Summary
혈액 뇌 장벽의 범위를 유지하는 것은 중추 신경계의 항상성을 유지하기위한 열쇠입니다. 이 프로토콜은 혈액 - 뇌 장벽 범위를 조정하는 근본적인 병적 과정을 묘사하는 체외 기술을 설명합니다.
Abstract
Blood-brain barrier (BBB) 범위는 중추 신경계 (CNS)의 항상성에 중요한 역할을합니다. BBB는 성상 세포, 혈관 주위 세포 및 뇌 내피 세포 (BECs)에 의해 동적으로 유지됩니다. 여기, 우리는 불멸의 인간 BEC의 단일 문화, 기본 마우스 BEC의 단일 문화, BBB의 인간화 트리플 문화 모델 (BECs, astrocytes 및 pericytes)를 사용하여 BBB 범위를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다. 질병 상태에 대한 분석법의 적용 가능성을 강조하기 위해 우리는 BBB 적용 범위에서 알츠하이머 병 (AD) 진행에 중요한 기여를하는 oligomeric amyloid-β (oAβ)의 효과에 대해 설명합니다. 또한 우리는이 기술의 약물 스크리닝 가능성을 조명하기 위해 표피 성장 인자 (EGF)를 이용합니다. 우리의 결과는 단일 및 삼중 배양 BECs은 기초 조건 하에서 meshwork와 같은 구조를 형성하고, oAβ는이 세포 망 조직 형성을 방해하고 예비 형성된 메쉬 구조를 퇴화시키고,EGF는 이러한 혼란을 차단합니다. 따라서 기술 된 기술은 BBB 적용 범위를 조절하는 근본적이고 질병 관련 프로세스를 해부하는 데 중요합니다.
Introduction
대뇌 모세 혈관의 혈액 뇌 장벽 (BBB)은 혈액 대 뇌 접촉의 가장 큰 경계면이며 중추 신경계 (CNS) 1 , 2 의 항상성에 중심 역할을합니다. BBB의 동적 인 과정은 혈액에서 원하지 않는 분자의 섭취를 막고, CNS에서 폐기물을 제거하고, 필수 영양소와 신호 분자를 CNS에 공급하고, 신경 염증 1 , 2 , 3 , 4 , 5를 조절 합니다. BBB 손상은 노화 및 알쯔하이머 병 (AD), 다발성 경화증 및 뇌졸중 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,ass = "xref"> 6. 따라서 BBB 기능 장애는 치료 목표를 포함 해 신경 퇴행성 장애에 핵심적인 역할을 할 수 있습니다.
혈관 커버리지를 유지하는 것은 BBB의 항상성 기능에 중요합니다. 그러나, 생체 내 및 시험 관내 자료가 신경 퇴행성 장애에 관련된 과정이 AD에서 특히 BBB 적용 범위를 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13으로 증가시키는 지에 대해 충돌합니다. 따라서 BBB 범위의 역학을 평가하고보다 포괄적으로 이해하기 위해 관련 세포 유형을 사용 하는 시험 관내 모델의 개발에 대한 강력한 근거가 있습니다. 대뇌 모세 혈관은 성상 세포, 혈관 주위 세포 및 뇌 내피 세포 (BEC) 3 입니다. 일반적으로 BBB 기능을 평가하기위한 세포 배양 기술은 스트레스 원 14 , 15 , 16 모두를 첨가 한 후 필터 삽입물에서 키운 세포에서 수행 된 투과성 분석 또는 주요 BEC 단백질의 수준 평가입니다. 중요한 것은이 검사는 뇌 혈관 검사에 초점을 두지 않는다는 것입니다.
여기에서 우리의 이전 방법 17 은 불멸화 된 인간 BEC의 단일 배양, 일차 마우스 BEC의 단일 배양 및 인간화 된 삼중 배양을 사용하여 BEC 적용 범위 및 망사 형 구조를 평가하기 위해 상세화된다모델 (BECs, astrocytes 및 pericytes) BBB. 목표는 BEC 적용 범위에서 AD 진행에 중요한 공헌자로 간주되는 oAβ의 해로운 영향을 입증하는 것이 었습니다. 표피 성장 인자 (EGF)의 보호 효과는 치료 선별 도구로서의 기술의 잠재력을 강조합니다. 이 기술은 1) 혈관 신생 및 혈관 범위에 대한 특정 경로의 역할을 묘사하는 것, 2) 혈관 신생 및 혈관 형성에 질병 및 노화 관련 요인의 영향을 평가하는 것, 3) 약리학 적 특성을 확인하는 것 목표.
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Protocol
모든 실험은 시카고 기관 동물 관리 및 사용위원회의 일리노이 대학 (University of Illinois)을 따른다.
1. 일반 준비
참고 : 뇌 미세 혈관 내피 세포주 (hCMEC / D3)는 광범위하게 특성화 된 불멸화 인간 BEC 라인 14 , 15 , 16 , 18 , 19 입니다. 기저 내피 성장 기초 배지에서 콜라겐 유형 I (종아리 피부, 칼슘 2 + 및 Mg 2+를 함유 한 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 0.1 % 솔루션의 1:20 희석)로 코팅 조직 배양 플라스크에 hCMEC / D3 세포를 문화 (FBS), 10 % 아스 코르 빈산, 10 % 겐타 마이신 설페이트, 25 % 하이드로 코티 존 및 공급 된 성장 인자 보충제의 총량의 1/4을 포함하는 배양액 (EBM-2) 혈관 내피 세포(VEGF), 표피 성장 인자 (EGF), 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF-1) 및 사람의 염기성 섬유 모세포 성장 인자 (bFGF)와 관련이있다.
참고 : FBS 및 성장 인자가있는 EBM-2 배지를 "EBM-2 complete"라고합니다. FBS와 보충제가없는 EBM-2는 "EBM-2 basal"이라고합니다. 완전한 합류점에서, hCMEC / D3 세포는 ~ 1 x 105cells / cm2이다.
- 5 분 동안 5 ML 트립신 / EDTA (0.25 %)와 분리 후 칼슘 2 + 및 MG 2 + 없이 3 분 먼저 HBSS와 incubating하여 1시 5 분의 비율로 hCMEC / D3 세포를 통과. EBM - 2 완료 (1시 1 분 중화)를 사용하여 트립신을 중성화하고 4 ° C에서 5 분 동안 290 XG에서 원심 분리하십시오; 상등액을 버린다. 펠렛을 EBM - 2 완료 및 1시 5 분 비율로 다시 접시에 Resuspend.
- 공급 업체의 프로토콜 [ Table of Materials ]에 따라 주요 인간의 혈관 주위 세포 및 성상 교세포를 배양합니다. 문화FBS와 pericyte 성장 보충을 가진 pericyte 기본적인 매체에있는 pericytes.
- 성상 세포 성장 인자를 함유 한 성상 세포에서의 인간 성상 세포 배양. 세포 부착을위한 폴리 -L- 라이신 (PLL) 3 ML로 코팅 조직 배양 플라스크의 pericytes과 astrocytes 모두 문화와 통로 2와 5 사이의 세포를 활용하십시오.
- 7 마리의 마우스를 안락사시키고 포셉으로 뇌간과 소뇌를 제거하십시오. 신중하게 거즈에 두뇌를 굴려하여 meninges를 분리하십시오. 멸균 면도날과 HEPES (뇌 당 5 ML)와 최소 필수 매체 (MEM) 페트리 접시에 남아있는 뇌 조직을 말하다. 참조 된 프로토콜 20 에 따라 2 개월 된 C57BL / 6J 마우스의 기본 마우스 BEC를 분리합니다.
- 15 ML 원뿔 튜브에 다진 뇌 조직을 전송합니다. 4 ° C에서 5 분 동안 290 xg에서 원심 분리하십시오. 뜨는을 제거하고 papain (뇌 당 833.33 μL)과 DNase (뇌 당 41.7 μL)에 조직을 품어용액을 37 ° C 수 욕조에서 1 시간 동안 처리하여 조직을 소화시킨다.
- 19 및 21 게이지 바늘을 통해 균질 물을 순차적으로 분쇄하고 22 % Bovine Serum Albumin (BSA) 용액으로 1 : 1 비율로 혼합하고 4 ℃에서 10 분 동안 1360 xg에서 원심 분리하십시오.
- 4 ML에서 5 분 290 XG에서 1 ML EBM - 2 완료 및 원심 분리기에서 결과 펠렛을 Resuspend ° C. 다시 1 ML EBM - 2에 Resuspend 및 콜라겐 (우물 당 ~ 1 두뇌)로 코팅 6 잘 접시에 세포 (1 ML / 잘) 판.
- 24 시간 후 4 μg / mL 퓨로 마이신 하이드로 클로라이드가 함유 된 EBM-2 완충액으로 배지를 교체하십시오. 2 일 후에 EBM-2로 교체하십시오. 1 차 BEC는 hCMEC / D3 세포와 마찬가지로 배양되고 1 x 105 세포 / cm2에서 완전히 합류한다.
- 분석 전 24 시간 동안 oAβ 100 μM을 준비하십시오.
참고 : oAβ는 A의 질병 관련 형태로 간주됩니다. oAβ의 경우, Dahlgren et al. 21 . - 튜브 당 140 μL 지하 막에서 살균 PCR 튜브 스트립 (8 튜브)로 4 ° C 및 나누어지는에서 하룻밤 지하 멤브레인 주식 솔루션을 해동. -20 ° C에서 각 스트립 및 저장소를 재 윤활하십시오. 분석 4 시간 전에 96- 웰 플레이트 당 1 개의 스트립을 해동 (24 시간). 응고를 피하려면 피펫 팁을 미리 냉각하십시오.
참고 : 신속한 응고를 피하기 위해 기저막 매트릭스의 모든 취급은 얼음에서 수행해야합니다. 분석 당일 10 μL의 기저막이 사용되므로 각 스트립은 하나의 96- 웰 플레이트에 충분합니다. - 분석 전 24 시간 동안 EBM-2 기저부에서 완전히 융합하는 BEC를 배양하십시오.
참고 : 이론적 근거는 다음과 같습니다. EBM-2 complete는 보충 인자와 FBS가 최적의 세포 성장을 촉진 할 목적으로 포함되어 있습니다. 그러나, 세포 성장을 촉진하는 동일한 분자 경로는 뇌 내피 세포 커버 리지 및 역학에있어서, 존재 및 아울러 모두 중요하다스트레스 원의 nce. 따라서 우리는 혈청과 보충제가 세포 신호 전달 경로의 잔류 활성화의 교란 효과를 줄이기 위해 BEC를 굶어 죽인다. 주목할 것은, 세포는 분석 전에 트립신 처리 된 세포의 중화 동안 FBS에 간단히 노출된다 (5 분). BECs와는 달리, 혈장 기아에 대한 반응으로 이들 세포 유형의 성장 및 상대적 불안정성 (타이 실험실, 미발표 관측)에 대한 상이한 요인의 요구 때문에 혈관 주위 세포 및 성상 교세포는 혈청이 굶어지지 않는다.
참고 : EBM - 2 기초는 단일 및 삼중 문화 meshwork 형성 및 중단 assays에 대한 분석하는 동안 활용됩니다. 이것은 스트레스 요인이나 치료에 의존하는 신호 전달을 막는 데 중요합니다.
2. Meshwork와 같은 형성 및 파괴 Assays
- 단일 BEC 배양 검사 :
참고 : BEC의 단일 문화에 대한 세 가지 패러다임은 그림 1A에 표시됩니다 - 분석 당일에, 96- 웰 플레이트의 바닥에 10 μL / 웰의 기저막 매트릭스를 피펫 팅하고 37 ℃에서 1 시간 동안 세팅하도록 허용한다.
- 10 MM 스톡 용액을 생성하기 위해 10 μL DMSO에서 동결 건조 녹색 세포 추적 염료 ( 자료 표 참조)를 일시 중지하고 EBM - 2 기저부에서 10 μM (1 : 1000)로 희석합니다. 완전히 합류 플라스크에서 미디어를 제거하고 녹색 세포 추적 염료 (75cm 2 플라스크 5 ML)를 포함하는 EBM - 2 기초로 바꿉니다. 분석 시작 20 분 전에 BEC에 녹색 세포 추적 염료를 미리 담그십시오.
- 37에서 20-30 분 동안 세포를 품어 ° C, 세포 추적 염료와 매체를 제거하고 단계 1.1에서 설명한대로 세포를 분리하십시오. 10 % FBS를 포함하는 EBM - 2로 매체를 중성화하고 4 ° C에서 5 분 동안 240 XG에서 원심 분리하십시오. 펠렛을 1 ML의 EBM - 2 기저부에 Resuspend.
- EBM - 2 기초 (모든 패러다임에서 0 시간 시점)에서 10,000 세포 / 잘에서 96 - 웰 플레이트에 BECs를 판다.
참고 : 활용되는 패러다임에 따라 치료, 스트레스 요인 또는 차량 컨트롤이 지정된 시점에 추가됩니다. 모든 패러다임에서, 배지는 후속 분석 ( 예 : ELISA 분석)을 위해 수확하고 인산 완충 혈청 (PBS)에서 새로 준비한 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 24 시간 고정합니다. 메쉬 형성에 대한 oAβ의 효과를 결정하기위한 또 다른 접근 방법으로 프로토콜을 수정하여 컨 플루 언트 세포 배양 플라스크에 oAβ를 미리 배양 한 다음 망사 형성 패러다임 (+/- oAβ)을 수행 할 수 있습니다.
참고 : 모든 패러다임에 대한 각 웰의 최종 부피는 70 μL입니다. 모든 치료 (oAβ, EGF 등 )는 1:20 희석, 즉 치료 당 3.5 μL에서 각각의 우물에 첨가됩니다. 패러다임 1의 경우, 세포를 63 μL / w의 세포 현탁 용액에 넣습니다엘. 즉시 oAβ, 원하는 치료법 및 대조군을 각각 3.5 μL / well 씩 첨가하여 총 70 μL를줍니다. 패러다임 2의 경우, 세포 현탁액 63 μL 및 치료 3.5 μL ( 예 : 100 ng / mL EGF)를 0 시간 시점에 추가합니다. 4 시간 배양 한 후, 3.5 μL의 oAβ 스톡을 첨가한다 ( 예 : 100 nM 최종 oAβ 농도, 3.5 μL의 2 μM oAβ 스톡). Paradigm 3의 경우, 세포 현탁액 63 μL를 0 시간 시점에서 첨가하고 4 시간 후 oAβ와 원하는 치료법을 각각 3.5 μL / well 씩 첨가하여 총 70 μL를줍니다. 이 부피는 치료법에 따라 조정될 수 있습니다. 예를 들어, 단 한 번의 치료가 필요한 경우 세포 현탁액을 66.5 μL (10,000 세포 / 웰을 유지)로 조절할 수 있으며 치료 용량은 3.5 μL로 유지 될 수 있습니다.
참고 : BEC의 단일 배양 검사뿐만 아니라,( 예 : oAβ)에 대한 예비 형성된 네트워크 내의 BECs, 혈관 주위 세포 및 성상 세포의 반응을 결정하기 위해 triple culture assay 패러다임 ( 그림 1B )을 개발했다. BEC는 0 시간에서 원하는 치료가있는 상태에서 도금됩니다. 4 시간 후, 혈장 주위 세포를 부드럽게 플레이트에 첨가 하였다. 7 시간에, 성상 교세포를 플레이트에 첨가 한 다음, 11 시간에 스트레스 인자를 첨가 하였다. 세포를 24 시간 시점까지 배양한다.
참고 : 3 배 배양 검사의 경우 모든 세포가 동시에 융합되도록 타이밍을 고려하는 것이 중요합니다. 인간의 성상 세포 및 혈관 주위 세포는 분석 1 주 전에 배양해야하며, hCMEC / D3 세포는 분석 일 4 ~ 5 일 전에 도금 또는 계대해야합니다. 또한, 표현형 표류를 피하기 위해 낮은 통과 (2-5) 기본 세포를 사용하는 것이 중요합니다.
- 분석을 시작하기 전에 hCMEC / D3 세포에 녹색 세포 추적 염료 작동 솔루션을 20 분 추가합니다. 10시 hCMEC / D3 세포를 플레이트, EBM-2 기초 (0 시간 시점)에서 000 세포 / 웰. 사용 된 부피는 세포 현탁액 45 μL와 치료 3.5 μL입니다 ( 즉, 최종 EGF 농도 50 ng / mL, 100 ng / mL 또는 20 배 이상 농축 된 스톡에서 1,000 ng / mL).
- 37 ° C에서 3.5 시간 보육 다음, 인간의 기본 혈관 주위 세포에 파란색 셀 추적 염료 작동 솔루션 (EBM - 2 기저부에 10 μM 세포 추적기 파란색)을 추가합니다. 4 시간 시점 (세포 추적 염료와 함께 ~ 30 분 보육)에서 6 μL / 잘 볼륨 hCMEC / D3을 포함하는 플레이트에 2,000 pericytes / 잘 추가합니다.
- 추가 2.5 시간 부화 (0 시간 시점에서 총 6.5 시간) 후, 인간의 기본 astrocytes에 오렌지 세포 추적 염료 작동 솔루션 (EBM - 2 기저부에 10 μm의 세포 추적기 오렌지)를 추가합니다. 7 시간 시점에서, 부드럽게 12 μL 볼륨에 접시에 10,000 astrocytes를 추가합니다. 따라서, 내피 세포에 대한 전체 세포 비율 : pericytes : astrocytes 내가s 5 : 1 : 5. 또한이 지점까지 도달 한 양은 66.5 μL입니다.
- 4 시간 후 (0 시간 시점에서 총 11 시간) oAβ (100μM 스톡 3.5μL)를 첨가한다.
- PBS에서 갓 준비한 4 % paraformaldehyde에서 13 시간 후 세포를 고정합니다.
주의 : 파라 포름 알데히드를 취급하는 동안 보호 복, 장갑 및 안경을 착용하십시오.
3. 정량화
- 해부 현미경을 사용하여 50 % 최대 전력에서 2 초 노출 시간과 1.6X 배율에서 96 - 웰 플레이트의 전체 우물의 형광 이미지를 캡처합니다.
참고 : 동등한 현미경을 사용할 수 있습니다. 그러나 포괄적 인 분석을 위해 전체 우물을 포획하는 것이 중요합니다. - 정량 분석을 위해 ImageJ 혈관 신생 분석기 플러그인 22 를 사용하여 이미지를 처리하여 분기 수, 메시 수 및 총 셀 길이를 계량합니다 (이 판독 값은 소프트웨re). 이 단계의 상세한 시각적 프로토콜은 그림 2에 나와 있습니다.
- 소프트웨어 아이콘을 클릭하여 피지 ImageJ를 엽니 다.
- 툴바의 끝에있는 두 개의 빨간색 화살표를 클릭하고 "Angiogenesis Analyzer"를 클릭하십시오.
- 이미지 파일이있는 폴더를 선택하고 "열기"를 클릭하십시오.
- "분석 설정"상자가 나타나면 "확인"을 클릭하십시오.
- 처리 할 이미지 수를 나타내는 "이미지 처리 중"상자가 나타나면 "확인"을 클릭하십시오.
- 예상 처리 시간을 나타내는 "일괄 진행 창"상자가 나타납니다. 이 시간 동안 프로그램은 분기 수, 메쉬 수 및 전체 셀 길이를 포함한 출력을 계량합니다.
참고 : 모든 이미지가 정량화되면 결과 파일이 원본 이미지 폴더에 스프레드 시트 문서로 나타납니다. - 고르다스프레드 시트 파일에는 결과가 포함되어 있으며 그룹간에 분기, 메쉬 및 총 셀 길이의 수를 비교합니다.
참고 : Triple culture assay에서 ImageJ는 pericyte / astrocyte 적용 범위와 수를 분석하기 위해 추가로 활용됩니다. 맹인 실험자가 임계 값을 설정하고 판독 값을 생성하는 데 사용되는 "입자 분석"기능을 사용합니다. 고정 세포 및 튜브와 같은 구조는 또한 Aβ 17 또는 다른 마커에 대해 면역 염색 될 수 있습니다.
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Representative Results
단일 문화에서는 hCMEC / D3 세포 ( 그림 3A )와 기본 마우스 BEC ( 그림 3B ) 모두 우물 전체에 망사 모양의 구조를 형성합니다. 구조는 상호 연결된 노드들의 망목을 특징으로합니다 ( 그림 3 ). 설명 된 모든 패러다임 ( 그림 1 )에서, meshwork와 같은 구조는 24 시간 후 대조군에서 유사하여 총 세포 길이가 ~ 10,000 픽셀 인 ~ 20 meshwork와 유사한 구조를 형성합니다.
질병 관련 스트레스 요인에 대한이 방법의 적용 가능성을 강조하기 위해 hAAβ가 hCMEC / D3 및 일차 마우스 BEC에 두 가지 패러다임으로 추가되었습니다. 세포망 형성의 장애 (Paradigm 1)에서 oAβ와 세포는 동시에 도금된다. Preformed meshwork의 패러다임 (Paradigm 2)에서, oAβ는 add세포를 도금 한 4 시간 후 ( 도 1A 참조). 100 nM에서의 oAβ는 미리 형성된 망사 조직의 망상 형 형성 및 퇴화를 방해한다 ( 도 3A , 3B ). 예를 들어 두 가지 패러다임 모두에서 hCMEC / D3 세포를 사용하면 총 세포 도달 범위 / 길이의 정량화는 100nM oAβ 17에서 16-20 % 낮아집니다. 또한 두 패러다임에서 100nM oAβ로 40 %의 메쉬 감소가있었습니다. 따라서 질병 관련 스트레스 요인은 인간과 마우스 BEC 적용 범위에 유사한 해로운 영향을 유도합니다.
세포 배양 시스템의 가장 큰 장점은 질병 관련 손상을 예방하는 요인이나 치료법을 확인하는 능력으로 생체 내 검사 로 넘어갈 수 있다는 것입니다. 원리 실험의 증거로서 주요 혈관 신생 성장 인자가 oAβ에 의해 유도 된 차를 예방하는데 미치는 영향혈관 커버리지를 평가했다. EGF는 hCMEC / D3 세포에 대한 oAβ- 유도 된 손상을 방지 하였다. 이러한 데이터를 기반으로 EGF는 AD 유사 병리학의 중요한 측면을 재현하는 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 예방 패러다임에서 테스트되었습니다. EGF 치료는 혈관 변성을 포함하여인지 및 BBB 결핍을 예방했습니다 23 . 이러한 데이터 는 생체 내 활성에 대한 생체 외 시스템의 예측 잠재력을 뒷받침합니다. 현재, 우리는 1) 메쉬 형성, 2) 세포 망사 붕괴 방지, 3) 망사 혼란의 동시 처리 등 3 가지 개발 패러다임을 모두 스크리닝에 활용합니다. 그림 3 에서 강조한 것처럼, EGF는 불멸화 및 일차 마우스 BEC 배양에서 oAβ로 인한 손상으로부터 보호 할 수 있습니다.
BBB는 전반적으로 cerebrovasc에 기여하는 BEC, 혈관 주위 세포 및 성상 교세포로 구성됩니다보험 적용 범위. 따라서, 체외 시스템의 한 적응은 세 가지 BBB 세포 유형 모두의 통합이다. 우리의 삼중 배양 분석 패러다임은 hCMEC / D3 세포, 기본 인간의 세포 및 기본 인간의 astrocytes를 통합하여 지하 막 매트릭스 ( 그림 1B )에 순차적으로 추가됩니다. 삼중 배양 분석 패러다임에서, hCMEC / D3 세포는 단일 배양 물과 유사한 망상 패턴을 형성하지만, 주엽과 성상 교세포가 노드 및 연결된 가지에 부착되어있다 ( 도 4 ). 100nM oAβ의 첨가는 망목 파열 (~ 10-15 %)을 유도하고 BECs와 접촉하는 세포주 수를 감소시킨다. 단일 배양 분석 패러다임에서 유래 된 데이터와 관련하여, oAβ- 유도 손상은 EGF 처리에 의해 예방된다. 따라서, 삼중 배양 BBB 모델은 성상 교세포의 상호 작용 효과에 초점을 맞춘 연구에 적합하다.ytes 및 BECs에 적용됩니다.
그림 1 : 망사 형성 및 파괴 분석 개요. ( A ) 단일 배양 분석 패러다임. 패러다임 1, 망 구조. 세포, 스트레스 원 및 트리트먼트는 모두 0 시간 시점에서 플레이트에 첨가됩니다. 패러다임 2, 망사 방해 방지. 세포를 원하는 처리제의 존재하에 도말하고, 4 시간 동안 배양하고, 4 시간 시점에 스트레스 인자를 첨가 하였다. 패러다임 3, 메시 작업 중단의 동시 처리. 세포를 도금하고, 처리 4 시간 전에 망사 형 구조물을 형성하고 및 / 또는 스트레스 인자를 4 시간 시점에 동시에 첨가한다. 모든 패러다임은 24 시간 시점에서 끝나고 세포는 4 % 파라 포름 알데히드로 고정됩니다. ( B ) 트리플 배양 분석 패러다임. BECs (10,000 세포 / 웰)는 pres0 시간에서 원하는 치료법을 시행 하였다. 4 시간 시점에서 혈관 주위 세포 (2,000 세포 / 웰)를 플레이트에 부드럽게 첨가 하였다. 7 시간에 성상 교세포 (10,000 세포 / 웰)를 플레이트에 첨가 한 다음, 11 시간에 적절한 스트레스 인자를 첨가 하였다. 세포를 24 시간 시점까지 배양하고 4 % 파라 포름 알데히드로 고정시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 정량 분석. 모든 이미지는 피지 ImageJ에서 열리고 Angiogenesis Analyzer 22를 사용하여 일괄 처리됩니다. 총 길이와 메쉬 수를 정량화합니다. 더 큰 버전의 t를 보려면 여기를 클릭하십시오.그의 모습.
그림 3 : Meshwork 방해 분석 : 대표 이미지. 모든 이미지는 패러다임 2 (Paradigm 2)를 사용하여 실험을 통해 파생되었습니다. (VC), EGF (100nM), oAβ (100nM) 또는 oAβ (100nM) + EGF (100nM)로 도금 및 처리 된 hCMEC / D3 세포의 대표 이미지. 10X 배율의 이미지, 스케일 막대 = 100μm. ( B ) VC, EGF (100nM), oAβ (100nM) 또는 oAβ (100nM) + EGF (100nM)로 도금 및 처리 된 1 차 마우스 BEC의 대표 이미지. 10X 배율의 이미지, 녹색 = BEC, 스케일 막대 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 트리플 배양 분석 : 대표 이미지. VC, EGF (100nM), oAβ (100nM) 또는 oAβ (100nM) + EGF (100nM)로 도금 및 처리 된 hCMEC / D3 세포, 일차 인간 혈관 주위 세포 및 원발성 인간 성상 세포의 대표 이미지 그림 1B에 설명 된 패러다임에 따라 10X 배율, 녹색 = BECs, 파란색 = pericytes 및 빨간색 (pseudocolor) = astrocytes에서 이미지. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
기술 된 방법은 뇌 혈관 커버리지를 둘러싼 몇 가지 근본적인 생물학적 문제를 해결하기 위해 활용 될 수있다. 구체적으로, 그들은 수용체 및 신호 전달 경로가 혈관 신생, 암 조직에서의 혈관 확장 및 뇌와 관련된 말초 내피 세포에서 역할을하는지 확인할 수있다. 예를 들면, 혈관 신생 성장 인자 수용체, 산화 질소, 마이 토겐 활성화 단백질 키나아제 신호 전달 및 칼슘 신호 전달 25,26,27이 있습니다. hCMEC / D3 및 기본 BEC는 이러한 노력을 용이하게하는 유전자 조작 방법으로 개정 할 수있다. 기계적 통찰력은 설명 된 방법으로 핵심 단백질의 전체 또는 내피 세포 특이 적 knockdown과 생쥐에서 격리 BECs를 배양에서 얻을 수 있습니다. 또한, 삼중 배양 분석을 통해 성상 세포와 혈관 주위 세포의 영향을 심층적으로 분석 할 수 있습니다뇌 내피 세포 기능에 대한 정보. 예를 들어, 혈관 주위 세포 및 성상 교세포는 용해성 매개체 ( 예 : angiopoietin, cytokines)의 생성을 통해 meshwork와 같은 혈관 형성에 영향을 줄 수 있으며 구조 지지체를 통해도 형성 될 수 있습니다
모델 시스템은 질병 연구에도 적용될 수 있습니다. 예를 들어,이 시스템은 질병 및 노화 관련 스트레스 요인이 외인성으로 혈관 신생 및 / 또는 망막 파열을 촉진 하는지를 규명 할 수있다. 스트레스 요인은 특정 장애, 예를 들어 oAβ와 관련이 있거나,보다 일반적인 것으로 과산화수소, 사이토 카인과 관련 될 수 있습니다. 삼중 문화 패러다임은 질병 관련 스트레스 요인이 성상 세포 및 혈관 주위 세포를 활성화시켜 BEC 기능을 파괴하는지 여부를 묘사하는 BBB 역학에 영향을 미치는 질병 관련 메커니즘의 중요성을 이해하는 데 도움이되는 복잡한 계층을 추가합니다. 단일 배양 검사와 삼중 배양 검사 모두에서 일차 세포를 이리저리 격리 할 수 있습니다기능적 효과를 더 자세히 묘사하기 위해 관심있는 장애를 모방 한 m 마우스 모델.
망 세포 형질 형성 및 파괴 분석을 상이한 세포 유형에 적응시키기위한 다수의 중요한 고려 사항이있다. 첫 번째는 파종 밀도입니다. 각각의 새로운 세포주에 대해, 중요한 첫 번째 단계는 단일 및 삼중 배양 분석을위한 기저막 매트릭스의 파종 밀도를 최적화하는 것입니다. 메쉬 형성은 세포 수에 의존적인데, 너무 높거나 너무 낮은 세포 밀도는 망목 형성의 결핍을 가져온다. 또한, 본원에 기술 된 방법 및 세포에 대해서조차도,보다 큰 규모의 실험을 수행하기 전에 세포 처리의 임의의 실험실 변동을 설명하기 위해 세포 밀도 비교를 수행하는 것이 현명하다. 두 번째 고려 사항은 망목 형성의 시간 순서이다. 시간 경과 실험은 망사 형 구조가 형성되고 열화되는시기를 식별하기 위해 수행되어야합니다. 일반적으로 견고한 meshwork-l이케 형성은 ~ 4 시간에 관찰된다. 세 번째 고려 사항은 시딩 이전 및 실험 중 매질 선택입니다. BECs, pericytes 및 astrocytes는 FBS 및 세포 성장을 위해 최적화 된 성장 인자의 과다를 포함하는 배지에서 배양됩니다. 혈청과 성장 인자가 실험 전 24 시간 동안 굶기는 것이 바람직하지만, 특정 세포 유형의 경우 이것은 가능하지 않을 수 있습니다. 예를 들어, 특정 수용체 knockdowns와 기본 세포는 성장을 촉진하기 위해 추가적인 요인이 필요할 수 있습니다. 이러한 고려 사항은 실험 중에도 적용되며, 매체의 선택은 조사중인 특정 질문에 따라 다릅니다. 그러나 외인성으로 추가 된 스트레스 요인과 잠재적 치료법, 특히 성장 인자 또는 관련 화합물의 역할을 조사 할 때 실험 중 혈청과 성장 인자가없는 배지를 사용하는 것이 이상적입니다. 또한, BECs의 혈장 기아의 길이를 줄이는 것이 가능할 수도 있지만 이것은 sig에 달려 있습니다조사중인 통로. 네 번째 고려 사항은 스트레스 요인이나 치료법을 추가하는시기입니다. 중간 처리의 선택에 관해서는, 타이밍은 과학적 질문에 기초한다. meshwork 형성 분석은 angiogenesis와 더 유사하지만 meswork disruption assay는 성숙한 BBB와 더 관련이 있습니다. 우리의 경험에 의하면, 일단 확립되면, 실험은 실험간에 일관된 데이터를 생성합니다. 일관성 문제는 종종 직원 간의 밀도 불일치로 인한 것이며, 중요하게는 매체 또는 관련 시약의 구성 요소가 모르게 변경되는 경우입니다.
설명 된 방법의 추가 개발에는 한계와 영역이 있습니다. 이 절차의 강점은 낮은 스트레스 요인 ( 즉, oAβ)이 생리 학적으로 관련이있는 μM에 비해 망막 파열, 즉 nM을 유발하는 데 활용 될 수 있다는 것입니다. 그러나이 강도는 한계 일 수도 있습니다. 사실, 높은, b여전히 비 독성 인 경우 oAβ의 농도는 다른 질병 관련 스트레스 요인에 적용될 감도를 높이기위한 약물 스크리닝 목적으로 필요할 수있다. 이 방법의 한계는 세포의 망사가 설명 된 프로토콜에서 24 시간 동안 만 안정하다는 것이다. 실제로, 24 시간이 지나면 셀 메쉬 작업이 퇴색되기 시작합니다. 따라서, 우리는 18 시간의 총 oAβ 잠복 시간을 가능하게하기 위해 망목 형성 후 비교적 짧은 시간 (4 시간) 후에 oAβ를 첨가한다. 아마도 낮은 세포 파종 밀도는 더 긴 치료 프로토콜을 가능하게 할 수 있습니다. 추가 잠재적 인 한계는 in vitro 시스템이 생체 내에서 관찰되는 것처럼 세포의 안정적인 망상을 모방하지 못할 수도 있다는 것이다. 노화 된 마우스로부터 세포를 분리하는 것은 생체 내 시나리오를 더 유사하게 모방 할 수있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
레온 타이 (Leon Tai)는 일리노이 대학 시카고 스타트 업 펀드가 자금을 지원합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
References
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