nM) للعينة. احتضان كل فلوروتشروميس لمدة 10 دقائق في الظلام.
4-إعداد عينة للفحص المجهري [كنفوكل]
- وبعد فترة الحضانة، الطرد المركزي بتعليق خلية في 1000 غ س، 4-7 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
- تجاهل المادة طافية بعناية قبل بيبيتينج.
- إضافة 10-20 ميكروليتر موسم 200/كغ حل المسابقة.
- إسقاط ميكروليتر 5 مكان لتعليق خلية مركزة على شريحة.
- بعناية، وضع غطاء شريحة على الإعداد وختم ذلك بالبولندية. بمجرد جفاف البولندية، الإعداد جاهزة للفحص المجهري [كنفوكل].
5-[كنفوكل] الإعداد قبل التجربة
ملاحظة: اعتماداً على المجهر، دا دكفه يمكن أن يكون "أحرقت". وضع شروط أفضل مع عينة غير قيمة أولاً.
- قم بتشغيل المجهر وأشعة الليزر والكاميرا والكمبيوتر الذي يتم تشغيل المجهر.
- تعيين الليزر الإثارة مع مراعاة الحدود القصوى الإثارة والانبعاثات لكل فلوروتشرومي:
- ل DAPI، استخدام أقصى إثارة 358 شمال البحر الأبيض المتوسط وانبعاثات كحد أقصى من 465 شمال البحر الأبيض المتوسط.
- لوصمة عار المتقدرية، استخدام أقصى إثارة 644 شمال البحر الأبيض المتوسط وانبعاثات كحد أقصى من 662 شمال البحر الأبيض المتوسط.
- بالنسبة دكفه دا، استخدم إثارة كحد أقصى من 504 شمال البحر الأبيض المتوسط وانبعاثات كحد أقصى من 525 نانومتر.
- بدء العمل مع الهدف X 25 إلى التركيز على المني. اختر قناة DAPI على التركيز لأن هذا فلوروتشرومي تقارير كثافة أعلى. مرة واحدة وهي تركز الخلايا، استخدم 63 X أو 100 X الهدف لإجراء تقييم شامل لحجم المني سنغالية سمك حوالي 2 ميكرومتر.
- بالنسبة لكل قناة، تحسين الثقب والمكسب والجهد. بنفس الطريقة، ضبط الإزاحة الرقمي للحد من الخلفية. بمجرد كافة المعلمات هي الأمثل ل fluorochrome المستخدمة، حفظ الإعدادات. لتجربة روتينية لفترة واحدة الخلية المنوية سنغالية سمك استخدمنا التالية (يمكن تغيير هذه المعلمات في كل تجربة): الثقب 1 وكسب الجهد من 750 V.
6-الحصول على الصور
- حدد شروط الجودة المطلوبة للحصول على الصورة. تعريف إعدادات اقتناء مثل عمق البت، تنسيق صورة، وسمك الورقة الخفيفة، واختر الإضاءة جانب واحد. لتجربة روتينية لفترة واحدة المني سنغالية سمك استخدمنا التالية (يمكن تغيير هذه المعلمات في كل تجربة): الإطار حجم 1024 px؛ بت لكل بكسل من 16؛ سرعة المسح الضوئي من 2-4).
- فتح ومركز منطقة المسح الضوئي لتبدأ وتأخذ صورة من الميدان.
- باستخدام أداة الاقتصاص، حدد المنطقة التي تهم واضغط حية.
- مع مساعدة أداة المؤشر النطاق، ضبط الإزاحة الرقمي للحد من الخلفية. تنفيذ هذا الإجراء لكل قناة وأخذ الصورة.
- التحقق من جودة القنوات الفردية لكل فلوروتشرومي وتشكيلاتها.
7-إنشاء شريط فيديو صورة ثلاثية الأبعاد
- Z-مكدس الحصول على الإعدادات.
- اختر خيار Z-المكدس في البرنامج.
- حدد خلية واحدة، مجموعة من الخلايا أو المنطقة ذات الاهتمام والتركيز عليه.
- تحديد Z-المكدس مع الخيارات 'الشريحة الأولى' و 'آخر شريحة' وإنشاء الخطوة z للفاصل الزمني إلى 0.2 ميكرون مع مساعدة التركيز الجميلة. اختر قناة DAPI على التركيز لأن هذا فلوروتشرومي قد تقرير كثافة أعلى ويمكنك بسهولة تحديد رأس المني كله. اختر لبارامترات الأمثل لكل قناة وتشغيل التجربة.
- تشغيل التجربة Z-المكدس. تقسيم القنوات والاحتفال بإضفاء الطابع المحلي على كل الإشارات داخل الخلايا.
- ض-المكدس العملية.
- حجم التحميل: بمجرد الانتهاء من هذه التجربة، حدد خيارات برامج معالجة مكدس Z واختر الحجم يجعل الخيار. حدد العدد من الخطوات ودرجات دوران (360 درجة). حفظ الملف بملحق فيديو.
- النقش ستيريو: اختر ستيريو النقش في الخيارات إطار عملية. تتيح هذه الأداة لخلق صورة 3D الفيديو مع القنوات سبليت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مجهر [كنفوكل] وسيلة مثالية لتقييم روس داخل الخلايا في الحيوانات المنوية تيليوست. مزيج فلوروتشروميس الثلاثة (DAPI، الميتوكوندريا وصمة عار ودكفه دا) المعروضة في هذه الدراسة (الشكل 1) يوفر الكثير من المعلومات المفيدة التي يمكن تطبيقها في البحوث الأساسية، ويمكن أن تكون لها تطبيقات في تحسين الإجراءات المستخدمة في محطات تربية الأحياء المائية الصناعية، مثل بروتوكولات للواسمات. يجوز إجراء أنواع مختلفة من التحليل من أجل الربط بين وجود روس داخل الخلايا وغيرها من المعالم: حركية، والبقاء، وأنماط مختلفة بين مربي جيدة وسيئة، وتنشيط حركية أو اختلافات موسمية الحيوانات المنوية ضمن أشياء أخرى كثيرة. في هذا العمل، تظهر نمطين من أنماط مختلفة داخل الخلايا ح2س2 التوزيع داخل المني: الرديفة مع ميتوكندريا أو انتشار في النواة (الأرقام 2، 3). وأظهرت المني تلك تظهر انخفاض الأضرار المحتملة التي تنتجها روس وسمها دكفه دا إلا في الميتوكوندريا بينما تلك التي تعاني من أضرار الحمض النووي أظهرت دكفه دا الوسم أيضا في الأنوية. برامج الفحص المجهري [كنفوكل] يسمح لإنشاء أشرطة الفيديو مفيدة وتوفر الرسوم البيانية كولوكاليزيشن سهلة وسريعة.
الشكل 1 . نظرة عامة حول البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . مثال للحصول على الصور [كنفوكل]- نظام أ للعينة باء قناة DAPI (وضع العلامات دسدنا). جيم الميتوكوندريا وصمة عار قناة (وضع العلامات ميتوكندريا). دال الميتوكوندريا وصمة عار قناة اندمجت مع قناة DAPI. هاء DH تلك القناة (وضع العلامات داخل الخلايا ح2س2). ف. دمج DH تلك القناة مع قناة DAPI. زاي دمج القنوات الثلاث. المختصرات: n: النوى، و النقل المتعدد الوسائط: الميتوكوندريا، و: السوط و ميغابايت: الغشاء. شريط الحجم: 5 ميكرومترات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . أنماط مختلفة من داخل الخلايا ح2س2 في سمك سنغالية المني (حجم التقديم)- الناتجة عن قنوات المني عرض روس داخل الخلايا في الحفرة النووية وميتوكندريا (A, C, E). الناتجة عن قنوات المني عرض داخل الخلايا ح2س2 أيضا داخل الأنوية (ب، د، و). A و B: DAPI. ج ود: دكفه-da. E و F: الميتوكوندريا وصمة عار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فمن المعروف جيدا أن الميتوكوندريا هي العضيات الرئيسية لعدد الحيوانات المنوية الحركة والوظيفة. وتشارك هذه العضيات في الوقت نفسه مباشرة في إنتاج روس. من المثير للاهتمام، هناك حاجة المستويات التي تسيطر عليها من روس للحيوانات المنوية السليمة الدالة1. أظهرت العلاقات الإيجابية بين الخصوبة والأكسدة في الثدييات11 ولكن المستويات المفرطة تؤثر على نوعية الحيوانات المنوية12. هو أحد العوامل الحاسمة التي يمكن أن تكون حاسمة تجاه تأثير إيجابي أو سلبي مستويات روس ليس فقط، بل أيضا روس التعريب داخل الخلايا. واحدة من الآثار الضارة لروس هو إنتاج الحمض النووي الضرر9 والنووية وجود روس ولذلك يمكن أن يكون مؤشرا لاحتمال حدوث تلف في النواة بينما يمكن أن يكون روس المستويات العادية في الميتوكوندريا. من الضروري أن تكمل الأساليب الكمية الموجودة (مثلاً، التدفق الخلوي) مع تقنيات مثل الفحص المجهري [كنفوكل] التي يمكن أن توفر معلومات حول التعريب روس داخل الخلايا.
مجهرية [كنفوكل] خيار أمثل لتصور التعريب داخل الخلايا من روس. يسمح استخدام فلوروتشروميس محددة مثل الميتوكوندريا يعيش وصمة عار و DAPI التصور من الميتوكوندريا ونواة على التوالي والمزيج من هذه الجزيئات مع دكفه دا يسمح التعريب داخل الخلايا من بيروكسيد.
الخطوات الحاسمة ضمن البروتوكول هي حضانة فلوروتشرومي والإعداد [كنفوكل]. وينبغي الأمثل كل الخطوات وتنفيذها بدقة للحصول على نتائج متسقة واستنساخه. ينبغي أن تجري التعديلات المنهجية في هذين المستويين تبعاً للبلازما المنوية المستخدمة. ولذلك، ينبغي تكييف الحضانة فلوروتشرومي. درجات الحرارة وظروف التخزين تختلف إلى حد كبير بين عينات الحيوانات المنوية، ومعظم البروتوكولات هي الأمثل للثدييات.
ويرد هنا، بروتوكولا لعينات تيليوست الحيوانات المنوية، وخاصة بالنسبة سمك سنغالية المني، (الشكل 1). وضع العلامات الناجحة نوى والميتوكوندريا قد أجريت باستخدام بروتوكول وصف، وقد تم الكشف عن وجود روس استخدام دا دكفه (الشكل 2). وتشير النتائج إلى أن التعريب المشارك من ح2س2 ووجدت في نوى أو الميتوكوندريا اعتماداً على عينة الحيوانات المنوية (الشكل 3). وكما هو موضح سابقا، ستكون تلك العينات مع نسبة مئوية عالية من المني عرض مستويات عالية من روس داخل النواة عرضه لأضرار الحمض النووي. هذا البروتوكول القيد فريد، شرط معدات غالية الثمن (مجهر [كنفوكل])، ولكن يمكن أن يكون أداة المستقبل في تحديد عينات الحيوانات المنوية مع انخفاض وجود روس داخل نواة لأغراض للواسمات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونشكر أكواجاميتي FA 1205 تكلفة العمل. وأيد هذا العمل ماليا مشروع AGL201568330-C2-1-R (مينيكو/FEDER). ومولت فالكارسي زاي ديفيد دي المجلس العسكري قشتالة وليون (EDU1084/2012) والصندوق الاجتماعي الأوروبي. يعترف المؤلف الدكتورة أنا Riaza وستولت البحر مزرعة S.A. والدكتور باولينو دي باز، والدكتور إغناسيو مارتينيز مونتيرو وخوسيه رامون Guiérrez. ونشكر أيضا باولا فيرنانديز كولادو للفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O'Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
- Zhu, Z., et al. Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action. PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).
- Fang, L., et al. Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish. Cryobiology. 69 (3), (2014).
- Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
- Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm. Theriogenology. 73 (3), (2010).
- Guthrie, H. D., Welch, G. R. Effects of reactive oxygen species on sperm function. Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).
- Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
- Valcarce, D. G., Robles, V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa. Reproduction. 152 (5), (2016).
- Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
- Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).
