Summary
血液脳関門のカバレッジを維持することは、中枢神経系の恒常性にとって重要である。このプロトコルは、血液脳関門のカバレッジを調節する基本的および病理学的プロセスを描写するためのインビトロ技術を記載する 。
Abstract
血液脳関門（BBB）の適用範囲は、中枢神経系（CNS）の恒常性において中心的な役割を果たす。 BBBは、星状細胞、周皮細胞および脳内皮細胞（BEC）によって動的に維持される。ここでは、不死化ヒトBECの単一培養、初代マウスBECの単一培養、およびBBBのヒト化三重培養モデル（BEC、星状細胞および周皮細胞）を使用して、BBBカバレッジを評価する方法を詳述する。疾患状態に対するアッセイの適用性を強調するために、我々は、BBB適用範囲におけるアルツハイマー病（AD）進行の重要な要因であるオリゴマーアミロイドβ（oAβ）の効果を記載する。さらに、本発明者らは、この技術の薬物スクリーニング能力を明らかにするために、上皮増殖因子（EGF）を利用する。本発明者らの結果は、単一および三重培養BECが基底条件下で網目様構造を形成し、oAβがこの細胞網形成を破壊し、予備形成された網構造を変性させ、EGFはこの中断を阻止します。したがって、記載された技術は、BBBカバレッジを調節する基本的かつ疾患関連プロセスを解剖するために重要である。
Introduction
脳毛細血管の血液脳関門（BBB）は、血液と脳の接触の最大の界面であり、中枢神経系（CNS） 1,2の恒常性において中心的な役割を果たす。 BBBでのダイナミックなプロセスは、血液からの不要な分子の取り込みを防ぎ、中枢神経系からの老廃物を除去し、必須の栄養素とシグナル伝達分子をCNSに供給し、神経炎症を調節する1,2,3,4,5。 BBB損傷は、加齢およびアルツハイマー病（AD）、多発性硬化症および脳卒中1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 、ass = "xref"> 6。したがって、BBB機能不全は、治療標的を含む神経変性疾患において重要な役割を果たす可能性がある。
船舶のカバレッジを維持することは、BBBの恒常性機能にとって重要である。しかし、 インビボおよびインビトロでのデータ衝突は、神経変性疾患に関与するプロセスが、特にADにおいて、BBB適用範囲を6,7,8,9,10,11,12,13より高くまたは低くするかどうかについて競合する。したがって、BBBカバレッジのダイナミクスを評価し、より包括的に理解するために、関連する細胞タイプを使用したインビトロモデルの開発には強い根拠があります。脳毛細血管は、星状細胞、周皮細胞および脳内皮細胞（BEC）から構成され、 3 。一般に、BBB機能を評価するための細胞培養技術は、ストレッサー14,15,16の添加後の両方において、フィルターインサート上で増殖させた細胞、または重要なBECタンパク質のレベルを評価する浸透性アッセイである。重要ではあるが、これらのアッセイは脳血管カバレッジに焦点を当てていない。
ここで、我々の以前の方法17は、不死化ヒトBECの単一培養、初代マウスBECの単一培養、およびヒト化三重培養を使用して、BEC適用範囲および網状様構造を評価するために詳述されているBBBのモデル（BEC、星状細胞および周皮細胞）を同定した。目標は、AECがAD進展の重要な要因であると考えられている有害作用がBECの対象範囲に及ぼす影響を実証することでした。表皮成長因子（EGF）の保護効果は、治療スクリーニングツールとしてのこの技術の可能性を強調している。この技術は、1）血管新生および血管カバレッジにおける特定の経路の役割の描写、2）血管新生および血管カバレージに対する疾患および加齢関連因子の影響の評価、および3）薬理学的目標。
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Protocol
すべての実験は、イリノイ大学シカゴ研究所の動物用ケアおよび使用委員会のプロトコールに従う。
1.一般的な準備
注：脳微小血管内皮細胞系（hCMEC / D3）は、広範に特徴付けられた不死化ヒトBEC系統14,15,16,18,19である。基底内皮成長基質培地中のコラーゲンタイプI（子牛皮膚、Ca 2+およびMg 2+を含有するハンクス平衡塩類溶液（HBSS）中0.1％溶液の1:20希釈物）で被覆した組織培養フラスコ上のhCMEC / D3細胞を培養する。 （FBS）、10％アスコルビン酸、10％硫酸ゲンタマイシン、25％ヒドロコルチゾン、および供給された成長因子サプリメントの総量の1/4を含む培地（EBM-2）血管内皮gr（VEGF）、表皮成長因子（EGF）、インスリン様増殖因子1（IGF-1）およびヒト塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）（ 表の表を参照のこと）。
注：FBSおよび増殖因子を含むEBM-2培地は、「EBM-2 complete」と呼ばれる。 FBSおよびサプリメントを含まないEBM-2は、「EBM-2 basal」と呼ばれる。完全コンフルエンスでは、hCMEC / D3細胞は約1×10 5細胞/ cm 2である 。
- Ca 2+およびMg 2+を添加しないで3分間HBSSで最初にインキュベートし、続いて5mLのトリプシン/ EDTA（0.25％）で5分間脱離させることにより、hCMEC / D3細胞を1：5の比率で通過させる。 EBM-2完全（1：1中和）を用いてトリプシンを中和し、290 xgで5分間4℃で遠心分離する;上清を捨てる。ペレットをEBM-2に再懸濁し、1：5の比率で再プレートする。
- サプライヤーのプロトコール[ 材料の一覧 ]に従って初代ヒトの周皮細胞および星状細胞を培養する。文化FBSおよび周皮成長促進剤を伴う周皮細胞基底培地中の周皮細胞。
- astrocyte成長因子を含むastrocyte培地中のヒトアストロサイトを培養する。細胞接着のために3mLのポリ-L-リジン（PLL）で被覆した組織培養フラスコ中の周皮細胞および星状細胞を培養し、継代2と5の間の細胞を利用する。
- 7匹のマウスを安楽死させ、鉗子で脳幹および小脳を除去する;慎重にガーゼの上で脳を圧延して髄膜を剥離する。滅菌カミソリの刃を用いて、HEPES（脳あたり5mL）を含む最小必須培地（MEM）中のペトリ皿中の残りの脳組織を入れ替える。 2ヶ月齢のC57BL / 6Jマウス由来の一次マウスBECを、参照されたプロトコールに従って単離する。
- 細かい脳組織を15 mLコニカルチューブに移す。 4℃で5分間290 xgで遠心分離する。上清を除去し、組織をパパイン（脳あたり833.33μL）およびDNアーゼ（脳あたり41.7μL）中でインキュベートし、溶液を37℃の水浴中で1時間インキュベートして、組織を消化する。
- ホモジネートを19および21ゲージ針で順次粉砕し、22％ウシ血清アルブミン（BSA）溶液と1：1の比で混合し、1360 xgで10分間4℃で遠心分離する。
- 得られたペレットを1 mLのEBM-2に再懸濁し、4℃で5分間290 xgで遠心分離します。再度1mLのEBM-2で再懸濁し、コラーゲンでコーティングした6ウェルプレート（ウェルあたり〜1脳）に細胞（1mL /ウェル）をプレートする。
- 24時間後に4μg/ mL塩酸ピューロマイシンを含むEBM-2完全培地に交換する。 2日後にEBM-2と交換してください。初代BECは、hCMEC / D3細胞と同様に培養され、1×10 5細胞/ cm 2で完全コンフルエントになる。
- アッセイの24時間前に100μMのoAβを調製する。
注：oAβは、Aの疾患関連形態と考えられる。 oAβについては、Dahlgren ら。 21 。 - 4℃で一晩、基底膜ストック溶液を解凍し、チューブあたり140μLの基底膜で無菌PCRチューブストリップ（8チューブ）に等分する。各ストリップを-20℃で再凍結する。アッセイの24時間前に、4℃で96ウェルプレートあたり1つのストリップを解凍する。凝固を避けるためにピペットチップをあらかじめ冷却しておいてください。
注：基底膜マトリックスの取り扱いはすべて急速凝固を避けるために氷上で行う必要があります。アッセイ当日に1ウェルあたり10μLの基底膜が使用されるので、各ストリップは1つの96ウェルプレートに十分である。 - アッセイの24時間前に、EBM-2基礎中の完全にコンフルエントなBECをインキュベートする。
注：理論的根拠は次のとおりです。EBM-2 completeには、最適な細胞増殖を促進する目的で、補足因子とFBSが含まれています。しかし、細胞増殖を促進する同じ分子経路も、脳内皮細胞のカバレッジおよびダイナミクスのために、存在下および非存在下の両方で重要であるストレス要因のnce。従って、我々は、血清および補充物がBECを飢えさせて、細胞シグナル伝達経路の残留活性化の交絡作用を減少させる。注目すべきことに、アッセイ前に細胞をトリプシン処理した細胞の中和中にFBSに短時間（5分間）曝露する。 BECとは対照的に、血清飢餓に応答したこれらの細胞型の増殖および相対的不安定性のために、周皮細胞および星状細胞は血清飢餓状態ではない（タイ実験室、未発表の観察）。
注：EBM-2基礎は、一回および三重培養の網目形成および破壊アッセイのアッセイ中に利用される。これは、交絡ストレッサーまたは治療依存性シグナル伝達を防止するために重要である。
2.メッシュワーク様の形成および破壊アッセイ
- 単一BEC培養アッセイ：
注：BECの単一培養の3つの異なるパラダイムが図1Aに示されている - アッセイ当日に、96ウェルプレートの底に10μL/ウェルの基底膜マトリックスをピペットで移し、37℃で1時間セットした。
- 凍結乾燥緑色細胞トラッキング色素（ 材料の表を参照）を10μLDMSOに懸濁して10mMストック溶液を生成させ、EBM-2基底で10μM（1：1000）に希釈する。完全にコンフルエントなフラスコから培地を除去し、緑色細胞トラッキング色素（75cm 2フラスコの場合5mL）を含むEBM-2基底と交換する。アッセイを開始する20分前にBECに緑色細胞トラッキング色素をプレロードする。
- 37℃で20〜30分間細胞をインキュベートし、細胞トラッキング色素で培地を除去し、ステップ1.1で説明したように細胞を剥がす。 10％FBSを含むEBM-2で培地を中和し、4℃で5分間240xgで遠心分離します。ペレットを1mLのEBM-2基底に再懸濁する。
- EBM-2基礎（すべてのパラダイムで0時間時点）で10,000細胞/ウェルで96ウェルプレート中のBECをプレートする。
注：利用されているパラダイムに応じて、治療、ストレッサー、またはビークルコントロールが指定された時点で追加されます。すべてのパラダイムで、培地を次の分析（ 例えば ELISA分析）のために採取し、細胞を24時間後に新たに調製した4％パラホルムアルデヒドをリン酸緩衝化血清（PBS）に固定する。メッシュ形成に及ぼすoAβの効果を決定する別のアプローチとして、プロトコールを改変して、コンフルエントな細胞培養フラスコをoAβと共にプレインキュベートし、次いで網目形成パラダイム（+/-oAβ）を実施することができる。
注：すべてのパラダイムの各ウェルの最終容量は70μLです。すべての処理（oAβ、EGF など ）を1:20希釈、 すなわち処理あたり3.5μLでそれぞれのウェルに加える。パラダイム1については、細胞懸濁液中に63μL/ well。直ちに、所望の処置および対照をそれぞれ3.5μL/ウェルで加え、合計70μLとする。パラダイム2では、63時間の細胞懸濁液および3.5μLの処理（ 例えば 100ng / mLのEGF）を0時間の時点で加える。 4時間のインキュベーションの後、3.5μLのoAβストックを添加する（ 例えば 、100nMの最終OAβ濃度、3.5μLの2μMoAβストックについて）。パラダイム3については、63時間の細胞懸濁液を0時間の時点で添加し、4時間で、所望の処置をそれぞれ3.5μL/ウェルで加え、合計70μLとする。これらのボリュームは、治療法に応じて調整することができます。例えば、1回の処置のみが必要な場合、細胞浮遊液量は66.5μL（10,000細胞/ウェルを維持する）に調整することができ、処理量は3.5μLのままでよい。
注：BECの単一培養アッセイに加えて、我々は、関連するストレッサー（ 例： oAβ）に対する予備形成されたネットワーク内のBEC、周皮細胞、および星状細胞の応答を決定するための三重培養アッセイパラダイム（ 図1B ）を開発した。 BECは、0時間で所望の処理の存在下でメッキされる。 4時間で、周皮細胞を静かにプレートに添加する。 7時間目に、星状細胞をプレートに添加し、続いて11時間でストレッサーを添加する。次いで、24時間の時点まで細胞をインキュベートする。
注：トリプル培養アッセイの場合、すべての細胞が同時にコンフルエントになるようにタイミングを検討することが重要です。アッセイの1週間前にヒトの星状細胞および周皮細胞を培養しなければならないが、hCMEC / D3細胞はアッセイ日の4〜5日前に培養または継代培養する必要がある。さらに、表現型のドリフトを避けるために、低継代（2-5）初代細胞を使用することが重要である。
- アッセイを開始する20分前に、緑色の細胞追跡色素操作溶液をhCMEC / D3細胞に添加する。 10にhCMEC / D3細胞をプレートする。、EBM-2基底（0時間時点）における000細胞/ウェル。使用される容量は、45μLの細胞懸濁液および3.5μLの処理（ すなわち 、20倍濃縮されたストックから50ng / mL、100ng / mLまたは1,000ng / mLの最終EGF濃度）である。
- 37℃で3.5時間インキュベートした後、青色細胞追跡色素作動溶液（EBM-2基底部の10μM細胞トラッカーブルー）をヒトの周皮細胞に添加する。 4時間の時点（細胞トラッキング色素を用いて約30分間のインキュベーション）で、6μL/ウェルの体積のhCMEC / D3を含むプレートに2,000細胞/周を静かに加える。
- 追加の2.5時間のインキュベーション（0時間時点から合計6.5時間）後、オレンジ細胞追跡色素作動溶液（EBM-2基底部に10μM細胞トラッカーオレンジ）をヒト初代星状細胞に加える。 7時間の時点で、12μL容量のプレートに10,000個の星状細胞/ウェルを静かに加える。したがって、内皮細胞：血管周囲細胞：星状細胞is 5：1：5である。さらに、この時点までに達成された体積は66.5μLである。
- 4時間後（0時間の時点から合計11時間）、oAβ（100μMストック3.5μL）を加える。
- 新しく調製したPBS中の4％パラホルムアルデヒド中で13時間後に細胞を固定する。
注意：パラホルムアルデヒドを取り扱う際は保護服、手袋、眼鏡を着用してください。
3.定量
- 96ウェルプレートのウェル全体の蛍光画像を解剖顕微鏡を用いて50％最大出力で2秒の曝露時間で1.6倍の倍率で捕捉する。
注：等価顕微鏡を利用することができます。ただし、包括的な分析のためにウェル全体をキャプチャすることが重要です。 - 定量分析のために、ImageJ血管新生分析プラグイン22を使用して画像を処理して、枝の数、メッシュの数、および全細胞の長さを定量する（これらの読み取り値は、ソフトワre）を使用します。このステップの詳細なビジュアルプロトコルを図2に示します。
- ソフトウェアアイコンをクリックしてfiji ImageJを開きます。
- ツールバーの最後にある二重赤矢印をクリックし、「Angiogenesis Analyzer」をクリックします。
- イメージファイルを含むフォルダを選択し、[開く]をクリックします。
- [分析の設定]ボックスが表示されたら、[OK]をクリックします。
- 処理する画像の数を示す「画像の処理」ボックスが表示されたら、「OK」をクリックします。
- 「バッチ進行状況」ボックスが表示され、予測処理時間が示されます。この時間の間、プログラムは、分岐の数、メッシュの数、および全セル長さを含む出力を定量化する。
注：すべてのイメージが定量化されると、結果ファイルは元のイメージフォルダにスプレッドシートドキュメントとして表示されます。 - 選択スプレッドシートファイルには結果が含まれ、グループ間のブランチ、メッシュ、およびセルの総数が比較されます。
注：三重培養アッセイにおいて、ImageJは、周細胞/星状細胞のカバレージおよび数を分析するためにさらに利用される。画像は、盲検の実験者によって閾値処理され、「粒子を分析する」機能は、読み取り値を生成するために利用される。固定された細胞および管様構造も、Aβ17または他のマーカーについて免疫染色することができる。
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Representative Results
単一培養では、hCMEC / D3細胞（ 図3A ）および初代マウスBEC（ 図3B ）の両方が、ウェル全体にわたって網目状の構造を形成する。構造は、相互リンクされたノードの網目構造によって特徴付けられます （ 図3 ）。記載されたすべてのパラダイム（ 図1 ）において、メッシュワーク様構造は、対照群で24時間後に似ており、約20,000メッシュのような構造を形成し、全細胞長は〜10,000ピクセルであった。
疾患に関連するストレッサーへの方法の適用性を強調するために、hAAβをhCMEC / D3および一次マウスBECに2つのパラダイムで加えた。細胞網形成の破壊（パラダイム1）において、oAβおよび細胞は同時にメッキされる。あらかじめ形成された網目構造の破壊（パラダイム2）において、oAβは、細胞をプレーティングした4時間後に（ 図1A参照）。 100nMでのoAβは、メッシュワーク様の形成および予め形成されたメッシュワークの変性を破壊する（ 図3A 、 3B ）。例えば、両方のパラダイムでhCMEC / D3細胞を使用すると、全細胞カバレッジ/長さの定量化は100nMのoAβ17で16-20％低い。さらに、両方のパラダイム17において、メッシュの数は100nMのoAβで40％減少する。したがって、疾患関連ストレッサーは、ヒトおよびマウスのBEC適用範囲に同様の有害な影響を誘発する。
細胞培養系の重要な利点は、病気に関連した損傷を防止する因子または治療を同定する能力であり、その後インビボでの試験に進むことができる。原則的な実験の証拠として、主要な血管新生増殖因子がoAβ誘導性chaの予防に及ぼす影響船舶のカバレッジへの影響を評価した17 。 EGFは、hCMEC / D3細胞に対するoAβ誘発損傷を防止した。これらのデータに基づいて、EGFは、AD様病変の重要な局面を再現するトランスジェニックマウスモデルを用いた予防パラダイムにおいて試験された。 EGF処置は、血管変性を含む認知およびBBBの障害を予防した23 。これらのデータは、in vivo活性のin vitro系の予測可能性を裏付けるものである。現在、私たちは、1）メッシュの形成、2）細胞網の破壊の防止、および3）網目の破壊の同時処理の3つのパラダイムをスクリーニングのために利用する。 図3に示されているように、EGFは、不死化マウスおよび初代マウスBEC培養におけるoAβ誘導性損傷に対して保護することができる。
BBBは、全体的に脳血管に寄与するBEC、周皮細胞および星状細胞からなる適用範囲。したがって、 インビトロシステムの1つの適応は、3つのBBB細胞型のすべての組み込みである。当社の三重培養アッセイパラダイムには、hCMEC / D3細胞、初代ヒト周皮細胞および初代ヒト星状細胞が組み込まれており、これらは基底膜マトリックス（ 図1B ）に順次追加されます。三重培養アッセイのパラダイムでは、hCMEC / D3細胞は単一培養物と同様の網目状パターンを形成するが、周細胞および星状膠細胞が節および連結枝に付着している（ 図4 ）。 100nMのoAβの添加は、網目状破壊（〜10-15％）およびBECsと接触する周皮細胞数の減少を誘導する。単一培養アッセイのパラダイムから得られたデータと相関して、oAβ誘発損傷は、EGF処理によって防止される。したがって、三重培養BBBモデルは、アストロサイトの相互作用に焦点を当てた研究によく適している船舶動力学に関するYTEおよびBECs。
図1：網目形成および破壊アッセイの概要。 （ A ）単一培養アッセイパラダイム。パラダイム1、網目の形成。細胞、ストレッサーおよび処理は、0時間の時点で全てプレートに加えられる。パラダイム2、網目の破壊の防止。細胞を所望の処理の存在下で播種し、4時間インキュベートし、ストレッサーを4時間の時点で加える。パラダイム3、網目破壊の同時処理。細胞をプレーティングし、処置の前に4時間、および/または4時間の時点でストレッサーを同時に添加して、網目状構造を形成させる。全てのパラダイムは24時間時点で終了し、細胞は4％パラホルムアルデヒドで固定される。 （ B ）三重培養アッセイパラダイム。 BECs（10,000細胞/ウェル）をプレースにプレーティングする所望の処理を0時間で実施した。 4時間の時点で、周皮細胞（2,000細胞/ウェル）を静かにプレートに添加する。 7時間目にアストロサイト（10,000細胞/ウェル）をプレートに添加し、続いて関連ストレッサーを11時間で添加する。次いで、細胞を24時間時点までインキュベートし、4％パラホルムアルデヒドで固定する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：定量分析。すべての画像をFiji ImageJで開き、Angiogenesis Analyzer 22を使用してバッチ処理した。全長およびメッシュ数の定量化が利用される。 より大きなバージョンのtを見るにはここをクリックしてください彼の姿。
図3：Meshwork破壊アッセイ：代表的な画像。すべての画像は、Paradigm 2、網目の破壊を利用した実験から得られたものです。 （ A ）ビヒクル対照（VC）、EGF（100nM）、oAβ（100nM）、またはoAβ（100nM）+ EGF（100nM）で平板培養および処理されたhCMEC / D3細胞の代表的画像。 10倍の画像、スケールバー=100μm。 （ B ）VC、EGF（100nM）、oAβ（100nM）またはoAβ（100nM）+ EGF（100nM）で処理および処理された一次マウスBECの代表的画像。 10倍の画像、緑色= BEC、スケールバー=100μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4.トリプル培養アッセイ：代表的な画像。 VC、EGF（100nM）、oAβ（100nM）、またはoAβ（100nM）+ EGF（100nM）でメッキおよび処理されたhCMEC / D3細胞、初代ヒト周皮細胞および初代ヒト星状細胞の代表的な画像（ A ） 図1Bに記載されたパラダイムに従う。 10倍の倍率で画像、緑色= BEC、青色=周皮細胞、および赤色（疑似色）=星状細胞。スケールバー=100μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
記載された方法は、脳血管カバレッジを取り巻くいくつかの基本的な生物学的問題に対処するために利用することができる24 。具体的には、どの受容体およびシグナル伝達経路が、血管新生、癌組織における血管カバレッジ、および脳に関連する末梢内皮細胞において役割を果たすかを同定することができる。例としては、血管新生増殖因子受容体、酸化窒素、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼシグナル伝達およびカルシウムシグナル伝達25,26,27が挙げられる。 hCMEC / D3および一次BECsは、この努力を容易にするための遺伝的ノックダウンアプローチに修正可能である18 。メカニズム的な洞察は、記載された方法で重要なタンパク質の完全または内皮細胞特異的ノックダウンを有するマウスから単離されたBECを培養することによって得ることができる。さらに、三重培養アッセイは、星状細胞および周皮細胞の影響を詳細に分析することを可能にする脳内皮細胞機能上のe。例えば、周皮細胞および星状細胞は、可溶性メディエーター（ 例えば、アンギオポイエチン、サイトカイン）の産生および構造支持体24を介したメッシュワーク様の血管形成に影響を及ぼし得る。
モデルシステムは、疾患研究にも適用することができます。例えば、系は、疾患に関係するストレッサーおよび加齢に関連するストレッサーが血管新生および/または網目の破壊を外因的に促進するか否かに対処することができる。ストレス因子は特定の障害、 例えば oAβ、またはより一般化されたもの、 例えば過酸化水素、サイトカインに関連し得る。トリプルカルチャーパラダイムは、疾患関連ストレッサーが星状細胞および周皮細胞を活性化してBEC機能を破壊するかどうかを描写する、BBBダイナミクスに影響を及ぼす、重要な疾患関連メカニズムの理解を向上させる複雑な層を追加する。一重培養アッセイおよび三重培養アッセイの両方について、一次細胞は、機能的効果をさらに詳細に描写するために、興味のある障害を模倣するmマウスモデルである。
網目状の形成および破壊アッセイを異なる細胞型に適応させるためには、いくつかの重要な考慮事項がある。最初は播種密度です。各新しい細胞株について、重要な第1のステップは、単一培養アッセイおよび3重培養アッセイの両方について基底膜マトリックスの播種密度を最適化することである。高すぎる細胞密度または低すぎる細胞密度は、網目形成の欠如をもたらすので、メッシュ形成は細胞数に依存する。さらに、本明細書に記載の方法および細胞でさえ、より大規模な実験を行う前に、細胞処理における任意の実験室の変動を説明するために、細胞密度の比較を行うことが賢明である。第2の考慮事項は、網目形成の時間的順序である。網目状の構造が形成され、劣化する時期を特定するために、時間経過の実験を実施すべきである。典型的には、強固な網目構造like形成は約4時間で観察される。第3の考察は、播種前および実験中の培地の選択である。 BEC、周皮細胞および星状膠細胞は、FBSおよび細胞増殖に最適化された多数の増殖因子を含む培地で培養される。実験の24時間前に血清および成長因子がBECを飢えさせることが好ましいが、特定の細胞型についてはこれは実現可能ではない可能性がある。例えば、特異的受容体ノックダウンを有する初代細胞は、増殖を促進するためにさらなる因子を必要とすることがある。これらの考察は実験中にも当てはまり、培地の選択は調査中の特定の質問に依存する。しかしながら、外因的に添加されるストレッサーおよび潜在的な処置、特に成長因子または関連化合物の役割を調べる場合、実験中の血清および成長因子不含培地の使用が理想的である。さらに、BECの血清飢餓の長さを減少させることが可能であり得るが、これはsigに依存する調査中の看護経路。第4の考慮事項は、ストレッサーまたは処理を加えるタイミングである。媒体処理の選択に関しては、タイミングは科学的な質問に基づいている。メッシュワーク形成アッセイは、血管形成とより類似しているが、メッシュワーク破壊アッセイは、成熟BBBにより適切であり得る。我々の経験では、いったん確立されると、アッセイは実験間で一貫したデータを生成する。一貫性の問題は、多くの場合、人員間の密度の不一致によるものであり、重要なことに、媒体または関連する試薬の成分が知らされていない場合に生じる。
記載された方法のさらなる発展の限界および分野がある。この手順の強みは、低生理的ストレス因子（ すなわち、 oAβ）を利用して、より生理学的に関連する網目破壊、 すなわち μMと比較したnMを誘導することができることである。しかし、この強さは限界かもしれない。確かに、より高い、b依然として無毒であるため、他の疾患関連ストレッサーに適用される感度を高めるために、スクリーニング目的にはoAβの濃度が必要とされることがある。この方法の限界は、細胞の網目構造が、記載されたプロトコールにおいて24時間にわたってのみ安定であることである。確かに、24時間後、細胞の網状組織は退化し始める。したがって、18時間の総oAβインキュベーション時間を可能にするために、網状組織形成後比較的短い時間（4時間）後にoAβを添加する。おそらく、より低い細胞播種密度は、より長い処置プロトコールを可能にし得る。更なる潜在的な限界は、インビトロ系がインビボで観察されるような細胞の安定した網目構造を模倣しない可能性があることである。老化したマウスから細胞を単離することは、in vivoシナリオをより詳細に模倣することができる 。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
レオン・タイは、イリノイ大学シカゴの創業資金によって資金提供を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
References
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