Summary
Le maintien de la couverture de la barrière hémato-encéphalique est la clé de l'homéostasie du système nerveux central. Ce protocole décrit des techniques in vitro pour délimiter les processus fondamentaux et pathologiques qui modulent la couverture de la barrière hémato-encéphalique.
Abstract
La couverture de la barrière hémato-encéphalique (BBB) joue un rôle central dans l'homéostasie du système nerveux central (SNC). Le BBB est maintenu dynamiquement par les astrocytes, les pericytes et les cellules endothéliales du cerveau (BEC). Ici, nous détaillons les méthodes pour évaluer la couverture BBB en utilisant des cultures individuelles de BEC humains immortalisés, des cultures simples de BEC de souris primaires et un modèle de culture triple humanisé (BEC, astrocytes et pericytes) du BBB. Pour mettre en évidence l'applicabilité des tests aux états pathologiques, nous décrivons l'effet de l'amyloide-β (oAβ) oligomère, qui est un facteur important de la progression de la maladie d'Alzheimer (AD), sur la couverture BBB. De plus, nous utilisons le facteur de croissance épidermique (EGF) pour éclairer le potentiel de dépistage des techniques des médicaments. Nos résultats montrent que les BEC cultivés à une ou à trois fois forment des structures en forme de maille dans des conditions basales et que oAβ perturbe cette formation de maillage cellulaire et dégénère les structures de maille préformées,Mais EGF bloque cette perturbation. Ainsi, les techniques décrites sont importantes pour la dissection de processus fondamentaux et pathologiques qui modulent la couverture BBB.
Introduction
La barrière hémato-encéphalique (BBB) des capillaires cérébraux est la plus grande interface de contact entre le sang et le cerveau et joue un rôle central dans l'homéostasie du système nerveux central (SNC) 1 , 2 . Les processus dynamiques à la BBB empêchent l'absorption de molécules indésirables du sang, éliminent les déchets du SNC, fournissent des nutriments essentiels et des molécules de signalisation au SNC, et modulent la neuroinflammation 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Le dommage de BBB est répandu pendant le vieillissement et plusieurs troubles neurodégénératifs, y compris la maladie d'Alzheimer (AD), la sclérose en plaques et les accidents vasculaires cérébraux 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = "xref"> 6. Par conséquent, la dysfonctionnement BBB peut jouer un rôle clé dans les troubles neurodégénératifs, y compris en tant que cible thérapeutique.
Le maintien de la couverture des navires est important pour les fonctions homéostatiques du BBB. Cependant, les conflits de données in vivo et in vitro sur le fait que les processus impliqués dans les troubles neurodégénératifs causent une couverture BBB plus élevée ou inférieure à 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , en particulier en AD. Par conséquent, il existe une forte raison pour le développement de modèles in vitro utilisant des types cellulaires pertinents pour évaluer et comprendre de manière plus complète la dynamique de la couverture BBB. Les capillaires cérébraux sont composés d'astrocytes, de pericytes et de cellules endothéliales du cerveau (BEC) 3 . En général, les techniques de culture cellulaire pour évaluer la fonction BBB sont des essais de perméabilité effectués sur des cellules cultivées sur des inserts de filtre, ou l'évaluation des niveaux de protéines BEC clés, à la fois après l'addition de facteurs de stress 14 , 15 , 16 . Bien que important, ces tests ne se concentrent pas sur la couverture cérébrovasculaire.
Ici, nos méthodes précédentes 17 sont détaillées pour évaluer la couverture de BEC et les structures en forme de maillage en utilisant des cultures simples de BEC humains immortalisés, des cultures uniques de BEC de souris primaires et une triple culture humaniséeModèle (BEC, astrocytes et pericytes) du BBB. L'objectif était de démontrer l'effet néfaste de l'OAβ, qui est considéré comme un facteur important de la progression de l'AD, sur la couverture de la BEC. L'effet protecteur du facteur de croissance épidermique (EGF) souligne le potentiel de la technique en tant qu'outil de dépistage thérapeutique. La technique a plusieurs applications générales pour la recherche fondamentale et appliquée, notamment: 1) délimiter le rôle des voies spécifiques sur l'angiogenèse et la couverture des vaisseaux; 2) évaluer les effets de la maladie et les facteurs pertinents du vieillissement sur l'angiogenèse et la couverture vasculaire; 3) Cibles.
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Protocol
Toutes les expériences suivent les protocoles du Comité institutionnel d'élevage et d'utilisation de l'Université de l'Illinois, Chicago Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Préparation générale
REMARQUE: La lignée de cellules endothéliales microvasculaires du cerveau (hCMEC / D3) est une ligne 14 , 15 , 16 , 18 , 19 . Culturez les cellules hCMEC / D3 sur des flacons de culture de tissus revêtus de collagène type I (peau de veau, dilution 1:20 de solution à 0,1% dans la solution de sel équilibré de Hank (HBSS) contenant Ca 2+ et Mg 2+ ) dans le milieu basal de base de croissance endothéliale (EBM-2) contenant 2 à 5% de sérum bovin fœtal (FBS), 10% d'acide ascorbique, 10% de sulfate de gentamicine, 25% d'hydrocortisone et 1/4 du volume total des suppléments de facteur de croissance fournis pour 500 mL de milieu [ Endothélium vasculaire gr(Facteur VEGF), facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance 1 de l'insuline (IGF-1) et facteur de croissance fibroblastique basique humain (bFGF), voir Tableau des matériaux ].
NOTE: Le moyen EBM-2 avec FBS et les facteurs de croissance est appelé "EBM-2 complet". L'EBM-2 sans FBS et les suppléments sont appelés "EBM-2 basal". En pleine confluence, les cellules hCMEC / D3 sont ~ 1 x 10 5 cellules / cm 2 .
- Passer les cellules hCMEC / D3 à un rapport de 1: 5 en incubant d'abord avec HBSS pendant 3 min sans Ca 2+ et Mg 2+ suivi d'un détachement avec 5 mL de trypsine / EDTA (0,25%) pendant 5 min. Neutraliser la trypsine en utilisant l'EBM-2 complète (neutralisation 1: 1) et centrifuger à 290 xg pendant 5 min à 4 ° C; Jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille dans EBM-2 complète et re-plaque au ratio de 1: 5.
- Culturez les percytes et les astrocytes humains primaires selon le protocole du fournisseur [ Table of Materials ]. CulturE les pericytes en milieu basique pericyte avec FBS et complément de croissance par péricyte.
- Culturez les astrocytes humains dans un milieu d'astrocytes contenant des facteurs de croissance d'astrocytes. Culturez à la fois les pericytes et les astrocytes dans des flacons de culture tissulaire enduits de 3 ml de poly-L-lysine (PLL) pour l'adhérence cellulaire et utilisent les cellules entre les passages 2 et 5.
- Éuthaniser 7 souris et enlever les tiges du cerveau et les cérébelles avec des pinces; Détachez les meninges en enlevant soigneusement le cerveau sur la gaze. Pique le reste du tissu cérébral dans une boîte de Petri en milieu essentiel minimal (MEM) avec HEPES (5 mL par cerveau) avec une lame de rasoir stérile. Isoler les BEC de souris primaires de souris C57BL / 6J de 2 mois selon le protocole référencé 20 .
- Transférer le tissu cérébral haché à un tube conique de 15 mL. Centrifuger à 290 xg pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et incuber le tissu dans une papaïne (833,33 μL par cerveau) et DNase (41,7 μL par cerveau)Solution, dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 1 h, pour digérer le tissu.
- Triturer l'homogénat séquentiel par des aiguilles de 19 et 21, mélanger à un rapport de 1: 1 avec une solution d'albumine de sérum bovin (BSA) à 22% et centrifuger à 1360 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Remettre en suspension la pastille résultante dans 1 ml d'EBM-2 complète et centrifuger à 290 xg pendant 5 min à 4 ° C. Remettre à nouveau à nouveau dans 1 mL d'EBM-2 complète et plaquer les cellules (1 mL / puits) sur des plaques de 6 puits revêtues de collagène (~ 1 cerveau par puits).
- Remplacer les médias 24 heures plus tard avec EBM-2 complet contenant 4 μg / mL de chlorhydrate de puromycine; Remplacer par EBM-2 complet après 2 jours. Les BEC primaires sont cultivés comme pour les cellules hCMEC / D3 et sont à pleine confluence à 1 x 10 5 cellules / cm 2 .
- Préparer 100 uM d'OAß, 24 heures avant l'essai.
REMARQUE: oAβ est considéré comme la forme pertinente de la maladie de A. Pour oAβ, utilisez les préparations bien caractérisées décrites par DahlgreN et al. 21 . - Décongeler la solution mère de membrane de sous-sol pendant une nuit à 4 ° C et une aliquote dans des bandes de tubes PCR stériles (8 tubes) à 140 μL de membrane par tube. Refroidir chaque bande et stocker à -20 ° C. Décongeler une bande par plaque de 96 puits à 4 ° C, 24 heures avant l'essai. Pré-refroidir les pointes de la pipette pour éviter la solidification.
REMARQUE: Toute manipulation de la matrice de membrane basique doit être effectuée sur de la glace pour éviter une solidification rapide. Comme 10 μL par puits de membrane basale est utilisé le jour de l'essai, chaque bande est suffisante pour une plaque à 96 puits. - Incuber les BEC entièrement confluents dans le basal EBM-2, 24 heures avant l'essai.
NOTE: La raison d'être est: EBM-2 complete contient des facteurs additionnels et FBS dans le but de promouvoir une croissance cellulaire optimale; Cependant, les mêmes voies moléculaires qui favorisent la croissance cellulaire sont également importantes pour la couverture et la dynamique des cellules endothéliales du cerveau, tant en présence qu'en abseUn facteur de stress. Nous supposons donc que le sérum et le complément affaiblissent les BEC pour réduire l'effet de confusion de l'activation résiduelle des voies de signalisation cellulaire. Il est à noter que les cellules sont brièvement (5 min) exposées à FBS lors de la neutralisation de cellules trypsinées avant l'analyse. Contrairement aux BEC, les pericytes et les astrocytes ne souffrent pas de sérum en raison de l'exigence de différents facteurs de croissance et de l'instabilité relative de ces types de cellules en réponse à la famine sérique (laboratoire Tai, observations non publiées).
NOTE: L'EBM-2 basal est utilisé pendant le dosage pour les essais de formation et de rupture du maillage de culture simple et triple. Ceci est essentiel pour empêcher le stress ou la signalisation dépendant du traitement.
2. Ensembles de formation et de perturbation semblables à Meshwork
- Études simples de culture BEC:
NOTE: Trois paradigmes différents pour les cultures individuelles de BEC sont présentés à la Figure 1A - Le jour du dosage, pipettez la matrice de la membrane du sous-sol à 10 μL / puits dans le fond des plaques à 96 puits et laissez-les enfoncer pendant 1 h à 37 ° C.
- Suspendre le colorant de suivi des cellules vertes lyophilisé (voir Tableau des matériaux ) dans 10 μL de DMSO pour générer une solution stock 10 mM et diluer jusqu'à 10 μM (1: 1000) dans le bas de l'EBM-2. Retirez le support du ballon entièrement confluent et remplacez-le par une base bas EBM-2 contenant le colorant de suivi des cellules vertes (5 mL pour un flacon de 75 cm2). Précharger les BEC avec le colorant de suivi des cellules vertes, 20 min avant le début de l'analyse.
- Incuber les cellules pendant 20-30 min à 37 ° C, enlever le milieu avec un colorant de suivi des cellules et détacher les cellules comme décrit à l'étape 1.1. Neutraliser le milieu avec EBM-2 contenant 10% de FBS et centrifuger à 240 xg pendant 5 min à 4 ° C. Remettre en suspension la pastille dans 1 mL d'EBM-2 basal.
- Placer les BEC dans la plaque de 96 puits à 10 000 cellules / puits dans le bas de l'EBM-2 (point de temps de 0 h dans tous les paradigmes).
NOTE: Selon le paradigme utilisé, les traitements, les facteurs de stress ou les contrôles du véhicule sont ajoutés aux points de temps spécifiés. Dans tous les paradigmes, le milieu est récolté pour une analyse ultérieure ( par exemple, l' analyse ELISA) et les cellules sont fixées à 24 h avec du paraformaldéhyde 4% fraîchement préparé dans le Sérum tamponné au phosphate (PBS). En tant qu'approche alternative pour déterminer le terme d'effet de l'OAß sur la formation de maille, le protocole pourrait être modifié pour pré-incuber les flacons de culture cellulaire confluents avec oAβ, puis effectuer les paradigmes de formation du maillage (+/- oAβ).
NOTE: Le volume final dans chaque puits pour tous les paradigmes est de 70 μL. Tous les traitements (oAβ, EGF, etc. ) sont ajoutés à leurs puits respectifs à une dilution 1:20, c'est-à-dire 3,5 μL par traitement. Pour Paradigm 1, les cellules sont ajoutées dans une solution de suspension cellulaire à 63 μL / waune. Immédiatement, oAβ, les traitements désirés et les témoins sont ajoutés à 3,5 μL / puits chacun, ce qui donne un total de 70 μL. Pour Paradigm 2, 63 μL de suspension cellulaire et 3,5 μL de traitement ( par exemple, 100 ng / mL EGF) sont ajoutés au point de temps 0 h. Après 4 h d'incubation, on ajoute 3,5 μl d'un stock d'OAβ ( par exemple pour une concentration finale d'oAß de 100 nM, 3,5 μL de 2 μM de stock d'OAβ). Pour Paradigm 3, on ajoute 63 μL de suspension cellulaire au point de temps de 0 h et à 4 h, oAβ et les traitements désirés sont ajoutés à 3,5 μL / puits chacun, ce qui donne un total de 70 μL. Ces volumes peuvent être ajustés selon les traitements. Par exemple, si un seul traitement est nécessaire, le volume de la suspension cellulaire peut être ajusté à 66,5 μL (maintien de 10 000 cellules / puits) et le volume de traitement peut rester à 3,5 μL.
NOTE: En plus des analyses de culture unique des BEC, nous avons développéUn paradigme de dosage de culture triple ( figure 1B ) pour déterminer la réponse des BEC, des pericytes et des astrocytes dans les réseaux préformés aux facteurs de stress pertinents ( p. Ex . OAβ). Les BEC sont plaqués en présence de traitements désirés à 0 h. À 4 h, les pericytes sont ajoutés doucement à la plaque. À 7 h, les astrocytes sont ajoutés à la plaque, suivis de l'addition d'un facteur de stress à 11 h. Les cellules sont ensuite incubées jusqu'à 24 h.
REMARQUE: pour les essais à triple culture, il est important de tenir compte du moment pour s'assurer que toutes les cellules sont confluées en même temps. Les astrocytes et les pericytes humains doivent être cultivés 1 semaine avant l'analyse, alors que les cellules hCMEC / D3 doivent être plaquées ou passées 4-5 jours avant la date d'essai. En outre, il est important d'utiliser des cellules primaires à faible passage (2-5) pour éviter la dérive phénotypique.
- Ajouter la solution de travail de colorant de suivi des cellules vertes aux cellules hCMEC / D3 20 min avant le début de l'essai. Placer les cellules hCMEC / D3 à 10, 000 cellules / puits en EBM-2 basal (0 h time point). Les volumes utilisés sont 45 μL de suspension cellulaire et 3,5 μL de traitement ( c.-à-d. Concentrations EGF finales de 50 ng / mL, 100 ng / mL ou 1000 ng / mL de stocks 20 fois plus concentrés).
- Après l'incubation de 3,5 h à 37 ° C, ajoutez la solution de traitement de colorant de suivi des cellules bleues (10 μM de tracker cellulaire bleu en EBM-2 basal) aux pericytes primaires de l'homme. Au point de temps de 4 h (~ 30 minutes d'incubation avec un colorant de suivi des cellules), ajoutez doucement 2 000 pericytes / puits à la plaque contenant le hCMEC / D3 dans un volume de 6 μl / puits.
- Après une incubation supplémentaire de 2,5 h (total 6,5 h à partir du point de temps de 0 h), ajoutez la solution de traitement de colorant de suivi des cellules orange (10 uM de tracker orange en EBM-2 basal) aux astrocytes primaires humains. Au point de temps de 7 h, ajoutez doucement 10 000 astrocytes / puits à la plaque dans 12 μL de volume. Par conséquent, le rapport cellulaire global pour les cellules endothéliales: pericytes: astrocytes iS 5: 1: 5. En outre, le volume atteint à ce point est de 66,5 μL.
- Ajouter oAβ (3,5 μL de 100 μM stock) 4 h plus tard (total 11 h à partir de 0 h point de temps).
- Fixer les cellules 13 h plus tard dans du paraformaldéhyde 4% fraîchement préparé dans du PBS.
Attention: Portez des vêtements de protection, des gants et des lunettes tout en manipulant du paraformaldéhyde.
3. Quantification
- Capturez des images de fluorescence du puit entier de la plaque à 96 puits à un grossissement de 1,6 fois avec un temps d'exposition de 2 s à une puissance maximale de 50% à l'aide d'un microscope à dissection.
NOTE: Des microscopes équivalents peuvent être utilisés; Cependant, il est essentiel de capturer l'intégralité du puits pour une analyse complète. - Pour une analyse quantitative, traiter les images en utilisant le plugin 22 de l'analyseur d'angiogenèse ImageJ pour quantifier le nombre de branches, le nombre de mailles et la longueur totale de la cellule (ces lectures sont automatiquement tabulées par la softwaRe) comme décrit ci-dessous. Un protocole visuel détaillé de cette étape est fourni à la figure 2 .
- Ajoute fiji ImageJ en cliquant sur l'icône du logiciel.
- Cliquez sur les flèches fléchées double rouge situées à la fin de la barre d'outils, puis cliquez sur "Analyseur d'angiogenèse".
- Sélectionnez le dossier avec les fichiers image, cliquez sur "Ouvrir".
- Lorsque la zone "Paramètres d'analyse" apparaît, cliquez sur "OK".
- Lorsque la boîte "images de traitement" apparaît, ce qui indique le nombre d'images à traiter, cliquez sur "OK".
- Lorsque la fenêtre "Fenêtre de progression du lot" apparaît, ce qui indique le temps de traitement estimé. Pendant ce temps, le programme quantifie les sorties, y compris le nombre de branches, le nombre de mailles et la longueur totale de la cellule.
REMARQUE: Une fois que toutes les images sont quantifiées, le fichier de résultats apparaîtra dans le dossier d'image d'origine comme un document de feuille de calcul. - SélectionnerLe fichier de tableur contenant les résultats et compare le nombre de branches, les mailles et la longueur totale des cellules entre les groupes.
NOTE: Dans le test de culture triple, ImageJ est également utilisé pour analyser la couverture et le nombre de percytes / astrocytes. Les images sont limitées par un expérimentateur aveugle et la fonction "analyser les particules" utilisée pour générer des lectures. Les cellules fixées et les structures en forme de tube peuvent également être immunostained pour Aß 17 ou d'autres marqueurs.
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Representative Results
Dans les cultures uniques, les cellules hCMEC / D3 ( Figure 3A ) et les BEC de souris primaires ( Figure 3B ) forment des structures semblables à des mailles dans le puits. Les structures sont caractérisées par un maillage de noeuds interconnectés ( Figure 3 ). Dans tous les paradigmes décrits ( figure 1 ), les structures en forme de maillage sont similaires après 24 h dans les groupes témoins, formant des structures similaires à ~ 20 meshwork avec une longueur totale de 10 000 pixels.
Pour mettre en évidence l'applicabilité des méthodes aux facteurs de stress liés à la maladie, oAβ a été ajouté au hCMEC / D3 et aux BEC de souris primaires dans deux paradigmes. Dans la perturbation de la formation de maille cellulaire (Paradigm 1), oAβ et les cellules sont plaquées en même temps. Dans le dérangement du maillage préformé (Paradigm 2), oAβ est ajoutéEd 4 h après le placage des cellules (voir la figure 1A ). OAβ à 100 nM induit une perturbation de la formation en forme de maille et la dégénérescence du maillage préformé ( Figure 3A , 3B ). Par exemple, en utilisant les cellules hCMEC / D3 dans les deux paradigmes, la quantification de la couverture / longueur totale des cellules est inférieure de 16-20% à 100 nM oAβ 17 . En outre, le nombre de mailles est réduit de 40% avec 100 nM oAβ dans les deux paradigmes 17 . Ainsi, un facteur de stress lié à la maladie induit un effet néfaste similaire sur la couverture BEC humaine et de souris.
Un avantage majeur du système de culture cellulaire est la capacité d'identifier des facteurs ou des traitements qui empêchent les dégats liés à la maladie, qui peuvent alors passer à des tests in vivo . Comme preuve de l'expérience principale, les effets des principaux facteurs de croissance angiogéniques sur la prévention du chapeau induit par l'OAβLa couverture des navires a été évaluée 17 . L'EGF a empêché les dommages causés par l'OAβ aux cellules hCMEC / D3. Sur la base de ces données, EGF a été testé dans un paradigme de prévention utilisant un modèle de souris transgénique qui récapitule les aspects critiques de la pathologie AD-like. Le traitement de l'EGF a empêché les déficits cognitifs et BBB, y compris la dégénérescence des navires 23 . Ces données supportent le potentiel prédictif du système in vitro pour l'activité in vivo . À l'heure actuelle, nous utilisons les trois paradigmes développés pour le dépistage: 1) la formation de maille, 2) la prévention des perturbations du maillage cellulaire et 3) le traitement simultané de la perturbation du maillage. Comme le montre la figure 3 , EGF peut protéger contre les dommages causés par l'OAβ dans les cultures BEC immortelées et primaires.
Le BBB se compose de BEC, pericytes et astrocytes qui contribuent collectivement à la vasque cérébrale globaleCouverture annuelle. Par conséquent, une adaptation du système in vitro est l'incorporation des trois types de cellules BBB. Notre paradigme de dosage de culture triple comprend les cellules hCMEC / D3, les pericètes humaines primaires et les astrocytes humains primaires, qui sont ajoutés séquentiellement à la matrice de la membrane basale ( figure 1B ). Dans le paradigme du dosage de la culture triple, les cellules hCMEC / D3 forment un modèle de maillage similaire à celui des cultures uniques, mais avec les pericytes et les astrocytes attachés aux noeuds et aux branches de connexion ( Figure 4 ). L'ajout d'oAß 100 nM induit une perturbation du maillage (~ 10-15%) et une réduction du nombre de pericytes en contact avec les BEC 17 . En corrélation avec les données dérivées des paradigmes de dosage de culture unique, les effets induits par l'OAβ sont empêchés par un traitement EGF. Ainsi, le modèle BBB à triple culture est bien adapté aux études axées sur les effets interactifs des astrocytes, pericYtes et BEC sur la dynamique des navires.
Figure 1: Vue d'ensemble de la formation du maillage et des tests de perturbation. ( A ) Les paradigmes d'analyse de culture unique. Paradigme 1, formation de maille. Les cellules, les facteurs de stress et les traitements sont tous ajoutés à la plaque au point de temps 0 h. Paradigme 2, prévention des perturbations du maillage. Les cellules sont plaquées en présence de traitements désirés, incubées pendant 4 h, et un facteur de stress est ajouté au point de temps de 4 heures. Paradigme 3, traitement simultané de la perturbation du maillage. Les cellules sont plaquées et autorisées à former des structures en forme de maille pendant 4 h avant que les traitements et / ou les facteurs de stress ne soient ajoutés simultanément au point de temps de 4 heures. Tous les paradigmes se terminent au point de temps de 24 h, et les cellules sont fixées à 4% de paraformaldéhyde. ( B ) Le paradigme du test de culture triple. Les BEC (10 000 cellules / puits) sont plaqués en pressionDes traitements souhaités à 0 h. Au point de temps de 4 h, les pericytes (2 000 cellules / puits) sont ajoutés doucement à la plaque. À 7 h d'astrocytes (10 000 cellules / puits) sont ajoutés à la plaque, suivis de l'addition de facteurs de stress pertinents à 11 h. Les cellules sont ensuite incubées jusqu'au point de temps de 24 h et fixées avec du paraformaldéhyde à 4%. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: analyse quantitative. Toutes les images sont ouvertes sur Fiji ImageJ et traitées par lots à l'aide de l'Angiogenesis Analyzer 22 . La quantification de la longueur totale et du nombre de mailles est utilisée. Cliquez ici pour voir une version plus grande de tSa figure.
Figure 3: essais de perturbation du Meshwork: images représentatives. Toutes les images proviennent d'expériences utilisant Paradigm 2, perturbation du maillage. ( A ) Images représentatives des cellules hCMEC / D3 plaquées et traitées avec contrôle du véhicule (VC), EGF (100 nM), oAβ (100 nM) ou oAβ (100 nM) + EGF (100 nM). Images au grossissement 10X, Barre d'échelle = 100 μm. ( B ) Des images représentatives des BEC de souris primaires plaquées et traitées avec VC, EGF (100 nM), oAβ (100 nM) ou oAβ (100 nM) + EGF (100 nM). Images au grossissement 10X, vert = BEC, Barre d'échelle = 100 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. Essai de culture triple: images représentatives. ( A ) Des images représentatives des cellules hCMEC / D3, des pericètes humaines primaires et des astrocytes humains primaires plaqués et traités avec VC, EGF (100 nM), oAβ (100 nM) ou oAβ (100 nM) + EGF (100 nM) Selon le paradigme décrit dans la figure 1B . Images au grossissement 10X, vert = BEC, bleu = pericytes et rouge (pseudocolor) = astrocytes. Barre d'échelle = 100 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les méthodes décrites peuvent être utilisées pour répondre à plusieurs questions biologiques fondamentales entourant la couverture vasculaire 24 . Plus précisément, ils peuvent identifier quels récepteurs et voies de signalisation jouent un rôle dans l'angiogenèse, la couverture vasculaire dans le tissu cancéreux et les cellules endothéliales périphériques pertinentes pour le cerveau. Les exemples comprennent les récepteurs du facteur de croissance angiogénique, l'oxyde nitrique, la signalisation de la protéine kinase activée par les mitogènes et la signalisation du calcium 25 , 26 , 27 . L'hCMEC / D3 et les BEC primaires sont modifiables pour les approches de knockdown génétique pour faciliter cet effort 18 . Des connaissances mécaniques peuvent être obtenues grâce à la culture de BEC isolés à partir de souris avec un knockdown spécifique ou endothélial spécifique de cellules de protéines clés avec les méthodes décrites. De plus, les essais de culture triple permettent une analyse approfondie de l'influenza astrocytaire et péricyteE sur la fonction cellulaire endothéliale du cerveau. Par exemple, les pericytes et les astrocytes peuvent influencer la formation d'un vaisseau comme la formation de vaisseaux par la production de médiateurs solubles ( p. Ex. Angiopoïétine, cytokines) et également par un support structurel 24 .
Le système modèle peut également être appliqué à la recherche sur les maladies. Par exemple, le système peut déterminer si les facteurs de stress liés à la maladie et au vieillissement ajoutent de manière exogène à l'angiogenèse et / ou à la perturbation du maillage. Les facteurs de stress peuvent être pertinents pour un trouble spécifique, par exemple oAβ, ou plus généralisé, par exemple le peroxyde d'hydrogène, les cytokines. Le paradigme de la triple culture ajoute une couche supplémentaire de complexité qui peut améliorer la compréhension des mécanismes critiques et pertinents pour les maladies qui influent sur la dynamique de BBB: délimiter si les facteurs de stress liés à la maladie activent les astrocytes et les pericytes pour perturber la fonction BEC. Pour les essais de culture simple et triple, les cellules primaires peuvent être isolées deM modèles de souris qui imitent les troubles d'intérêt pour délimiter davantage les effets fonctionnels.
Il existe un certain nombre de considérations importantes pour adapter les tests de formation et de perturbation de type maillage à différents types de cellules. La première est la densité d'ensemencement. Pour chaque nouvelle ligne cellulaire, une première étape critique consiste à optimiser les densités d'ensemencement dans la matrice de la membrane basale pour les essais de culture simple et triple. La formation de maille dépend du nombre de cellules, car la densité de cellules trop élevée et trop faible entraîne un manque de formation de maille. De plus, même pour les méthodes et les cellules décrites ici, il est prudent de procéder à des comparaisons de densité cellulaire pour tenir compte de toute variation de laboratoire dans le traitement cellulaire avant de mener des expériences à plus grande échelle. La deuxième considération est la séquence temporelle de la formation du maillage. Des expériences de cours devraient être menées pour identifier quand des structures semblables à des mailles se forment et se dégradent. Généralement, un maillage robuste - lLa formation de ike est observée à ~ 4 h. La troisième considération est le choix du moyen avant l'ensemencement et pendant l'expérience. Les BEC, les pericytes et les astrocytes sont cultivés dans un milieu qui contient du FBS et une pléthore de facteurs de croissance optimisés pour la croissance cellulaire. Bien qu'il soit préféré au sérum et le facteur de croissance affamer les BEC 24 h avant l'expérience, pour certains types de cellules, cela peut ne pas être réalisable. Par exemple, les cellules primaires avec des knockdowns de récepteurs spécifiques peuvent nécessiter des facteurs supplémentaires pour faciliter la croissance. Ces considérations s'appliquent également pendant l'expérience, et le choix du moyen dépend de la question spécifique à l'étude. Cependant, lorsqu'on étudie le rôle des facteurs de stress et des traitements potentiels exogènes, en particulier des facteurs de croissance ou des composés apparentés, l'utilisation du sérum et du milieu sans facteur de croissance pendant l'expérience est idéale. En outre, il peut être possible de réduire la durée de la famine sérique des BEC, mais cela dépend de la sigVoie de recherche en cours d'enquête. Une quatrième considération est le moment de l'ajout de facteurs de stress ou de traitements. En ce qui concerne le choix du traitement moyen, les délais sont basés sur la question scientifique. Le dosage de la formation du maillage est plus analogue à l'angiogenèse, alors que le dosage de la rupture du maillage peut être plus pertinent pour un BBB mature. Dans notre expérience, une fois établis, les tests produisent des données cohérentes entre les expériences. Les problèmes de cohérence sont souvent attribuables aux différences de densité de semis entre le personnel et, surtout, si les composants des réactifs moyens ou pertinents sont inconsciemment modifiés.
Il existe des limites et des domaines de développement ultérieur des méthodes décrites. La force de cette procédure est que les faibles concentrations de facteur de stress ( c'est-à-dire oAβ) peuvent être utilisées pour induire une perturbation du maillage, c'est-à-dire nM par rapport à μM, qui sont plus pertinentes sur le plan physiologique. Cependant, cette force peut également être une limitation. En effet, plus haut, bToujours non toxique, des concentrations d'OAß peuvent être nécessaires pour le dépistage du médicament afin d'accroître la sensibilité, qui s'appliquera à d'autres facteurs de stress liés à la maladie. Une limitation de la méthode est que le maillage des cellules n'est stable que sur 24 h dans les protocoles décrits. En effet, après 24 heures, les cellules de la cellule commencent à dégénérer. Par conséquent, nous ajoutons oAβ après un temps relativement court (4 h) après la formation du maillage, pour permettre un temps d'incubation total d'OAß de 18 h. Peut-être que les densités de semis cellulaires inférieures peuvent permettre des protocoles de traitement plus longs. Une autre limitation de potentiel est que le système in vitro peut ne pas imiter un maillage stable des cellules comme cela serait observé in vivo . L'isolement des cellules des souris vieillies peut imiter de plus près le scénario in vivo .
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Leon Tai est financé par des fonds de démarrage de l'Université d'Illinois à Chicago.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
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