Summary
Die Erhaltung der Blut-Hirn-Schranke Abdeckung ist der Schlüssel für die Homöostase des zentralen Nervensystems. Dieses Protokoll beschreibt in vitro- Techniken, um die fundamentalen und pathologischen Prozesse abzugrenzen, die die Blut-Hirn-Schrankenabdeckung modulieren.
Abstract
Blut-Hirn-Schranke (BBB) Abdeckung spielt eine zentrale Rolle in der Homöostase des zentralen Nervensystems (ZNS). Die BBB wird dynamisch durch Astrozyten, Perizyten und Hirn-Endothelzellen (BECs) gehalten. Hier stellen wir Methoden zur Beurteilung der BBB-Berichterstattung über einzelne Kulturen von verewalisierten menschlichen BECs, einzelne Kulturen von primären Maus-BECs und ein humanisiertes Triple-Kulturmodell (BECs, Astrozyten und Perizyten) der BBB vor. Um die Anwendbarkeit der Assays auf Krankheitszustände hervorzuheben, beschreiben wir die Wirkung von oligomeren Amyloid-β (oAβ), was ein wichtiger Faktor für die Alzheimer-Krankheit (AD) -Progression bei der BBB-Abdeckung ist. Weiterhin nutzen wir den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), um das Arzneimittel-Screening-Potential der Techniken zu beleuchten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass einzelne und dreifach kultivierte BECs unter basalen Bedingungen meshwork-ähnliche Strukturen bilden und dass oAβ diese Zell-Mesh-Formation stört und die vorgeformten Mesh-Strukturen degeneriert,Aber EGF blockiert diese Störung. So sind die beschriebenen Techniken für die Sezierung von fundamentalen und krankheitsrelevanten Prozessen wichtig, die die BBB-Abdeckung modulieren.
Introduction
Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) von zerebralen Kapillaren ist die grösste Schnittstelle von Blut-zu-Gehirn-Kontakt und spielt eine zentrale Rolle in der Homöostase des Zentralnervensystems (ZNS) 1 , 2 . Die dynamischen Prozesse am BBB verhindern die Aufnahme von unerwünschten Molekülen aus dem Blut, entfernen Abfallprodukte aus dem ZNS, liefern dem NZS wesentliche Nährstoffe und Signalmoleküle und modulieren die Neuroinflammation 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . BBB-Schäden sind während des Alterns vorherrschend und einige neurodegenerative Erkrankungen einschließlich Alzheimer-Krankheit (AD), Multiple Sklerose und Schlaganfall 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = "xref"> 6 Daher kann die BBB-Dysfunktion eine Schlüsselrolle bei neurodegenerativen Erkrankungen spielen, auch als therapeutisches Ziel.
Die Erhaltung der Schiffsdeckung ist für die homöostatischen Funktionen der BBB wichtig. In vivo- und in vitro- Daten stehen jedoch Konflikte dar, ob die Prozesse, die bei neurodegenerativen Störungen auftreten, eine höhere oder niedrigere BBB-Abdeckung 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , insbesondere in AD, verursachen. Daher gibt es eine starke Begründung für die Entwicklung von In-vitro- Modellen mit relevanten Zelltypen zu bewerten und umfassender zu verstehen, die Dynamik der BBB-Abdeckung. Zerebrale Kapillaren bestehen aus Astrozyten, Perizyten und Hirn-Endothelzellen (BECs) 3 . Im Allgemeinen sind die Zellkulturtechniken zur Beurteilung der BBB-Funktion Permeabilitäts-Assays, die an Zellen durchgeführt werden, die auf Filtereinsätzen gezüchtet werden, oder die Bewertung von Niveaus von Schlüssel-BEC-Proteinen, sowohl nach der Zugabe von Stressoren 14 , 15 , 16 . Obwohl wichtig, diese Assays nicht auf die zerebrovaskuläre Abdeckung konzentrieren.
Hier sind unsere bisherigen Methoden 17 detailliert, um die BEC-Berichterstattung und die meshwork-artigen Strukturen unter Verwendung einzelner Kulturen von immortalisierten menschlichen BECs, einzelner Kulturen von primären Maus-BECs und einer humanisierten Tripelkultur zu bestimmenModell (BECs, Astrozyten und Perizyten) der BBB. Ziel war es, die nachteilige Wirkung von oAβ zu demonstrieren, die als wichtiger Beitrag zur AD-Progression auf der BEC-Berichterstattung gilt. Die schützende Wirkung des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) unterstreicht das Potenzial der Technik als therapeutisches Screening-Tool. Die Technik hat mehrere breite Anwendungen für die Grundlagenforschung und die angewandte Forschung, einschließlich: 1) Abgrenzung der Rolle spezifischer Wege auf Angiogenese und Gefäßabdeckung, 2) Bewertung der Auswirkungen von Krankheiten und Alterungsrelevanten Faktoren auf die Angiogenese und die Gefäßabdeckung und 3) die Identifizierung der pharmakologischen Zielen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Experimente folgen der University of Illinois, Chicago Institutional Animal Care und Use Committee Protokolle.
1. Allgemeine Vorbereitung
HINWEIS: Die mikrovaskuläre Endothelzelllinie des Gehirns (hCMEC / D3) ist eine weitgehend charakterisierte immortalisierte menschliche BEC-Linie 14 , 15 , 16 , 18 , 19 . Kultur die hCMEC / D3-Zellen auf Gewebekulturkolben, die mit Kollagen beschichtet sind Typ I (Kalbshaut, 1:20 Verdünnung von 0,1% iger Lösung in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) mit Ca 2+ und Mg 2+ ) im basalen Endothelwachstum Basal Medium (EBM-2), enthaltend 2-5% fötales Rinderserum (FBS), 10% Ascorbinsäure, 10% Gentamicinsulfat, 25% Hydrocortison und 1/4 des Gesamtvolumens der zugeführten Wachstumsfaktorergänzungen pro 500 ml Medium [ Vaskuläres Endothel gr(VFF), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) und menschlicher basischer fibroblastischer Wachstumsfaktor (bFGF), siehe Tabelle der Materialien ].
HINWEIS: EBM-2-Medium mit FBS und Wachstumsfaktoren wird als "EBM-2 komplett" bezeichnet. EBM-2 ohne FBS und Ergänzungen wird als "EBM-2 basal" bezeichnet. Bei voller Konfluenz sind die hCMEC / D3-Zellen ~ 1 x 10 5 Zellen / cm 2 .
- Durchführen der hCMEC / D3-Zellen im Verhältnis 1: 5 durch erstes Inkubieren mit HBSS für 3 min ohne Ca 2+ und Mg 2+, gefolgt von einer Ablösung mit 5 ml Trypsin / EDTA (0,25%) für 5 min. Neutralisieren des Trypsins mit EBM-2 vollständig (1: 1 Neutralisation) und zentrifugieren bei 290 xg für 5 min bei 4 ° C; Den Überstand verwerfen. Halten Sie das Pellet in EBM-2 vollständig und re-Platte im Verhältnis 1: 5.
- Kultur die primären menschlichen Perizyten und Astrozyten nach dem Protokoll des Lieferanten [ Table of Materials ]. KulturE die pericytes in pericyte basal medium mit FBS und pericyte wachstum ergänzung.
- Kultur die menschlichen Astrozyten in Astrozyten Medium mit Astrozyten Wachstumsfaktoren. Kultur sowohl die Perizyten als auch die Astrozyten in Gewebekulturkolben, die mit 3 ml Poly-L-lysin (PLL) für die Zelladhäsion beschichtet sind und die Zellen zwischen den Passagen 2 und 5 verwenden.
- Euthanize 7 Mäuse und entfernen Sie die Hirnstämme und Cerebella mit Pinzette; Lösen Sie die Hirnhaut durch sorgfältiges Rollen der Gehirne auf Gaze. Hacken Sie das verbleibende Hirngewebe in einer Petrischale in Minimal Essential Medium (MEM) mit HEPES (5 ml pro Gehirn) mit einer sterilen Rasierklinge. Isoliere die primären Maus-BECs von 2 Monate alten C57BL / 6J-Mäusen gemäß dem referenzierten Protokoll 20 .
- Übertragen Sie das Hackfleischgewebe auf ein 15 ml konisches Röhrchen. Zentrifugieren bei 290 xg für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und inkubieren Sie das Gewebe in einem Papain (833,33 μl pro Gehirn) und DNase (41,7 μl pro Gehirn)Lösung, in einem 37 ° C Wasserbad für 1 h, um das Gewebe zu verdauen.
- Triturieren Sie das Homogenat nacheinander durch 19 und 21 Gauge-Nadeln, mischen im Verhältnis 1: 1 mit einer 22% igen Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung und zentrifugieren bei 1360 xg für 10 min bei 4 ° C.
- Das erhaltene Pellet in 1 mL EBM-2 vollständig resuspendieren und bei 290 xg für 5 min bei 4 ° C zentrifugieren. Wiederholen Sie erneut in 1 mL EBM-2 vollständig und tafeln Sie die Zellen (1 ml / Vertiefung) auf 6-Well-Platten, die mit Kollagen (~ 1 Gehirn pro Vertiefung) beschichtet sind.
- Ersetzen Sie das Medium 24 h später mit EBM-2 komplett mit 4 μg / ml Puromycin-Hydrochlorid; Ersetzen Sie mit EBM-2 nach 2 Tagen. Die primären BECs werden wie für die hCMEC / D3-Zellen kultiviert und liegen bei 1 x 10 5 Zellen / cm 2 bei voller Konfluenz.
- Vorbereitung eines 100 & mgr; M oAβ, 24 h vor dem Assay.
HINWEIS: oAβ gilt als krankheitsrelevante Form von A. Für oAβ verwenden Sie die gut charakterisierten Präparate, die von Dahlgre beschrieben werdenN et al. 21 - Die Basalmembran-Stammlösung über Nacht bei 4 ° C auftauen und in sterile PCR-Röhrchenstreifen (8 Röhrchen) bei 140 μl Basalmembran pro Röhrchen aliquotieren. Jedes Streifen einfrieren und bei -20 ° C aufbewahren. Tauen Sie einen Streifen pro 96-Well-Platte bei 4 ° C, 24 h vor dem Assay. Vorbereitung der Pipettenspitzen, um Verfestigung zu vermeiden.
HINWEIS: Die gesamte Handhabung der Basalmembranmatrix muss auf Eis durchgeführt werden, um eine schnelle Erstarrung zu vermeiden. Da am Tag des Assays 10 & mgr; l pro Vertiefung der Basalmembran verwendet wird, reicht jeder Streifen für eine 96-Well-Platte aus. - Inkubieren Sie vollständig konfluierende BECs in EBM-2 basal, 24 h vor dem Assay.
HINWEIS: Die Begründung lautet: EBM-2 komplett enthält ergänzende Faktoren und FBS mit dem Ziel, ein optimales Zellwachstum zu fördern; Allerdings sind die gleichen molekularen Wege, die das Zellwachstum fördern, auch für die Hirn-Endothelzellen-Abdeckung und -Dynamik wichtig, sowohl in der Gegenwart als auch in der AbseNce eines Stressors. Wir also Serum und Ergänzung verhungern die BECs, um die verstörende Wirkung der Restaktivierung von zellulären Signalwegen zu reduzieren. Bemerkenswert ist, dass die Zellen kurz (5 min) FBS während der Neutralisation von trypsinisierten Zellen vor dem Assay ausgesetzt sind. Im Gegensatz zu den BECs sind die Perizyten und Astrozyten aufgrund des Erfordernisses verschiedener Wachstumsfaktoren und der relativen Instabilität dieser Zelltypen als Reaktion auf Serumverhungern (Tai-Laboratorium, unveröffentlichte Beobachtungen) nicht serumverhungert.
ANMERKUNG: EBM-2 basal wird während des Assays für die Einzel- und Triple-Kultur-Meshwork-Bildung und Disruption Assays verwendet. Dies ist entscheidend, um eine verstörende Stress- oder behandlungsabhängige Signalisierung zu verhindern.
2. Meshwork-ähnliche Formations- und Disruptions-Assays
- Einzelne BEC-Kultur-Assays:
ANMERKUNG: Drei verschiedene Paradigmen für die einzelnen Kulturen von BECs sind in Abbildung 1A dargestellt - Am Tag des Assays pipettieren Sie die Basalmembranmatrix mit 10 μl / well in den Boden der 96-Well-Platten und lassen Sie sie 1 h bei 37 ° C einstellen.
- Suspendieren Sie den lyophilisierten Grünzell-Tracking-Farbstoff (siehe Tabelle der Materialien ) in 10 & mgr; l DMSO, um eine 10-mM-Stammlösung zu erzeugen, und verdünnen Sie auf 10 & mgr; M (1: 1000) in EBM-2 basal. Entfernen Sie das Medium aus dem vollständig konfluierenden Kolben und ersetzen Sie es mit EBM-2 basal, das den Grünzelle-Tracking-Farbstoff enthält (5 ml für einen 75 cm 2- Kolben). Voreinstellung BECs mit dem grünen Zell-Tracking-Farbstoff, 20 Minuten vor dem Beginn des Assays.
- Inkubieren Sie die Zellen für 20-30 min bei 37 ° C, entfernen Sie das Medium mit Zellverfolgungsfarbstoff und trennen Sie die Zellen wie in Schritt 1.1 beschrieben. Neutralisieren des Mediums mit EBM-2 mit 10% FBS und Zentrifugieren bei 240 xg für 5 min bei 4 ° C. Das Pellet in 1 ml EBM-2 basal resuspendieren.
- Die BECs in der 96-Well-Platte auf 10.000 Zellen / Well in EBM-2 basal (0 h Zeitpunkt in allen Paradigmen) plattieren.
HINWEIS: Je nach verwendetem Paradigma werden Behandlungen, Stressoren oder Fahrzeugkontrollen zu den angegebenen Zeitpunkten hinzugefügt. In allen Paradigmen wird das Medium für die anschließende Analyse geerntet ( zB ELISA-Analyse) und die Zellen werden mit frisch hergestelltem 4% Paraformaldehyd in Phosphat-gepufftem Serum (PBS) um 24 h fixiert. Als alternativer Ansatz zur Bestimmung der Termeffekte von oAβ bei der Maschenbildung konnte das Protokoll modifiziert werden, um konfluierende Zellkulturkolben mit oAβ vorinkubieren zu können und dann die Maschenbildungsparadigmen (+/- oAβ) durchzuführen.
HINWEIS: Das endgültige Volumen in jeder Vertiefung für alle Paradigmen beträgt 70 μl. Alle Behandlungen (oAβ, EGF, etc. ) werden zu ihren jeweiligen Vertiefungen bei einer 1: 20-Verdünnung, dh 3,5 & mgr; l pro Behandlung, zugegeben. Für das Paradigma 1 werden die Zellen in einer Zellsuspensionslösung mit 63 & mgr; l / w zugegebenEll Unmittelbar oAβ werden gewünschte Behandlungen und Kontrollen bei jeweils 3,5 & mgr; l / Vertiefung zugegeben, was insgesamt 70 & mgr; l ergibt. Für das Paradigma 2 werden 63 μl Zellsuspension und 3,5 μl Behandlung ( zB 100 ng / mL EGF) zum 0 h-Zeitpunkt zugegeben. Nach 4 h Inkubation werden 3,5 & mgr; l eines oA & bgr; -Standes zugegeben ( z. B. für 100 nM endgültige oAβ-Konzentration, 3,5 & mgr; l 2 & mgr; M oAβ-Stamm). Für das Paradigma 3 werden 63 & mgr; l Zellsuspension zum 0 h-Zeitpunkt und bei 4 h zugegeben, wobei oAβ und die gewünschten Behandlungen mit jeweils 3,5 & mgr; l / Vertiefung zugegeben werden, was insgesamt 70 & mgr; l ergibt. Diese Bände können nach Behandlungen angepasst werden. Wenn beispielsweise nur eine Behandlung erforderlich ist, kann das Zellsuspensionsvolumen auf 66,5 & mgr; l eingestellt werden (wobei 10 000 Zellen / Vertiefung aufrechterhalten werden) und das Behandlungsvolumen bei 3,5 & mgr; l bleiben kann.
HINWEIS: Neben den einzelnen Kulturassays von BECs entwickeln wir uns( 1B ), um die Reaktion von BECs, Perizyten und Astrozyten in vorgeformten Netzwerken auf relevante Stressoren ( zB oAβ) zu bestimmen. BECs werden in Gegenwart von gewünschten Behandlungen bei 0 h plattiert. Nach 4 h werden Perizyten der Platte vorsichtig zugesetzt. Nach 7 h werden Astrozyten der Platte zugesetzt, gefolgt von der Zugabe eines Stressors bei 11 h. Die Zellen werden dann bis zum 24-Stunden-Zeitpunkt inkubiert.
ANMERKUNG: Für die Triple-Kultur-Assays ist es wichtig, das Timing zu berücksichtigen, um sicherzustellen, dass alle Zellen gleichzeitig zusammenlaufen. Menschliche Astrozyten und Perizyten sollten 1 Woche vor dem Assay kultiviert werden, während die hCMEC / D3-Zellen 4-5 Tage vor dem Testdatum plattiert oder passagiert werden müssen. Weiterhin ist es wichtig, primäre Zellen mit niedrigem Durchgang (2-5) zu verwenden, um eine phänotypische Drift zu vermeiden.
- Fügen Sie die grüne Zell-Tracking-Farbstoff-Arbeitslösung zu den hCMEC / D3-Zellen 20 min vor dem Beginn des Assays hinzu. Plate die hCMEC / D3 Zellen bei 10, 000 Zellen / Brunnen in EBM-2 basal (0 h Zeitpunkt). Bei den verwendeten Volumina handelt es sich um 45 μl Zellsuspension und 3,5 μl Behandlung ( dh endgültige EGF-Konzentrationen von 50 ng / mL, 100 ng / mL oder 1000 ng / mL aus 20-mal mehr konzentrierten Beständen).
- Nach der 3,5-stündigen Inkubation bei 37 ° C fügen Sie die blaue Zell-Tracking-Farbstoff-Arbeitslösung (10 μM Zellverfolger blau in EBM-2 basal) zu den primären Perizyten des Patienten hinzu. Beim 4-stündigen Zeitpunkt (~ 30 min Inkubation mit Zellverfolgungsfarbstoff) fügen Sie der Platte, die das hCMEC / D3 enthält, in einem Volumen von 6 μl / Vertiefung vorsichtig 2.000 Pericyt / Well zu.
- Nach einer weiteren 2,5-stündigen Inkubation (insgesamt 6,5 h ab 0 h-Zeitpunkt) fügen Sie die orangene Zellverfolgungs-Farbstoff-Arbeitslösung (10 μM Zell-Tracker-Orange in EBM-2 basal) zu den primären Astrozyten des Menschen hinzu. Bei der 7-stündigen Zeit, fügen Sie vorsichtig 10.000 Astrozyten / Well auf die Platte in 12 μL Volumen. Daher ist das gesamte Zellverhältnis für Endothelzellen: Perizyten: Astrozyten iS 5: 1: 5. Weiterhin beträgt das bis dahin erreichte Volumen 66,5 μl.
- Füge oAβ (3,5 μl 100 μM Lager) 4 h später hinzu (insgesamt 11 h ab 0 h Zeit).
- Fixieren Sie die Zellen 13 h später in frisch hergestelltem 4% Paraformaldehyd in PBS.
Achtung: Bei der Handhabung von Paraformaldehyd Schutzkleidung, Handschuhe und Brille tragen.
3. Quantifizierung
- Erfassen Sie Fluoreszenzbilder der Gesamtbrunnen der 96-Well-Platte bei 1,6facher Vergrößerung mit einer 2-s-Belichtungszeit bei 50% maximaler Leistung unter Verwendung eines Sektionsmikroskops.
HINWEIS: Äquivalente Mikroskope können genutzt werden; Allerdings ist es entscheidend, den gesamten Brunnen für eine umfassende Analyse zu erfassen. - Zur quantitativen Analyse verarbeiten die Bilder mit dem Plugin 22 für das PhotoJ-Angiogenese-Analysator 22 , um die Anzahl der Verzweigungen, die Anzahl der Maschen und die Gesamtzelllänge zu quantifizieren (diese Auslesungen werden automatisch von der Softwa tabelliertRe) wie unten beschrieben. Ein detailliertes visuelles Protokoll dieses Schrittes ist in Fig. 2 dargestellt .
- Öffnen Sie fiji ImageJ, indem Sie auf das Software-Symbol klicken.
- Klicken Sie auf die doppelten roten Vorwärtspfeile, die sich am Ende der Symbolleiste befinden, und klicken Sie dann auf "Angiogenese Analyzer".
- Wählen Sie den Ordner mit Bilddateien aus, klicken Sie auf "Öffnen".
- Wenn das Feld "Einstellungen für die Analyse" erscheint, klicken Sie auf "OK".
- Wenn das Feld "Verarbeitungsbilder" erscheint, das die Anzahl der zu verarbeitenden Bilder angibt, klicken Sie auf "OK".
- Wenn das Feld "Batch-Fortschrittsfenster" erscheint, das die geschätzte Bearbeitungszeit anzeigt. Während dieser Zeit quantifiziert das Programm die Ausgänge einschließlich der Anzahl der Zweige, der Anzahl der Maschen und der Gesamtzelllänge.
HINWEIS: Sobald alle Bilder quantifiziert sind, wird die Ergebnisdatei im Originalbildordner als Tabellenkalkulationsdokument angezeigt. - WählenDie Tabellenkalkulation enthält Ergebnisse und vergleicht die Anzahl der Zweige, Maschen und die Gesamtzelllänge zwischen den Gruppen.
ANMERKUNG: Im Triple-Kultur-Assay wird ImageJ weiter verwendet, um die Pericyt- / Astrozyten-Abdeckung und -zahl zu analysieren. Bilder werden durch einen verblindeten Experimentator und die "analysierte Partikel" -Funktion, die verwendet wird, um Auslesungen zu erzeugen, eingeschränkt. Feste Zellen und röhrenartige Strukturen können auch für Aβ 17 oder andere Marker immunostainiert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In einzelnen Kulturen bilden sowohl die hCMEC / D3-Zellen ( Fig. 3A ) als auch die primären Maus-BECs ( Fig. 3B ) in der Wanne Mesh-ähnliche Strukturen. Die Strukturen zeichnen sich durch ein Netz von miteinander verbundenen Knoten aus ( Abbildung 3 ). In allen beschriebenen Paradigmen ( Abbildung 1 ) sind die maschenartigen Strukturen nach 24 h in den Kontrollgruppen ähnlich und bilden ~ 20 meshworkartige Strukturen mit einer Gesamtzelllänge von ~ 10.000 Pixeln.
Um die Anwendbarkeit der Methoden auf krankheitsrelevante Stressoren hervorzuheben, wurde oAβ dem hCMEC / D3 und den primären Maus-BECs in zwei Paradigmen hinzugefügt. Bei der Störung der Zell-Mesh-Bildung (Paradigma 1) werden oAβ und Zellen gleichzeitig plattiert. Bei der Störung des vorgeformten Meshworks (Paradigm 2) ist oAβ add4 h nach dem Plattieren der Zellen (siehe Abbildung 1A ). OAβ bei 100 nM induziert eine Störung der maschenartigen Bildung und Degeneration von vorgeformtem Maschenwerk ( Fig. 3A , 3B ). Beispielsweise ist unter Verwendung der hCMEC / D3-Zellen in beiden Paradigmen die Quantifizierung der gesamten Zellabdeckung / -länge um 16-20% niedriger mit 100 nM oAβ 17 . Ferner wird die Anzahl der Maschen um 40% mit 100 nM oAβ in beiden Paradigmen 17 reduziert. So induziert ein krankheitsrelevanter Stressor eine ähnliche nachteilige Wirkung auf die menschliche und Mäuse-BEC-Abdeckung.
Ein wesentlicher Vorteil des Zellkultursystems ist die Fähigkeit, Faktoren oder Behandlungen zu identifizieren, die krankheitsrelevante Schäden verhindern, die dann in vivo- Tests vorankommen können. Als ein Nachweis des prinzipiellen Experiments wurden die Effekte der wichtigsten angiogenen Wachstumsfaktoren auf die Verhinderung von oAβ-induzierten chaNs zur Schiffsdeckung wurden beurteilt 17 . Der EGF verhinderte eine oAβ-induzierte Schädigung der hCMEC / D3-Zellen. Basierend auf diesen Daten wurde EGF in einem Präventions-Paradigma unter Verwendung eines transgenen Mausmodells getestet, das kritische Aspekte der AD-ähnlichen Pathologie zusammenfasst. EGF-Behandlung verhinderte die kognitiven und BBB-Defizite, einschließlich der Schiffsdegeneration 23 . Diese Daten unterstützen das prädiktive Potenzial des In-vitro- Systems für die in vivo- Aktivität. Derzeit nutzen wir alle drei entwickelten Paradigmen für das Screening: 1) Maschenbildung, 2) Vermeidung von Zellmeshwork-Störungen und 3) gleichzeitige Behandlung von Meshwork-Störungen. Wie in Abbildung 3 hervorgehoben , kann EGF gegen oAβ-induzierte Schäden in immortalisierten und primären Maus-BEC-Kulturen schützen.
Die BBB besteht aus BECs, Perizyten und Astrozyten, die kollektiv zur gesamten Zerebrovasc beitragenDeckung. Daher ist eine Anpassung des In-vitro- Systems der Einbau aller drei BBB-Zelltypen. Unser Triple-Kultur-Assay-Paradigma umfasst die hCMEC / D3-Zellen, primäre menschliche Perizyten und primäre menschliche Astrozyten, die nacheinander der Basalmembranmatrix zugesetzt werden ( Abbildung 1B ). Im Triple-Kultur-Assay-Paradigma bilden die hCMEC / D3-Zellen ein ähnliches Meshwork-Muster wie in den einzelnen Kulturen, aber mit den Perizyten und Astrozyten, die an die Knoten und Verbindungszweige gebunden sind ( Abbildung 4 ). Die Zugabe von 100 nM oAβ induziert eine Meshwork-Störung (~ 10-15%) und eine Verringerung der Anzahl von Perizyten, die mit den BECs in Verbindung stehen 17 . In Korrelation mit den aus den Einkultur-Assay-Paradigmen abgeleiteten Daten wird durch die EGF-Behandlung eine oAβ-induzierte Schädigung verhindert. So eignet sich das Triple-Kultur-BBB-Modell gut für Studien, die sich auf die interaktiven Effekte von Astrozyten konzentrierenYtes und BECs auf Schiffsdynamik.
Abbildung 1: Überblick über Meshwork-Bildung und Disruption Assays. ( A ) Einzelkultur-Assay-Paradigmen Paradigma 1, Meshwork-Bildung. Zellen, Stressoren und Behandlungen werden alle der Platte zum 0-h-Zeitpunkt hinzugefügt. Paradigma 2, Verhinderung von Meshwork-Störungen. Die Zellen werden in Gegenwart von gewünschten Behandlungen plattiert, für 4 h inkubiert und ein Stressor wird zum 4-stündigen Zeitpunkt zugegeben. Paradigma 3, gleichzeitige Behandlung von Meshwork-Störungen. Die Zellen werden plattiert und können meshwork-ähnliche Strukturen für 4 h bilden, bevor Behandlungen und / oder Stressoren gleichzeitig zum 4-stündigen Zeitpunkt hinzugefügt werden. Alle Paradigmen enden am 24-Stunden-Zeitpunkt und die Zellen werden mit 4% Paraformaldehyd fixiert. ( B ) Triple-Kultur-Assay-Paradigma BECs (10.000 Zellen / Vertiefung) werden im PresDer gewünschten Behandlungen bei 0 h. Bei der 4-stündigen Zeit werden Perizyten (2.000 Zellen / Vertiefung) vorsichtig der Platte zugesetzt. Bei 7 h werden Astrozyten (10.000 Zellen / Vertiefung) der Platte zugesetzt, gefolgt von der Zugabe von relevanten Stressoren bei 11 h. Die Zellen werden dann bis zum 24-Stunden-Zeitpunkt inkubiert und mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Quantitative Analyse. Alle Bilder werden auf Fiji ImageJ geöffnet und mit dem Angiogenesis Analyzer 22 verarbeitet . Die Quantifizierung der Gesamtlänge und der Anzahl der Maschen wird verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version von t anzuzeigenSeine Figur.
Abbildung 3: Meshwork-Disruption-Assays: repräsentative Bilder. Alle Bilder werden aus Experimenten mit Paradigm 2, Meshwork Disruption abgeleitet. ( A ) Repräsentative Bilder der hCMEC / D3-Zellen, die mit Vehikelkontrolle (VC), EGF (100 nM), oAβ (100 nM) oder oAβ (100 nM) + EGF (100 nM) plattiert und behandelt wurden. Bilder bei 10facher Vergrößerung, Maßstab = 100 μm. ( B ) Repräsentative Bilder der primären Maus-BECs, die mit VC, EGF (100 nM), oAβ (100 nM) oder oAβ (100 nM) + EGF (100 nM) plattiert und behandelt wurden. Bilder bei 10facher Vergrößerung, grün = BECs, Maßstab = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Triple-Kultur-Assay: repräsentative Bilder. (100 nM), oAβ (100 nM) oder oAβ (100 nM) + EGF (100 nM), die mit VC, EGF (100 nM), oAβ (100 nM) und oAβ (100 nM) + EGF (100 nM) Nach dem in Abbildung 1B beschriebenen Paradigma. Bilder bei 10facher Vergrößerung, grün = BECs, blau = pericytes und rot (pseudocolor) = astrozyten. Maßstab = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die beschriebenen Methoden können genutzt werden, um mehrere grundlegende biologische Fragen um die zerebrovaskuläre Abdeckung zu adressieren 24 . Insbesondere können sie identifizieren, welche Rezeptoren und Signalwege eine Rolle bei der Angiogenese, der Gefäßabdeckung im Krebsgewebe und den peripheren Endothelzellen spielen, die für das Gehirn relevant sind. Beispiele umfassen angiogene Wachstumsfaktor-Rezeptoren, Stickstoffmonoxid, Mitogen-aktivierte Proteinkinase-Signalisierung und Calcium-Signalisierung 25 , 26 , 27 . Die hCMEC / D3 und die primären BECs sind auf genetische Knockdown-Ansätze anwendbar, um diesen Aufwand zu erleichtern 18 . Mechanische Einsicht kann man aus der Kultivierung von aus Mäusen isolierten BECs mit vollständigem oder endothelialem zellspezifischem Knockdown von Schlüsselproteinen mit den beschriebenen Methoden gewinnen. Weiterhin ermöglichen die Triple-Kultur-Assays eine eingehende Analyse des Astrozyten- und Pericyt-EinflussesE auf der Gehirn-Endothelzellenfunktion. Zum Beispiel können Perizyten und Astrozyten die maschenartige Gefäßbildung durch die Herstellung von löslichen Mediatoren ( zB Angiopoetin, Zytokine) und auch über Strukturträger 24 beeinflussen .
Das Modellsystem kann auch auf die Krankheitsforschung angewendet werden. Beispielsweise kann das System ansprechen, ob krankheits- und alterungsrelevante Stressoren exogen die Angiogenese und / oder Meshwork-Störung fördern. Stressoren können für eine spezifische Störung relevant sein, zB oAβ oder verallgemeinert, zB Wasserstoffperoxid, Zytokine. Das Triple-Kultur-Paradigma fügt eine zusätzliche Komplexität hinzu, die das Verständnis kritischer, krankheitsrelevanter Mechanismen, die die BBB-Dynamik beeinflussen, verbessern kann: Abgrenzung, ob krankheitsrelevante Stressoren Astrozyten und Perizyten aktivieren, um die BEC-Funktion zu stören. Sowohl für Einzel- als auch für Dreifach-Kultur-Assays können die Primärzellen isoliert werdenM Mausmodelle, die Störungen des Interesses nachahmen, um die Funktionseffekte weiter abzugrenzen.
Es gibt eine Reihe wichtiger Überlegungen zur Anpassung der maschenartigen Formations- und Störungsassays an verschiedene Zelltypen. Die erste ist die Saatdichte. Für jede neue Zelllinie ist ein kritischer erster Schritt die Optimierung der Aussaatdichten in der Basalmembranmatrix sowohl für die Einzel- als auch für die Dreifach-Kulturassays. Die Maschenbildung ist zellzahlabhängig, da sowohl zu hohe als auch zu geringe Zelldichte zu einem Mangel an Maschenbildung führen. Ferner ist es selbst für die hierin beschriebenen Verfahren und Zellen zweckmäßig, Zelldichtevergleiche durchzuführen, um jegliche Laborvariationen in der Zellverarbeitung vor der Durchführung von Experimenten mit großem Maßstab zu berücksichtigen. Die zweite Betrachtung ist die zeitliche Abfolge der Maschenbildung. Zeitverlaufsexperimente sollten durchgeführt werden, um zu identifizieren, wann maschenartige Strukturen bilden und abbauen. Typischerweise ist ein robustes Meshwork-lIke-Bildung wird bei ~ 4 h beobachtet. Die dritte Überlegung ist die Wahl des Mediums vor dem Seeding und während des Experiments. BECs, Perizythen und Astrozyten werden in Medium, das FBS enthält, und eine Fülle von Wachstumsfaktoren, die für das Zellwachstum optimiert sind, kultiviert. Obwohl es bevorzugt ist, Serum und Wachstumsfaktor zu verhungern die BECs 24 h vor dem Experiment, für bestimmte Zelltypen kann dies nicht möglich sein. Zum Beispiel können Primärzellen mit spezifischen Rezeptor-Knockdowns zusätzliche Faktoren erfordern, um das Wachstum zu erleichtern. Diese Überlegungen gelten auch während des Experiments, und die Wahl des Mediums ist abhängig von der spezifischen Untersuchungsfrage. Bei der Untersuchung der Rolle von exogen hinzugefügten Stressoren und potentiellen Behandlungen, insbesondere Wachstumsfaktoren oder verwandten Verbindungen, ist die Verwendung von Serum- und Wachstumsfaktor-freiem Medium während des Experiments ideal. Darüber hinaus kann es möglich sein, die Länge des Serumverhungers der BECs zu reduzieren, aber dies ist abhängig von der SigNaling-Weg untersucht. Eine vierte Betrachtung ist der Zeitpunkt des Hinzufügens von Stressoren oder Behandlungen. Für die Wahl der mittleren Behandlung basiert die Zeitschrift auf der wissenschaftlichen Frage. Der Meshwork-Formationstest ist analog der Angiogenese, während der Meshwork-Disruption-Assay für eine reife BBB relevant sein kann. Nach unserer Erfahrung, sobald festgestellt, produzieren die Assays konsistente Daten zwischen Experimenten. Konsistenzprobleme sind oft auf Seeding Dichte Diskrepanzen zwischen Personal, und vor allem, wenn Komponenten des Mediums oder relevante Reagenzien sind unwissentlich verändert.
Es gibt Einschränkungen und Bereiche der Weiterentwicklung der beschriebenen Verfahren. Eine Stärke dieses Verfahrens ist, dass niedrige Konzentrationen von Stressor ( dh oAβ) verwendet werden können, um eine Meshwork-Störung zu induzieren, dh nM im Vergleich zu μM, die physiologisch relevanter sind. Diese Stärke kann aber auch eine Beschränkung sein. In der Tat, höher, bUt noch ungiftig, können Konzentrationen von oAβ für Arzneimittel-Screening-Zwecke erforderlich sein, um die Empfindlichkeit zu erhöhen, was für andere krankheitsrelevante Stressoren gelten wird. Eine Beschränkung des Verfahrens ist, dass das Maschenwerk der Zellen nur über 24 h in den beschriebenen Protokollen stabil ist. In der Tat, nach 24 h beginnen die Zell-Meshworks zu degenerieren. Daher addieren wir oAβ nach einer relativ kurzen Zeit (4 h) nach der Meshwork-Bildung, um eine Gesamt-Inkubationszeit von 18 h zu ermöglichen. Vielleicht können niedrigere Zellseedingdichten längere Behandlungsprotokolle ermöglichen. Eine weitere potentielle Einschränkung besteht darin, dass das in vitro System kein stabiles Maschenwerk von Zellen nachvollziehen kann, wie es in vivo beobachtet wird. Die Isolierung der Zellen von alten Mäusen kann das In-vivo- Szenario genauer nachahmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Leon Tai wird von der University of Illinois Chicago Start-up-Fonds finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
References
- Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).
- Engelhardt, B., Liebner, S. Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier. Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).
- Pardridge, W. Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier. Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer's-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis. PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).
- Boscolo, E., et al. Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo. Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).
- Paris, D., et al. Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).
- Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. Capillary beds are decreased in Alzheimer's disease, but not in Binswanger's disease. Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).
- Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain. Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).
- Donnini, S., et al. Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis. FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).
- Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation. J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).
- Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).
- Tai, L. M., et al. Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123. Brain Res. 1292, 14-24 (2009).
- Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells. Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).
- Dahlgren, K. N., et al. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
- Thomas, R., et al. Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Ambrose, C. T. Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer's disease and cognitive decline during aging. J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).
- Ambrose, C. T. A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis. J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).
- Ambrose, C. T. The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis. J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).
