Summary
Att upprätthålla blod-hjärnbarriär täckning är nyckeln till hemostasen i centrala nervsystemet. Detta protokoll beskriver in vitro- tekniker för att avgränsa de grundläggande och patologiska processerna som modulerar blod-hjärnbarriär täckning.
Abstract
Blood-brain barrier (BBB) täckning spelar en central roll i hemostas i centrala nervsystemet (CNS). BBB hålls dynamiskt av astrocyter, pericytes och hjärnendotelceller (BEC). Här beskriver vi metoder för att bedöma BBB-täckning med användning av enskilda kulturer av odödliga humana BEC, enskilda kulturer av primära mus-BEC och en humaniserad trippelkulturmodell (BEC, astrocyter och pericyt) hos BBB. För att lyfta fram användbarheten av analyserna till sjukdomstillstånd beskriver vi effekten av oligomer amyloid-P (oAβ), vilket är en viktig bidragsyter till Alzheimers sjukdom (AD) -framsteg, på BBB-täckning. Vidare använder vi den epidermala tillväxtfaktorn (EGF) för att belysa läkemedelsscreeningspotentialen hos teknikerna. Våra resultat visar att enkla och tredubblade odlade BEC bildar meshworkliknande strukturer under basala förhållanden och att oAβ stör denna cellnätverksbildning och degenererar de förformade maskestrukturerna,Men EGF blockerar denna störning. Således är de beskrivna teknikerna viktiga för att dissekera grundläggande och sjukdomsrelaterade processer som modulerar BBB-täckning.
Introduction
Blocket-hjärnbarriären (BBB) av cerebrala kapillärer är det största gränssnittet mellan blod och hjärnans kontakt och spelar en central roll i hemostasen i centrala nervsystemet (CNS) 1 , 2 . Dynamiska processer vid BBB hindrar upptag av oönskade molekyler från blodet, tar bort avfallsprodukter från CNS, levererar väsentliga näringsämnen och signalmolekyler till CNS och modulerar neuroinflammation 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . BBB-skada är utbredd under åldrande och flera neurodegenerativa störningar inklusive Alzheimers sjukdom (AD), multipel skleros och stroke 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Röv = "xref"> 6. Därför kan BBB-dysfunktion spela en nyckelroll i neurodegenerativa störningar, inklusive som ett terapeutiskt mål.
Att behålla fartygets täckning är viktigt för BBB: s hemostatiska funktioner. In vivo och in vitro data konflikt om huruvida processerna som är involverade i neurodegenerativa störningar orsakar högre eller lägre BBB-täckning 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , särskilt i AD. Därför finns det en stark motivering för utvecklingen av in vitro- modeller med användning av relevanta celltyper för att bedöma och förstå djupare BBB-täckningens dynamik. Cerebral kapillärer är sammansatta av astrocyter, pericytes och hjärnendotelceller (BEC) 3 . I allmänhet är cellodlingsteknikerna för att bedöma BBB-funktionen permeabilitetsanalyser utförda på celler odlade på filterinsatser, eller bedömning av nivåer av nyckel-BEC-proteiner, båda efter tillsats av stressorer 14 , 15 , 16 . Även om viktiga, fokuserar dessa analyser inte på cerebrovaskulär täckning.
Här är våra tidigare metoder 17 detaljerade för att bedöma BEC-täckning och meshworkliknande strukturer med användning av enskilda kulturer av odödliga humana BEC, enskilda kulturer av primära mus-BEC och en humaniserad trippel kulturModell (BEC, astrocyter och pericytes) av BBB. Målet var att demonstrera skadlig effekt av oAβ, som anses vara en viktig bidragsyter till AD-progression, på BEC-täckning. Den skyddande effekten av epidermal tillväxtfaktorn (EGF) framhäver potentialen hos tekniken som ett terapeutiskt screeningsverktyg. Tekniken har flera brett tillämpningar för grundläggande och tillämpad forskning, bland annat: 1) avgränsa rollen av specifika vägar för angiogenes och kärlskydd, 2) utvärdera effekterna av sjukdomar och åldringsrelevanta faktorer vid angiogenes och kärltäckning, och 3) identifiera farmakologiska mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment följer University of Illinois, Chicago Institutional Animal Care and Use Committee protokoll.
1. Allmänna preparat
OBS: Hjärnens mikrovaskulära endotelcellinje (hCMEC / D3) är en omfattande karaktäriserad odödlig human BEC-linje 14 , 15 , 16 , 18 , 19 . Kultur hCMEC / D3-cellerna på vävnadskulturflaskor belagda med kollagen typ I (kalvskinn, 1:20 utspädning av 0,1% lösning i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) innehållande Ca 2+ och Mg 2+ ) i basalt endotelväxelbasalt medium (EBM-2) innehållande 2-5% fetalt bovint serum (FBS), 10% askorbinsyra, 10% gentamicinsulfat, 25% hydrokortison och 1/4 av den totala volymen av de tillförda tillväxtfaktor-tillskott per 500 ml medium [ Vaskulärt endotelium grOvf-faktor (VEGF), epidermal tillväxtfaktor (EGF), insulinliknande tillväxtfaktor 1 (IGF-1) och human basisk fibroblastisk tillväxtfaktor (bFGF), se tabell över material ].
OBS: EBM-2-medium med FBS och tillväxtfaktorer kallas "EBM-2 komplett". EBM-2 utan FBS och kosttillskott kallas "EBM-2 basal". Vid full sammanflöde är hCMEC / D3-cellerna ~ 1 x 10 ^ celler / cm ^ .
- Passera hCMEC / D3-cellerna i ett förhållande av 1: 5 genom att först inkubera med HBSS i 3 minuter utan Ca 2+ och Mg 2+ följt av avlägsnande med 5 ml trypsin / EDTA (0,25%) i 5 min. Neutralisera trypsinet genom att använda EBM-2 komplett (1: 1 neutralisering) och centrifugera vid 290 xg under 5 min vid 4 ° C; Kassera supernatanten. Resuspendera pelleten i EBM-2 komplett och omplätt i förhållandet 1: 5.
- Kultur de primära mänskliga pericyterna och astrocyterna enligt leverantörens protokoll [ Materialtabell ]. culturE pericytes i pericyte basalt medium med FBS och pericyte tillväxttillskott.
- Kultur de mänskliga astrocyterna i astrocytmedium som innehåller astrocyttillväxtfaktorer. Kultur både pericytema och astrocyterna i vävnadskulturflaskor belagda med 3 ml poly-L-lysin (PLL) för celladhäftning och utnyttja cellerna mellan passagerna 2 och 5.
- Euthanize 7 möss och ta bort hjärnstammarna och cerebella med pincett; Lossa meninges genom att noggrant rulla hjärnorna på gasbindning. Mince den återstående hjärnvävnaden i en petriskål i Minimal Essential Medium (MEM) med HEPES (5 ml per hjärna) med ett sterilt rakblad. Isolera primära mus-BEC från 2 månader gamla C57BL / 6J möss enligt det refererade protokollet 20 .
- Överför den malet hjärnvävnaden till ett 15 ml koniskt rör. Centrifugera vid 290 xg i 5 min vid 4 ° C. Ta bort supernatanten och inkubera vävnaden i en papain (833,33 μL per hjärna) och DNas (41,7 μL per hjärna)Lösning i ett 37 ° C vattenbad under 1 h för att smälta vävnaden.
- Triturera homogenatet i följd genom 19 och 21 gauge nålar, blanda i ett förhållande 1: 1 med en 22% Bovine Serum Albumin (BSA) lösning och centrifugera vid 1360 xg i 10 minuter vid 4 ° C.
- Resuspendera den resulterande pelleten i 1 ml EBM-2 komplett och centrifugera vid 290 xg under 5 minuter vid 4 ° C. Resuspendera igen i 1 ml EBM-2 och fyll i cellerna (1 ml / brunn) på plattor med 6 brunnar belagda med kollagen (~ 1 hjärna per brunn).
- Byt media 24 timmar senare med EBM-2 komplett innehållande 4 μg / ml puromycinhydroklorid; Byt ut med EBM-2 komplett efter 2 dagar. De primära BEC odlas som för hCMEC / D3-cellerna och är vid full sammanflöde vid 1 x 10 ^ celler / cm2.
- Förbered en 100 μM oAp, 24 h före analysen.
OBS: oAβ anses vara den sjukdomsrelevanta formen av A. För oAβ, använd de välkända preparat som beskrivs av DahlgreN et al. 21 . - Tina basalmembranförrådslösningen över natten vid 4 ° C och alikvot i sterila PCR-rörremsor (8 rör) vid 140 | il basmembran per rör. Återfrysta varje remsa och lagra vid -20 ° C. Tina en remsa per 96-brunnsplatta vid 4 ° C, 24 h före analysen. Förkyl pipettspetsarna för att undvika stelning.
OBS! All hantering av basmembranmatrisen måste utföras på is för att undvika snabb stelning. Eftersom 10 μl per brunn av källarmembran används på analysdagen är varje band tillräcklig för en 96-brunnsplatta. - Inkubera fullständigt sammanflösta BEC i EBM-2 basal, 24 h före analysen.
OBS: Redenen är: EBM-2 komplett innehåller kompletterade faktorer och FBS med syfte att främja optimal celltillväxt; Samma molekylära vägar som främjar celltillväxt är också viktiga för hjärnendotelcells täckning och dynamik, både i närvaro och abseNce av en stressor. Vi svälter därför serum och tillägg BEC för att minska störningsverkan av återstående aktivering av cellulära signalvägar. Observera är cellerna kort (5 min) utsatta för FBS under neutralisering av trypsiniserade celler före analysen. I motsats till BEC är pericyterna och astrocyterna inte svält i serum på grund av kravet på olika faktorer för tillväxt och den relativa instabiliteten hos dessa celltyper som svar på serumstarking (Tai-laboratorium, obublicerade observationer).
OBS: EBM-2 basal används vid analysen för enkla och tredubbla odlingsnätverksbildnings-och störningsanalyser. Detta är kritiskt för att förhindra störande stressor eller behandlingsberoende signalering.
2. Meshwork-liknande formations- och störningsanalyser
- Enkla BEC-odlingsanalyser:
OBS: Tre olika paradigmer för de enskilda kulturerna av BEC visas i Figur 1A - På dagen för analysen pipetterar basmembranmatrisen vid 10 | il / brunn i botten av 96-brunnsplattor och tillåts sätta i 1 timme vid 37 ° C.
- Suspendera den lyofiliserade gröncellspårningsfärgen (se tabell över material ) i 10 | il DMSO för att alstra en 10 mM stocklösning och späd till 10 | iM (1: 1000) i EBM-2 basal. Ta bort mediet från den fullständigt sammanflammade kolven och byt ut den med EBM-2 basal innehållande gröncellspårningsfärgen (5 ml för en 75 cm 2 kolv). Preload BECs med gröncellspårningsfärg, 20 min före analysens start.
- Inkubera cellerna i 20-30 minuter vid 37 ° C, avlägsna mediet med cellspårningsfärg och avlägsna cellerna som beskrivs i steg 1.1. Neutralisera mediet med EBM-2 innehållande 10% FBS och centrifugera vid 240 xg i 5 min vid 4 ° C. Resuspendera pelleten i 1 ml EBM-2 basal.
- Placera BEC i 96-brunnsplattan vid 10 000 celler / brunn i EBM-2 basal (0 h tidpunkt i alla paradigmer).
OBS: Beroende på vilket paradigm som används, läggs behandlingar, stressorer eller fordonskontroller vid de angivna tidpunkterna. I alla paradigmer skördas mediet för efterföljande analys ( t.ex. ELISA-analys) och celler fixeras vid 24 timmar med nyberedd 4% paraformaldehyd i fosfatbuffert serum (PBS). Som ett alternativt tillvägagångssätt för att bestämma termen effekter av oAβ på meshbildning kan protokollet modifieras för att inkubera sammanflytande cellodlingskolvar med oAp och sedan utföra meshworkbildningsparadigmema (+/- oAβ).
OBS: Den slutliga volymen i varje brunn för alla paradigmer är 70 μL. Alla behandlingar (oAβ, EGF, etc. ) sättes till sina respektive brunnar vid en 1:20 spädning, dvs 3,5 μl per behandling. För Paradigm 1 tillsätts cellerna i en cellususionslösning vid 63 | il / viktaln. Omedelbart oAp, önskade behandlingar och kontroller tillsätts vid 3,5 | il / brunn vardera, vilket ger totalt 70 pl. För Paradigm 2 tillsättes 63 | j, l cell suspension och 3,5 | j, l behandling (t ex 100 ng / ml EGF) vid 0 h tidpunkten. Efter 4 timmars inkubation tillsätts 3,5 jil av ett oAp-lager (t ex för 100 nM slutlig oAp-koncentration, 3,5 jil av 2 pM oAp-lager). För Paradigm 3 tillsättes 63 pl celluppsättning vid 0 h tidpunkten och vid 4 h tillsätts oAp och önskade behandlingar vid 3,5 | il / brunn, vilket ger totalt 70 pl. Dessa volymer kan justeras enligt behandlingar. Till exempel, om endast en behandling är nödvändig, kan cellsuspensionsvolymen justeras till 66,5 μL (upprätthållande 10 000 celler / brunn) och behandlingsvolymen kan förbli vid 3,5 μl.
OBS! Förutom de enskilda odlingsanalyserna av BEC har vi utvecklatRedogör för ett triple culture assay paradigm ( Figur 1B ) för att bestämma responsen av BEC, pericytes och astrocyter inom förformade nätverk till relevanta stressorer ( t.ex. oAβ). BEC-pläteras i närvaro av önskade behandlingar vid 0 h. Vid 4 h tillsätts pericytor försiktigt till plattan. Vid 7 h tillsätts astrocyter till plattan följt av tillsats av en stressor vid 11 h. Cellerna inkuberas sedan till 24 h tidpunkten.
ANMÄRKNING: För triple culture analyserna är det viktigt att överväga timing för att säkerställa att alla celler är sammanflöde samtidigt. Mänskliga astrocyter och pericytor bör odlas 1 vecka före analysen, medan hCMEC / D3-cellerna måste pläteras eller passeras 4-5 dagar före analysdatumet. Vidare är det viktigt att använda lågpassage (2-5) primära celler för att undvika fenotypisk drift.
- Tillsätt arbetslösning för gröncellspårningsfärg till hCMEC / D3-cellerna 20 minuter innan analysen startas. Platta hCMEC / D3-cellerna vid 10, 000 celler / brunn i EBM-2 basal (0 h tidpunkt). De använda volymerna är 45 μl cell suspension och 3,5 μL behandling ( dvs. slutliga EGF koncentrationer av 50 ng / mL, 100 ng / mL eller 1000 ng / mL från lager som är 20 gånger mer koncentrerade).
- Efter 3,5 timmars inkubation vid 37 ° C tillsättes arbetslösningen för blåcellspårningsfärg (10 μM celltrackerblått i EBM-2 basalt) till de mänskliga primära pericyterna. Vid 4 h tidpunkten (~ 30 min inkubation med cellspårningsfärg) tillsätt försiktigt 2000 pericyt / brunn till plattan innehållande hCMEC / D3 i en volym av 6 | il / brunn.
- Efter ytterligare 2,5 h inkubation (totalt 6,5 h från 0 h tidpunkt), tillsätt den orangefärgade cellspårningsfärg-arbetslösningen (10 μM celltracker orange i EBM-2 basal) till de mänskliga primära astrocyterna. Vid 7 h tidpunkten tillsätt försiktigt 10 000 astrocyter / brunn till plattan i 12 μl volym. Därför är det totala cellförhållandet för endotelceller: pericytes: astrocytes iS 5: 1: 5. Vidare är volymen uppnådd vid denna punkt 66,5 pl.
- Lägg till oAβ (3,5 μl 100 μM lager) 4 h senare (totalt 11 h från 0 h tidpunkt).
- Fixera cellerna 13 h senare i nyberedd 4% paraformaldehyd i PBS.
Varning: Använd skyddskläder, handskar och glasögon när du hanterar paraformaldehyd.
3. Kvantifiering
- Fånga fluorescensbilder av hela brunnen på 96-brunnsplattan vid 1,6x förstoring med en 2 s exponeringstid vid 50% maximal effekt med hjälp av ett dissekeringsmikroskop.
OBS: Likvärdiga mikroskop kan användas; Det är dock viktigt att fånga hela brunnen för omfattande analys. - För kvantitativ analys bearbetar du bilderna med hjälp av ImageJ angiogenes analysator plugin 22 för att kvantifiera antalet grenar, antal maskor och total celllängd (dessa läsningar tabuleras automatiskt av softwaRe) som beskrivs nedan. Ett detaljerat visuellt protokoll för detta steg framgår av figur 2 .
- Öppna fiji ImageJ genom att klicka på programvaruikonen.
- Klicka på de dubbla röda framåtpilarna som finns i slutet av verktygsfältet och klicka sedan på "Angiogenesis Analyzer".
- Välj mappen med bildfiler, klicka på "Öppna".
- När rutan "inställningar för analys" visas klickar du på "OK".
- När rutan "Bearbetning av bilder" visas, vilket anger antalet bilder som ska bearbetas, klickar du på "OK".
- När rutan "Batch progress window" visas, vilket indikerar den beräknade bearbetningstiden. Under denna tid kvantifierar programmet utdata inklusive antal grenar, antal maskor och total celllängd.
OBS! När alla bilder har kvantifierats visas resultatfilen i den ursprungliga bildmappen som ett kalkylarkdokument. - VäljKalkylarkfilen innehåller resultat och jämföra antalet grenar, maskor och total celllängd mellan grupper.
OBS! I trippelkulturanalysen används ImageJ för att analysera pericyte / astrocyt täckning och antal. Bilder trösklas av en blindad experimentator och funktionen "analysera partiklar" används för att generera utläsningar. Fasta celler och rörliknande strukturer kan också immunostaineras för Ap 17 eller andra markörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I enskilda kulturer bildar både hCMEC / D3-cellerna ( Figur 3A ) och primära mus-BEC ( Figur 3B ) meshworkliknande strukturer i hela brunnen. Strukturerna kännetecknas av ett nätverk av interlänkade noder ( figur 3 ). I alla de paradigm som beskrivits ( Figur 1 ) liknar de mesh-liknande strukturerna efter 24 timmar i kontrollgrupperna, vilket bildar ~ 20 meshworkliknande strukturer med en total celllängd av ~ 10.000 pixlar.
För att lyfta fram tillämpligheten av metoderna för sjukdomsrelevanta stressorer tillsattes oAp till hCMEC / D3 och primära mus-BEC i två paradigmer. Vid störningen av cellnätverksbildning (Paradigm 1) pläteras oAp och celler samtidigt. Vid störningen av förformat nätverksarbete (Paradigm 2) är oAβ tillagtEd 4 h efter plätering av cellerna (se figur 1A ). OAp vid 100 nM inducerar störning av meshworkliknande bildning och degenerering av förformat nätarbete ( Figur 3A , 3B ). Till exempel, genom att använda hCMEC / D3-cellerna i båda paradigmerna är kvantifiering av den totala celldäckningen / längden 16-20% lägre med 100 nM oAβ 17 . Vidare reduceras antalet maskor med 40% med 100 nM oAp i båda paradigmerna 17 . Sålunda inducerar en sjukdomsrelaterad stressor en liknande skadlig effekt på humant och möss BEC-täckning.
En viktig fördel med cellodlingssystemet är förmågan att identifiera faktorer eller behandlingar som förhindrar sjukdomsrelaterad skada, som sedan kan avancera till in vivo- testning. Som ett bevis på principexperiment påverkas effekterna av de viktigaste angiogena tillväxtfaktorerna för att förhindra oAp-inducerad chaNges till fartygs täckning bedömdes 17 . EGF förhindrade oAp-inducerad skada på hCMEC / D3-cellerna. Baserat på dessa data testades EGF i ett förebyggande paradigm med användning av en transgen musmodell som rekapitulerar kritiska aspekter av AD-liknande patologi. EGF-behandling förhindrade de kognitiva och BBB-underskotten, inklusive kärldegenerering 23 . Dessa data stöder in vitro- prediktiv potential för in vivo- aktivitet. För närvarande använder vi alla tre utvecklade paradigmer för screening: 1) nätverksbildning, 2) förebyggande av cellavbrott, 3) samtidig behandling av nätverksavbrott. Som framgår av figur 3 kan EGF skydda mot oAp-inducerad skada i immortaliserade och primära mus-BEC-kulturer.
BBB består av BEC, pericytes och astrocyter som tillsammans bidrar till övergripande cerebrovascUlar täckning. Därför är en anpassning av in vitro- systemet inkorporeringen av alla tre BBB-celltyper. Vårt trippelkulturanalysparamigm innehåller hCMEC / D3-cellerna, primära humana pericyter och primära humana astrocyter, vilka tillsättes i följd till basmembranmatrisen ( Figur 1B ). I triple culture assay-paradigmet bildar hCMEC / D3-cellerna ett liknande nätverksmönster som i de enskilda kulturerna, men med pericytema och astrocyterna fästa vid noderna och förbindande grenar ( Figur 4 ). Tillsatsen av 100 nM oAβ inducerar maskeringsavbrott (~ 10-15%) och en minskning av antalet pericytor som berör BEC 17 . I korrelation med data som härleds från de enskilda odlingsanalysparamigmerna förhindras oAp-inducerad skada genom EGF-behandling. Således är den tredimensionella kulturen BBB-modellen väl lämpad för studier inriktade på interaktiva effekter av astrocyter, pericYtor och BEC på fartygsdynamik.
Figur 1: Översikt över nätverksbildning och störningsanalyser. ( A ) Enkla kulturanalysparamigmer. Paradigm 1, meshwork formation. Celler, stressorer och behandlingar läggs alla till plattan vid 0 h tidpunkten. Paradigm 2, förebyggande av nätverksavbrott. Celler pläteras i närvaro av önskade behandlingar, inkuberas i 4 h, och en stressor tillsätts vid 4 h tidpunkten. Paradigm 3, samtidig behandling av nätverksavbrott. Celler pläteras och får bilda meshworkliknande strukturer i 4 timmar innan behandlingar och / eller stressorer tillsätts samtidigt vid 4 h tidpunkten. Alla paradigmer slutar vid 24 h tidpunkten och cellerna fixeras med 4% paraformaldehyd. ( B ) Trippelkulturanalys paradigm. BEC (10 000 celler / brunn) är pläterade i presEnce av önskade behandlingar vid 0 h. Vid 4 h-tidpunkten tillsätts pericyter (2000 celler / brunn) försiktigt till plattan. Vid 7 h tillsätts astrocyter (10 000 celler / brunn) till plattan följt av tillsats av relevanta stressorer vid 11 h. Cellerna inkuberas sedan fram till 24 h tidpunkten och fixeras med 4% paraformaldehyd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kvantitativ analys. Alla bilder öppnas på Fiji ImageJ och batch-bearbetas med hjälp av Angiogenesis Analyzer 22 . Kvantifiering av total längd och antal maskor används. Vänligen klicka här för att se en större version av tHans figur.
Figur 3: Meshwork-störningsanalyser: representativa bilder. Alla bilder härrör från experiment som utnyttjar Paradigm 2, nätverksavbrott. ( A ) Representativa bilder av hCMEC / D3-cellerna pläterade och behandlade med vehikelkontroll (VC), EGF (100 nM), oAp (100 nM) eller oAp (100 nM) + EGF (100 nM). Bilder vid 10X förstoring, Skala bar = 100 μm. ( B ) Representativa bilder av de primära mus-BEC-plattorna pläterade och behandlade med VC, EGF (100 nM), oAp (100 nM) eller oAp (100 nM) + EGF (100 nM). Bilder vid 10X förstoring, grön = BEC, Skala bar = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. Trippelkulturanalys: representativa bilder. ( A ) Representativa bilder av hCMEC / D3-cellerna, primära humana pericyter och primära humana astrocyter pläterade och behandlade med VC, EGF (100 nM), oAp (100 nM) eller oAp (100 nM) + EGF (100 nM) Enligt det paradigm som beskrivs i figur IB . Bilder vid 10X förstoring, grön = BEC, blå = pericytes och röd (pseudocolor) = astrocyter. Skalstång = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beskrivna metoderna kan användas för att adressera flera grundläggande biologiska frågor kring cerebrovaskulär täckning 24 . Specifikt kan de identifiera vilka receptorer och signalvägar som spelar en roll vid angiogenes, kärltäckning i cancervävnad och perifera endotelceller som är relevanta för hjärnan. Exempel innefattar angiogena tillväxtfaktorreceptorer, kväveoxid, mitogenaktiverad proteinkinassignalering och kalciumsignalering 25 , 26 , 27 . HCMEC / D3 och primära BEC kan ändras till genetiska knockdown-metoder för att underlätta denna ansträngning 18 . Mekanisk insikt kan erhållas från odling av BEC isolerade från möss med fullständig eller endotelcellspecifik nedbrytning av nyckelproteiner med de beskrivna metoderna. Vidare möjliggör de tredubbla odlingsanalyserna en djup analys av astrocyt och pericyte influencE på hjärnändotelcellfunktionen. Pericyter och astrocyter kan till exempel påverka meshworkliknande kärlbildning genom produktion av lösliga mediatorer ( t.ex. angiopoietin, cytokiner) och även via strukturellt stöd 24 .
Modelsystemet kan också tillämpas på sjukdomsforskning. Till exempel kan systemet adressera huruvida sjukdoms- och åldringsrelaterade stressorer tillsatt exogent främja angiogenes och / eller nätverksavbrott. Stressorer kan vara relevanta för en specifik störning, t.ex. oAβ eller mer generaliserad, t ex väteperoxid, cytokiner. Trippelkultur paradigmet lägger till ytterligare ett lager av komplexitet som kan förbättra förståelsen av kritiska, sjukdomsrelaterade mekanismer som påverkar BBB-dynamiken: avgränsa om sjukdomsrelevanta stressorer aktiverar astrocyter och pericytes för att störa BEC-funktionen. För både enkla och tredubbla odlingsanalyser kan de primära cellerna isoleras froM musmodeller som efterliknar störningar av intresse för att ytterligare avgränsa funktionella effekter.
Det finns ett antal viktiga överväganden för anpassning av nätverksliknande bildnings- och störningsanalyser till olika celltyper. Den första är sådddensiteten. För varje ny cellinje optimerar ett kritiskt första steg optimering av sådddensiteterna i basalmembranmatrisen för både enkla och trippelkulturanalyserna. Nätbildningen är celltalberoende, eftersom både för hög och för låg celldensitet resulterar i brist på nätverksbildning. Vidare, även för metoderna och cellerna som beskrivs häri, är det klokt att utföra celltäthetsjämförelser för att ta hänsyn till eventuella laboratorievariationer i cellbehandling före genomförande av större skala experiment. Det andra övervägandet är den tidsmässiga sekvensen av nätverksbildningen. Tidskursförsök bör genomföras för att identifiera när meshwork-liknande strukturer bildar och försämras. Typiskt är ett robust nätverks-lIke-bildning observeras vid ~ 4 h. Det tredje övervägandet är valet av medium före sådd och under experimentet. BEC, pericytes och astrocyter odlas i medium som innehåller FBS och en mängd tillväxtfaktorer optimerade för celltillväxt. Trots att det är föredraget att sjuka och tillväxtfaktorn svälter BEC: erna 24 h före försöket, kan detta för vissa celltyper inte vara genomförbart. Till exempel kan primära celler med specifika receptorknockdowns kräva ytterligare faktorer för att underlätta tillväxten. Dessa överväganden gäller även under experimentet, och valet av medium är beroende av den specifika frågan som undersöks. När man undersöker rollen av exogent tillsatta stressorer och potentiella behandlingar, särskilt tillväxtfaktorer eller besläktade föreningar, är emellertid användningen av serum och tillväxtfaktorfritt medium under experimentet idealiskt. Dessutom kan det vara möjligt att minska längden av serumhårning av BEC, men detta är beroende av sigNaling vägen under utredning. Ett fjärde överväganden är tidpunkten för att lägga till stressorer eller behandlingar. När det gäller valet av mediumbehandling är tidpunkterna baserade på den vetenskapliga frågan. Nätverksbildningsanalysen är mer analog med angiogenes, medan meshwork-störningsanalysen kan vara mer relevant för en mogen BBB. Enligt vår erfarenhet, när de upprättats, producerar analyserna konsekventa uppgifter mellan experiment. Konsistensfrågor beror ofta på skillnader i sådddensitet mellan personal, och viktigare, om komponenter i mediet eller relevanta reagenser förändras omedvetet.
Det finns begränsningar och områden för vidareutveckling av de beskrivna metoderna. En styrka av detta förfarande är att låga koncentrationer av stressor ( dvs. oAβ) kan användas för att inducera nätverksavbrott, dvs nM jämfört med μM, vilka är mer fysiologiskt relevanta. Denna styrka kan dock också vara en begränsning. Ja, högre, bUt fortfarande icke giftiga, kan koncentrationer av oAp vara nödvändiga för läkemedelssändningsändamål för att öka känsligheten, vilken kommer att gälla för andra sjukdomsrelevanta stressorer. En begränsning av metoden är att meshworken av celler endast är stabila under 24 timmar i beskrivna protokoll. Faktum är att efter 24 timmar börjar cellnätverket att degenerera. Därför lägger vi till oAβ efter en relativt kort tid (4 timmar) efter meshwork-bildningen för att möjliggöra en total oAp inkubationstid på 18 timmar. Kanske kan lägre sötningsdensiteter möjliggöra längre behandlingsprotokoll. En ytterligare potentiell begränsning är att in vitro- systemet kanske inte efterliknar ett stabilt nätverk av celler som skulle observeras i in vivo . Isolering av cellerna från åldrade möss kan närma sig in vivo- scenariot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Leon Tai finansieras av University of Illinois Chicago startfonder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
References
- Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).
- Engelhardt, B., Liebner, S. Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier. Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).
- Pardridge, W. Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier. Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer's-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis. PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).
- Boscolo, E., et al. Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo. Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).
- Paris, D., et al. Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).
- Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. Capillary beds are decreased in Alzheimer's disease, but not in Binswanger's disease. Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).
- Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain. Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).
- Donnini, S., et al. Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis. FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).
- Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation. J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).
- Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).
- Tai, L. M., et al. Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123. Brain Res. 1292, 14-24 (2009).
- Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells. Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).
- Dahlgren, K. N., et al. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
- Thomas, R., et al. Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Ambrose, C. T. Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer's disease and cognitive decline during aging. J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).
- Ambrose, C. T. A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis. J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).
- Ambrose, C. T. The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis. J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).
