Summary
이 프로토콜 H2O2 지역화 Solea senegalensis 정 충을 사용 하 여 민감한 형광 색소 DCFH 다 선생님, 미토 콘 드리 아에 대 한 라이브 미토 콘 드리 아 얼룩 DAPI 핵에 대 한 내 검색에 대 한 자세한 방법을 설명 합니다. 시각화, 각각. 프로토콜은 신선한 또는 해 동 정 충으로 2 시간 내에서 수행 하도록 설계 되었습니다.
Abstract
산화 스트레스는 감소 하는 정자의 품질에 중요 한 요소 중 하나입니다. 어떤 종에서 높은 중요성의 이다 정 충에 반응성 산소 종 (선생님)을 탐지 하기 위한 효율적인 프로토콜을 개발 하지만 이러한 메서드는 거의 사용 하 고 덜 teleost에. Cryopreservation은 유전자 은행을 포함 하 여 다른 목적에 대 한 양식 업에 유용한 기술 이며 연중 정자 가용성을 보장 합니다. 냉동/해 동 절차 선생님 생산을 일으킬 수 있고, 정자 세포 손상. 고려는 예비 손상 선생님 생산의 과잉 발생할 수 그들의 지역화, 여기에 따라 정 충에 H2O2 를 감지 하 고 그것의 세포내 지역화 confocal 현미경 검사 법에 의해 평가 하는 상세한 방법론 제공 됩니다. 이 위해 3 형광 (2, 7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-다), 라이브 미토 콘 드리 아 얼룩 및 4, 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI))의 조합2 H2O의 공동 지역화를 평가 하 되 정 충 핵 이나 미토 콘 드리 아 Solea senegalesis 정자 샘플에.
Introduction
정자 품질 반응성 산소 종 생산 연결 되었습니다 최근1. 미토 콘 드리 아에서 선생님 생산 정상적인 생리 적인 과정 이라고 여겨질 수 있다, 비록 선생님 생산의 과잉에 의해 산화 스트레스 서로 다른 수준에서 정 충에 손상의 명확한 원인입니다. 인간에서는, 산화 스트레스는 남성 불 임, 운동 성 및 capacitation2;을 능력 변경 관련 포유류에서 냉동된 정자 샘플에서 DNA 무결성의 변화는 H2O23의 합성에도 관련 되어있다.
Cryopreservation은 유전자 은행 양식 업에 대 한 일반적인 기법입니다. 이 기술은 Solea senegalensis같은 생식 문제 종에서 특히 중요 하다. 시장에서이 귀중 한 종 구 혼의 부족으로 인해 포로에서 태어난 개인 생식 기능 장애를 보여줍니다. 이 사실은 정자 cryopreservation 인공 수정 위한 정자 가용성 필요 합니다. 그러나, cryopreservation 연구 항 산화 보충의 유익한 효과 보고 있다 정 충4 해로운 수 있는 산화 스트레스의 원천이 될 수 있습니다. 선생님 억제 대상으로 미토 콘 드 리아 산화를 통해 소문에 하면 정자 cryopreservation 노란색 메기5에 대 한 유익한 했다.
따라서, 정자 샘플에서 선생님의 수준을 알고, 특히 cryopreservation6,7 후 있기 때문에 이러한 분자 정자 생존 및 다 산8에 대 한 단점으로 인정을 받고 있다 중요 하다. 또한, 셀 내에 선생님의 배급을 공부 하 고 손상의 정도 추정 하는 것 중요 한 수 있습니다. 예를 들어, 정상 및 정자 기능, 호환 되는 미토 콘 드리 아에서 선생님의 낮은 수준의 추측 될 수 있지만 핵 내 선생님의 높은 수준의 정 충 DNA 손상의 지표 수 있습니다. H2O2 는 미토 콘 드리 아에서 나올 수 있는 작고 충전 없는 분자9이기 때문에 핵을 관통 하는 가장 관련성이 높은 선생님 중 하나입니다. Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-다) 특히 녹색 형광을 방출 하는 세포내 과산화물을 밝힐 수 있다. 이 문서에서는, Solea senegalensis 정자 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 H2O2 세포내 지역화를 탐지 하기 위한 상세한 프로토콜 제공 됩니다.
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Protocol
참고: 형광 색소 외피와 confocal 분석 컨트롤 및 치료 샘플에 대 한 2-3 h 이상 소요 됩니다. 데이터 처리는이 시간 계산에 포함 되지 않습니다. 필요한 재료는 재료의 테이블에서에서 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜은 신선한 또는 cryopreserved 정 충에 적용할 수 있습니다. Solea senegalensis 냉 수, 차가운 조건 (4-7 ° C)에서 항상 작업에서에서 생성 하는 어 종입니다. 프로토콜의 일반적인 보기에 대 한 그림 1 을 참조 하십시오.
1. 실험 하기 전에 준비 작업
- 1mm 미토 콘 드리 아 얼룩 분석 학년 DMSO 재고 솔루션을 준비 합니다.
- 4 ' 1 μ g/mL, 이온된 수에서 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) 재고 솔루션을 준비 합니다.
- 200 mOsm/kg 벨 솔루션 (116 m m NaCl, 2.9 m m KCl, 1.8 m m CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.7) 준비
- 4 m m 2 ', 7 '-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-다) 재고 솔루션 분석 학년 메탄올에서 준비 합니다.
참고:-20 ° C까지 필요에서 aliquots에 재고 솔루션을 유지. - 4-7 ° c.에 있는 microcentrifuge를 설정
2. 형광 색소 부 화 하기 전에 샘플 준비
참고: 정 충의 부드러운 처리 때 바람직한 pipetting 및 resuspending.
- Cryopreserved 셀 작동, Solea senegalensis 정 충1040 ° C에 녹고 물 목욕 준비. 7 물 목욕에 짚 샘플을 담가 s.
- 잘라가 위를 사용 하 여, 샘플 microfuge 관으로 빈 하 고 1000 x g, 1 분에 4-7 ° C에서 원심.
- 정액 플라스마 또는 cryoprotectants와 정액 플라스마 cryopreserved 샘플에서 pipetting 얼룩 프로토콜을 방해할 수 있는 모든 구성 요소를 삭제 하 여 제거 합니다.
- 4 ° C 200 mOsm/kg 벨 솔루션의 50-100 μ 셀 resuspend
- Neubauer 또는 입체 현미경 비슷한 세 챔버 정자 농도 결정 합니다.
- 1-4 ° C 벨 솔루션에에서 0.5 mL의 최종 볼륨에서 106 셀/mL x 2를 세포 현 탁 액을 희석.
3. 형광 색소 인큐베이션
참고: 형광 특히 솔루션에서에서 낮은 조명 조건에서 처리 되어야 합니다.
- DCFH-다 재고 솔루션의 3.125 μ 추가 (샘플에서 최종 농도: 25 μ M) 작업 샘플 희석을. 어둠10에서 40 분 4-7 ° C에서 품 어.
- 30 분 후 DAPI 재고 솔루션의 0.5 μ 추가 (샘플에서 최종 농도: 2 μ M) 및 재고 솔루션 얼룩은 미토 콘 드리 아의 0.5 μ (샘플에서 최종 농도: 100 nM) 샘플을. 어둠 속에서 10 분 동안 두 형광을 품 어.
4. 샘플 준비 Confocal 현미경 검사 법에 대 한
- 보육 시간 후 1000 x g, 1 분에 4-7 ° C에 세포 현 탁 액을 원심.
- Pipetting으로 상쾌한을 신중 하 게 삭제 합니다.
- 200 mOsm/kg 벨 솔루션의 10-20 μ를 추가 합니다.
- 집중된 세포 현 탁 액의 장소 5 μ 슬라이드에 드롭.
- 신중 하 게, 준비에 커버 슬라이드를 넣어 그것을 봉인 폴란드어와. 폴란드는 건조, 일단 준비는 confocal 현미경 검사 법에 대 한 준비.
5. 실험 전에 confocal 설치
참고: 현미경, 따라 DCFH 다 수 수 "점화". 먼저 비-귀중 한 샘플을 최상의 조건을 설정 합니다.
- 현미경, 레이저, 카메라와 현미경을 실행 하는 컴퓨터를 켭니다.
- 설정된 여기 레이저 각 형광 색소의 여기 및 방출 최대값을 고려:
- DAPI, 358의 여기 최대 사용 nm와 465의 방출 최대 nm.
- 미토 콘 드 리아 얼룩 사용 644의 여기 최대 nm와 662의 방출 최대 nm.
- DCFH-다, 504의 여기 최대 사용 및 525의 방출 최대 nm.
- 25 X 목표는 정 충에 초점 작업을 시작 합니다. 이 형광 색소는 높은 강도 보고 있기 때문에 초점 DAPI 채널을 선택 합니다. 셀의 초점을 맞추고 사용 하 여 63 X 또는 100 X 목표 철저 한 평가 위해 Solea senegalensis 정 충 크기 때문에 약 2 μ m.
- 각 채널에 대 한 최적화 pinhole, 이득 및 전압. 같은 방식으로 배경을 줄이기 위해 디지털 오프셋을 조정 합니다. 모든 매개 변수는 사용 하는 형광 색소에 대 한 최적화 설정을 저장. 단일에 대 한 일상적인 실험 Solea senegalensis 정자 세포 (이 매개 변수는 각 실험에서 변경 될 수 있습니다) 다음 사용: 1, 750 V의 이득 전압의 작은 구멍.
6입니다. 이미지 수집
- 이미지 수집에 대 한 원하는 품질 조건을 선택 합니다. 비트 깊이, 이미지 포맷, 빛 시트 두께, 수집 설정을 정의 하 고 단일 양면된 조명 선택 합니다. 단일에 대 한 일상적인 실험 Solea senegalensis 정 충 (이 매개 변수는 각 실험에서 변경 될 수 있습니다) 다음 사용: 프레임 크기 1024 픽셀; 16;의 픽셀 당 비트 스캔의 속도 2-4)입니다.
- 열고 시작 하는 필드의 이미지 스캔 영역을 가운데로.
- 자르기 도구를 사용 하 여 관심 영역을 선택 하 고 라이브를 누릅니다.
- 범위 표시기 도구의 도움으로 배경을 줄이기 위해 디지털 오프셋을 조정 합니다. 각 채널에 대 한이 작업을 수행 하 고 이미지를가지고.
- 각 형광 색소와 그들의 조합에 대 한 개별 채널의 품질을 확인 합니다.
7. 3D 이미지 비디오를 만들기
- Z-스택 수집 설정입니다.
- 소프트웨어에서 Z-스택 옵션을 선택 합니다.
- 단일 셀을 셀의 그룹 또는 관심 영역을 선택 하 고 그것을 집중.
- Z-스택 ' 첫 번째 조각 '과 ' 마지막 조각 ' 옵션으로 구분 하 고 정밀한 초점의 도움으로 0.2 µ m 간격 z 단계를 설정. 이 형광 색소는 높은 강도 보고할 수 있습니다 쉽게 전체 정 충 머리를 선택할 수 있기 때문에 초점 DAPI 채널을 선택 합니다. 각 채널에 대 한 최적의 인수 매개 변수를 선택 하 고 실험을 실행.
- Z-스택 실험을 실행 합니다. 채널을 분할 하 고 각 신호는 세포 내에서 지역화 합니다.
- Z-스택 프로세스입니다.
- 볼륨 렌더링: 실험 완료 되 면 Z 스택 처리 소프트웨어의 옵션을 선택 하 고 볼륨 렌더링 옵션을 선택 하십시오. 단계와 회전도 (360 °)의 수를 선택 합니다. 비디오 확장명으로 파일을 저장 합니다.
- 스테레오 입체 사진: 옵션에서 스테레오 글리프를 선택 프로세스 창. 이 도구는 분할 채널 비디오 3D 이미지를 만들 수 있습니다.
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Representative Results
Confocal 현미경 검사 법 teleost 정자에서 세포내 선생님 평가 위한 이상적인 방법입니다. 이 연구는 (그림 1)에 3 개의 형광 (DAPI 미토 콘 드리 아 얼룩, DCFH-다)의 조합 기초 연구에 적용 될 수 있으며 응용 프로그램에 사용 되는 절차를 개선 할 수 있는 많은 유용한 정보를 제공 합니다. 산업 양식 식물, cryopreservation 프로토콜 등입니다. 다른 유형의 분석 세포내 선생님 존재와 다른 매개 변수를 연결 하기 위해 실행 될 수 있습니다: 운동 성, 생존, 좋은 나쁜 종 축, 운동 성 또는 많은 다른 사람 사이 계절 정자 변이의 활성화 사이 다른 패턴. 현재 작업에는 정 충 내에서 세포내 H2O2 분산의 두 가지 서로 다른 패턴 같습니다: mitochondrion 또는 확산 핵 (그림 2, 3)에 배치. 그 정 충 선생님에 의해 생산 하는 낮은 손상을 보여주는 반면 그 DNA 손상을 고통 DCFH-다 핵에서 또한 라벨을 보여주었다 DCFH 다는 미토 콘 드리 아에만 라벨 보였다. 공초점 현미경 소프트웨어 유용한 동영상을 쉽고 빠르게 colocalization 그래프를 제공 수 있습니다.
그림 1 . 프로토콜에 대 한 일반적인 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 공초점 이미지 수집의 예. B. 샘플의 A. 계획 DAPI 채널 (dsDNA 라벨)입니다. C. 미토 콘 드리 아 (mitochondrion 라벨) 채널 얼룩. 디 미토 콘 드리 아 채널 DAPI 채널 병합 얼룩. E. DCFA-DH 채널 (라벨 세포내 H2O2). F. DCFA DH 채널 DAPI 채널 병합. G. 3 채널의 병합. 약어: n: 핵, mt: 미토 콘 드리 아, f: 신설 및 mb: 막. 눈금 막대: 5 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 세포내 H2의 다른 패턴O2 에 Solea senegalensis 정 충 (볼륨 렌더링). 핵 포에 mitochondrion (A, C, E) 세포내 선생님을 보여주는 정 충의 결과 채널. 또한 (B, D, F)는 핵 내에서 세포내 H2O2 를 보여주는 정 충의 결과 채널. A 와 B: DAPI. C 와 D: DCFH 검사 E 와 F: 미토 콘 드리 아 얼룩. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
그것은 잘 알려진 미토 콘 드리 아는 정자의 운동 성 및 기능에 대 한 주요 세포입니다. 이러한 세포는 동시에 직접 선생님 생산에 참여 했다. 흥미롭게도, 선생님의 제어 수준은 적절 한 정자 기능1필요 합니다. 다 산과 산화 스트레스 사이의 긍정적인 관계 포유류11 에 표시 되었습니다 하지만 과도 한 수준에 영향을 미칠 정자 품질12. 긍정적 이거나 부정적인 효과로 결정 될 수 있는 하나의 중요 한 요소는 선생님 수준 뿐만 아니라 선생님 세포내 지역화입니다. 선생님의 해로운 효과의 한 DNA 손상9 생산 고 따라서 선생님의 핵 존재 반면 선생님 수준 미토 콘 드리 아에서 정상적인 수 핵에서 손상의 지표로 될 수 있습니다. 그것은 같은 선생님 세포내 지역화에 대 한 정보를 제공할 수 있는 confocal 현미경 검사 법 기술로 기존의 양적 방법(, cytometry)을보충 하는 데 필요한.
Confocal 현미경 검사 법은 선생님의 세포내 지역화를 시각화 하는 최적의 옵션입니다. 특정 형광 라이브 미토 콘 드리 아 얼룩 등 DAPI를 사용 하 여 각각 미토 콘 드리 아와 핵의 시각화를 허용 하 고 DCFH-다 함께이 분자의 조합 수 있습니다 과산화 수소의 세포내 지역화.
프로토콜 내에서 중요 한 단계는 형광 색소 인큐베이션 및 confocal 설정 합니다. 두 단계 최적화 하 고 신중 하 게 재현 하 고 일관 된 결과 얻기 위해 수행 해야 합니다. 방법론 수정 정액 플라즈마 사용에 따라이 두 가지 수준에서 수행 되어야 합니다. 따라서, 형광 색소 인큐베이션 적응 해야 합니다. 과 프로토콜의 대부분은 포유류에 대 한 최적화 된 온도 및 저장 조건 크게 정자 샘플 중 다.
Solea senegalensis 정 충, 특히 teleost 정자 샘플에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기, (그림 1). 핵과 미토 콘 드리 아의 성공적인 레이블링 수행 되었습니다 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 고 선생님 존재 DCFH-다 (그림 2)를 사용 하 여 공개 되어 있다. 결과 표시는 공동 지역화 H2O2 는 핵 또는 정자 샘플 (그림 3)에 따라 미토 콘 드리 아에서 발견 되었습니다. 이전 설명으로 핵 내 선생님의 높은 레벨을 표시 하는 정 충의 높은 백분율을 가진 그 샘플 DNA 손상 하는 경향이 것입니다. 이 프로토콜에 고유한 제한, 고가의 장비 (공초점 현미경)의 요구는 하지만 그것은 미래 유틸리티 cryopreservation 목적 핵 내 선생님의 낮은 존재와 정자 샘플을 선택 하 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 AQUAGAMETE FA 1205 비용 작업을 감사합니다. 이 작품 AGL201568330-c 2-1-R 프로젝트 (MINECO/페더)에 의해 재정적으로 지원 되었다. 데이비드 G. 발 카 르 세 드 의회에 의해 투자 되었다 카스 티 야와 레온 (EDU1084/2012)와 Fondo 사회 Europeo. 저자는 박사 아나 Riaza 및 Stolt 바다 농장 소화기, 닥터 폴 리 드 파스, 박사가 그 나 시오 마르티네스 몬테로 호세 라몬 Guiérrez 인정합니다. 우리 또한 videography 폴라 페르난데스 Colado 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
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