Summary
Hier presenteren we een protocol voor het meten van de virulentie van de planktonische of oppervlak-ingeschrevenen bacteriën met behulp van D. discoideum (amoeba) als een host. Virulentie wordt gemeten over een periode van 1 h en host doden is gekwantificeerd aan de hand van de fluorescentie microscopie en beeld-analyse. We laten zien dat dit protocol met behulp van de bacterie P. aeruginosa.
Abstract
Traditionele bacteriële virulentie tests omvatten langdurige blootstelling van bacteriën in de loop van enkele uren naar gastheer cellen. Gedurende deze tijd, kunnen bacteriën ondergaan veranderingen in de Fysiologie als gevolg van de blootstelling aan groei hostomgeving en de aanwezigheid van de cellen van de gastheer. We ontwikkelden een test voor het snel meten van de staat van de virulentie van de bacteriën die de mate waarop bacteriën in aanwezigheid van cellen van de gastheer groeien te minimaliseren. Bacteriën en amoeben zijn vermengd en geïmmobiliseerd op een enkel imaging vliegtuig met behulp van een agar-pad. De procedure wordt eencellige fluorescentie imaging met calceïne-acetoxymethyl ester (calceïne-AM) als een indicator van host cell gezondheid. De fluorescentie van cellen van de gastheer wordt geanalyseerd na 1 h van de blootstelling van cellen van de gastheer aan bacteriën met behulp van microscopie van epifluorescence. De software van de analyse van de afbeelding wordt gebruikt voor het berekenen van een host doden index. Deze methode is gebruikt voor het meten van de virulentie binnen planktonische en oppervlakte-ingeschrevenen Pseudomonas aeruginosa subpopulatie tijdens het beginstadium van biofilm vorming en kunnen worden aangepast aan andere bacteriën en andere stadia van biofilm groei. Dit protocol biedt een snelle en robuuste methode voor het meten van de virulentie en veel van de complexiteit die is gekoppeld aan de groei en het onderhoud van zoogdieren cellijnen vermijdt. Virulentie fenotypen hier gemeten met behulp van amoeben zijn ook gevalideerd met behulp van de muis macrofagen. Deze test werd met name gebruikt om die oppervlakte bijlage upregulates virulentie in P. aeruginosa.
Introduction
Bacteriële infectie is een van de hoofdoorzaken van mortaliteit in mens en dier1,2. De mogelijkheid voor het meten van de virulentie van bacteriën in culturen of biofilms is belangrijk in instellingen voor gezondheidszorg en onderzoek. Hier beschrijven we een veelzijdige, snelle en relatief eenvoudige methode om te kwantificeren van bacteriële virulentie. De eukaryotische organisme Dictyostelium discoideum (amoeba) wordt gebruikt als de modelorganisme voor de host. D. discoideum is gebruikt als een host virulentiefactoren in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)3,4,5 en andere bacteriën6,7 te identificeren ,8 en is gevoelig voor grotendeels dezelfde Virulentiefactoren die de cellen van de zoogdieren doden, met inbegrip van type III secretie9,10. Vorige virulentie testen met behulp van D. discoideum betrokken zijn langdurige blootstelling van bacteriën met D. discoideum cellen in de loop van uren3,4,5. Het protocol, hier, presenteert een snelle methode voor het bepalen van de virulentie met behulp van deze amoeba. Dit protocol (Figuur 1) beschrijft hoe: (1) groeien de amoeben axenically (in de afwezigheid van bacteriën), (2) groeien bacteriën voor de assay, (3) bereiden bacteriën en cellen van de gastheer voor microscopie, (4) het uitvoeren van epifluorescence microscopie, en (5) analyseren amoeba fluorescentie.
Amoeben zijn aanvankelijk streaked uit uit bevroren voorraden en gegroeid op een gazon van Escherichia coli (E. coli), waar de amoeben produceren sporen. Deze sporen zijn geplukt en geënt in een verrijkte medium voor een groei. De amoeben worden onderhouden via een groei in voedselrijke omstandigheden totdat ze klaar om te worden gemengd met bacteriën voor de beoordeling van bacteriële virulentie. De overleving of de dood van de amoeben wordt gekwantificeerd door het meten van de fluorescentie van calceïne-acetoxymethyl (calceïne-AM), die door intracellulaire esterasen gekloofd en, daardoor, geactiveerd voor fluorescentie11,12. Live amoeben vertonen weinig of geen fluorescentie overwegende dat benadrukt en stervende cellen fluoresceren intens. Dit resultaat is te wijten aan een weinig of geen opneming van calceïne-AM in gezonde amoeben en integratie en splijten van het substraat in gespannen amoeben13. Dit gedrag verschilt met name van calceïne-AM fluorescentie in zoogdiercellen11,14,15,16.
Bacteriën die zullen worden beoordeeld op virulentie worden afzonderlijk gekweekt. Hier beschrijven we hoe te meten van de virulentie van de opportunistische pathogenen P. aeruginosa en hoe te kwantificeren van de virulentie van de planktonische (zwemmen) en oppervlakte-ingeschrevenen subpopulatie in detail te beschrijven. Dit protocol kan worden aangepast aan het testen van de virulentie van andere bacteriën. In de sectie vertegenwoordiger resultaten tonen we dat virulentie is geactiveerd in oppervlak vastgehechte cellen en laag in planktonische cellen is, die werd gemeld eerder13. Virulentie-geactiveerde oppervlak-ingeschrevenen P. aeruginosa doodt amoeben, terwijl niet-virulente planktonische cellen worden verbruikt door de amoeben. Als de virulentie van de planktonische bacteriën is uitsluitend wordt bepaald, kunnen de bacteriën gekweekt in gewone cultuur buizen in plaats van met behulp van petrischalen, zoals beschreven in het protocol.
De groei van amoeben en P. aeruginosa culturen moet worden gecoördineerd zodat P. aeruginosa culturen de beoogde groeifase bereiken, terwijl de amoeben in stabiele toestand in voedselrijke omstandigheden groeit. Deze voorwaarde vereist normaliter amoeben culturen moeten worden verdund ten minste 1 dag voorafgaand aan wanneer ze worden gemengd met bacteriën. Amoeben en bacteriën zijn geïmmobiliseerd met agar pads zijn mede bebroede gedurende 1 uur, en beeld met behulp van een lage resolutie (10 X, numerieke diafragma 0.3) objectieve, groene fluorescentie proteïne (GFP) filters en een imaging camera. Analyse kan worden uitgevoerd met behulp van vrij toegankelijke ImageJ software of software van de analyse van de afbeelding aangepast. Onze analyse werd uitgevoerd met behulp van onze eigen software geschreven met behulp van een wetenschappelijke analyse pakket13. De software moet een masker met behulp van de fase contrast-afbeelding maken en fluorescentie waarden extraheren op basis van de gemaskerde gebieden in de afbeelding van de fluorescentie. Fluorescentie waarden zijn gemiddeld ten minste 100 cellen, wat resulteert in een numerieke host doden index.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd aan de Universiteit van Californië, Irvine.
1. buffers en oplossingen
- Voorbereiden lysogenie Bouillon (LB) in een fles 1 L door toevoeging van 25 g voor LB-Miller mix in 1 L tweemaal gedestilleerd water (ddH2van O). Voeg een extra 20 g agar voor petrischalen. Autoclaaf te steriliseren. Giet 25 mL gesmolten agar-voedingsbodem in 10 cm-diameter petrischalen en laat stollen bij kamertemperatuur. Opslag vloeibare media bij kamertemperatuur en agar platen bij 4 ° C.
- Bereid Glucose Gist-pepton (GYP) platen in een 1 L-fles door het mengen van D-glucose 1 g, 2 g pepton, 0,25 g gist extract, 4.2 gram KH2PO4, 5.1 g nb2HPO47 H2O en 25 gram agar in 1 L ddH2 O. autoclaaf te steriliseren. Giet 25 mL gesmolten agar in 10 cm-diameter petrischalen en laat stollen bij kamertemperatuur. Bewaren bij 4 ° C.
- Bereid pepton S (PS) medium in een 1 L-fles door het mengen van pepton 10 g, 7 g gist extract, 15 g van D-glucose, 0,12 g nb2HPO47 H2O 1.4 g van KH2PO4, 40 µg vitamine B12 , en 80 µg foliumzuur in 800 mL ddH2O. ijken een elektronische pH-meter met behulp van pH 4 en pH 7 normen, indien de pH-meter niet binnen een dag gebruikt is.
- Wordt de pH van het medium van de PS met behulp van de pH-meter. 5 M KOH of 5 M H3PO4 om Breng de pH op 6.5 toevoegen. Het uiteindelijke volume aan 1 L met behulp van ddH2O. Filter steriliseren met behulp van 0,22 µm vacuüm filter en bewaren bij 4 ° C.
Opmerking: Voorzichtig zijn met de pH-aanpassingen door het dragen van beschermende uitrusting, zoals handschoenen, beschermende kleding, oogbescherming en bescherming worden geconfronteerd.
- Wordt de pH van het medium van de PS met behulp van de pH-meter. 5 M KOH of 5 M H3PO4 om Breng de pH op 6.5 toevoegen. Het uiteindelijke volume aan 1 L met behulp van ddH2O. Filter steriliseren met behulp van 0,22 µm vacuüm filter en bewaren bij 4 ° C.
- Bereiden van 10 x ontwikkeling Buffer Prime (DB') buffer in een fles 1 L door toevoeging van 3,4 g van KH2PO4, 13.4 g nb2HPO4 7 H2O en ddH2O aan een totaal volume van 800 mL. Ijken van een elektronische pH-meter met behulp van pH 4 en pH 7 normen, indien de pH-meter niet binnen een dag gebruikt is.
- Wordt de pH van de buffer met behulp van de elektronische pH-meter. Breng de pH op 6.5 door voorzichtig toe te voegen 5 M KOH of 5 M H3PO4 zo nodig. Het uiteindelijke volume aan 1 L met behulp van ddH2O en steriliseren in autoclaaf. Bewaren bij kamertemperatuur.
Opmerking: Voorzichtig zijn met de pH-aanpassingen door het dragen van beschermende uitrusting, zoals handschoenen, beschermende kleding, oogbescherming en bescherming worden geconfronteerd.
- Wordt de pH van de buffer met behulp van de elektronische pH-meter. Breng de pH op 6.5 door voorzichtig toe te voegen 5 M KOH of 5 M H3PO4 zo nodig. Het uiteindelijke volume aan 1 L met behulp van ddH2O en steriliseren in autoclaaf. Bewaren bij kamertemperatuur.
- 1 x ontwikkeling buffer (DB) maken door het mengen van 100 mL 10 x DB' buffer met 1 mL 2 M MgCl2gesteriliseerd en 1 mL 1 M CaCl2gesteriliseerd. Het definitieve volume aan 1 L in een 1 L-fles met een gesteriliseerde met autoclaaf gesteriliseerde ddH2O. winkel bij kamertemperatuur.
- Bereid PS:DB medium in een 1 L-fles door het mengen van 100 mL van gesteriliseerde PS medium, 100 mL gesteriliseerd 10 x DB' buffer en gesteriliseerde ddH2O tot een totaal volume van 1 L. Supplement met 1 mL 2 M MgCl2 gesteriliseerd en 1 mL gesteriliseerd 1 M CaCl 2. bewaren bij 4 ° C.
- Bereid de stockoplossing van calceïne-AM door 50 µL van DMSO toevoegen aan 50 µg voor calceïne-AM in de plastic container geleverd door de fabrikant. Winkel bij-20 ° C.
2. groei en het onderhoud van amoeben
- E. coli stam B/r17 groeien als voedselbron voor amoeben tijdens de initiële groeiperiode. Streak E. coli B/r uit een bevroren voorraad opgeslagen bij-80 ° C op een bord van de agar LB en Incubeer bij 37 ° C's nachts te verkrijgen van enkele kolonies.
- Inoculeer een één kolonie van E. coli B/r in 2 mL van LB medium en na een nacht bebroeden in de trommel van een roller of een shaker bij 37 ° C.
- Breng de overnachting E. coli cultuur op de kamertemperatuur. Met behulp van een houten stok, beënten amoeben uit een bevroren voorraad gehouden bij-80 ° C in 750 µL van de overnachting cultuur.
Opmerking: Gebruik D. discoideum stam AX3, die kan van een groei18. Deze stap is niet vereist voor een groei, maar opeenvolgende stappen zijn eis zullen hebben. - Voeg onmiddellijk 700 µL van het amoeben -E. coli mengsel op een bord van Glucose Gist-pepton (GYP). Verspreid de cultuur gelijkmatig op het oppervlak van de plaat door het kantelen van het heen-en-weer en side-to-side zo nodig. Vermijd het gebruik van een strooier.
- Plaats de GYP plaat met agar naar boven in een doos die hoge luchtvochtigheid onderhoudt. Gebruik twee wegwerp plastic containers (183 cm x 183 cm x 91 cm) boven op elkaar gestapeld. Vul de onderkant container met ongeveer 25 mL water en plaats de bovenste container met verschillende 0.5 cm-diameter gaatjes geboord door de vloer van de container om vocht om de bovenste container van het waterreservoir naar.
- Incubeer de GYP plaat en vak bij 22 ° C gedurende 4-5 dagen totdat amoeba sporen worden waargenomen groeien in de buurt van het oppervlak van de plaat (Figuur 2). Gebruik een gekoelde incubator om platen in plaats van incubatie bij kamertemperatuur incuberen.
Opmerking: Nadat de sporen zijn gegroeid, zij levensvatbaar blijven op platen wekenlang wanneer opgeslagen bij 4 ° C. Bewaar de platen met agar zijde naar boven. Na 3-4 dagen incubatie, zones van clearing binnen het bacteriële gazon waarneembaar, waaruit blijkt dat het intreden van amoeba sporevorming.- Acht kleine amoeben sporen boven het oppervlak van de plaat na 4-5 dagen incubatie (Figuur 2).
Opmerking: Niet groeien de amoeben langer dan een week, zoals de kwaliteit van de sporen buiten deze periode afneemt.
- Acht kleine amoeben sporen boven het oppervlak van de plaat na 4-5 dagen incubatie (Figuur 2).
- Verzamelen amoeben sporen te bereiden voor de een groei van de amoeben door vegen een steriele 1 mL pipet tip parallel aan het oppervlak van de plaat. Sporen van de helft van een 10 cm petrischaal verzamelen.
Opmerking: Raak de tip om het oppervlak van de agarplaat als deze ontwerpresolutie zal het verzamelen van grote aantallen van E. coli. - Resuspendeer de amoeben op het puntje van de Pipet van de tip onder te dompelen in 1 mL van PS medium en pipetteren zachtjes op en neer.
- Breng het geënte mengsel in een kolf van 250 mL met 25 mL van het medium van de PS aangevuld met het antibioticum-antimycotic oplossing met 0,25 x concentratie.
Opmerking: Bewaar de antibioticum-antimycotic oplossing als 250 µL aliquots bij-20 ° C. Vermijd herhaalde cycli van ontdooien en bevriezen van deze oplossing, aangezien dit kan invloed hebben op de werkzaamheid. - Groeien amoeben axenically bij 22 ° C in een roterende shaker op 100 rpm. Voor de virulentie assay in stap 5, cellen te groeien tot een extinctie gemeten op 600 nm (OD600) van 0,2 tot 0,5.
Opmerking: Deze stap vereist 3-4 dagen van de groei vanaf het moment van de inenting (stap 2.7). Als cellen zijn uitgegroeid tot een hogere dichtheid, Verdun de cultuur terug in PS middellange tot een OD600 van 0,05 of lager en groeien terug naar een OD600 van 0,2 tot 0,5.
3. de groei van P. aeruginosa
- Kies een één kolonie van P. aeruginosa van een LB-plaat, het enten in een 2 mL PS:DB cultuur, en 's nachts groeien bij 37 ° C tot verzadiging.
Opmerking: Niet het antibioticum-antimycotic oplossing toevoegt aan de PS:DB media. - Verdun de overnachting cultuur 1:100 of 1:1,000 in een 6 cm-diameter petrischaal met behulp van PS:DB. Als de virulentie van de planktonische cellen is uitsluitend wordt bepaald, groeien de culturen die met behulp van conventionele cultuur buizen plaats. Schud de cultuur op een benchtop rotator vastgesteld op 100 rpm bij 37 ° C.
- De culturen van de oogst op specifieke tijdstippen om de reproduceerbaarheid. Bereiden op 30 min tot 1 h voorafgaand aan de beoordeling van de virulentie, een agar-pad, zoals beschreven in sectie 4.
Opmerking: Virulentie in P. aeruginosa wordt geïnduceerd door ongeveer 8 h van groei op oppervlakken. - U kunt de oppervlak-vastgehechte cellen isoleren, verwijder de vloeistof uit de petrischaal onmiddellijk wassen met 1 mL van de buffer van de DB aan planktonische cellen verwijderen en ga onmiddellijk naar stap 5.1.
Let op: Was niet langer dan 30 s als dit zal erover en oppervlak vastgehechte cellen los en kan van invloed zijn op de meting van de virulentie. - Om te isoleren planktonische cellen, 10 µL van de cultuur van de petrischaal overbrengen in een schone petrischaal en ga onmiddellijk naar stap 5.1.
4. microscopie - voorbereiding van de Agar-Pad
- Agar pads ongeveer 30 minuten tot 1 uur voor te bereiden voordat amoeben zijn klaar om te worden gemengd met P. aeruginosa.
- Magnetron 50 mL 1% (m/v) agar in DB buffer in een maatkolf van 250 mL. Mix elke 20 s tot bosjes agar verdwijnen.
- Koel de gesmolten agar door deze te plaatsen in het waterbad voorverwarmde 55 ° C gedurende 15 minuten.
- Voeg toe 15 µL van de stockoplossing van calceïne-AM aan 15 mL gesmolten agar in een conische buis. Meng door zachtjes het omkeren van de buis 4 - 5 keer en ga onmiddellijk naar de volgende stap.
Opmerking: Deze stap uitvoeren in een centrifugebuis polypropyleen 15 mL. Gebruik een dik glas container niet omdat dit leiden de agar tot zal te stollen te snel. - Giet de gesmolten agar mengsel bovenop een glasplaat 12 x 10 cm en laat de agar te stollen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Snijdt de gestolde agar pad in kleinere 1.5 x 1.5 cm delen door het plaatsen van de glasplaat over een afgedrukte raster en snijden langs het raster met behulp van een metalen liniaal.
- Houd de gel gehydrateerd in een vochtige vak totdat het is klaar voor gebruik.
5. microscopie - bereiding van het monster van de bacteriën-amoeba voor Imaging
- Om te assay de virulentie van oppervlak vastgehechte bacteriële cellen, 10 µL van amoeba cellen uit toevoegen stap 2.10 aan oppervlak-ingeschrevenen bacteriën uit stap 3.4.
Opmerking: Deze stap wordt het mengen van amoeben met bacteriën. - Om te assay de virulentie van de planktonische cellen, meng 10 µL van amoeba cellen uit stap 2.10 met 10 µL van planktonische bacteriën uit stap 3.5.
Opmerking: Voor het mengen met de bacteriën niet de amoeba axenically gekweekte cellen (bij een OD600 van 0,2 tot 0,5) wassen. Geen groei van E. coli zal worden waargenomen in de amoeba cultuur als gevolg van het gebruik van de antibiotica-antimycotic oplossing. - Plaats de 1.5 x 1.5 cm calceïne-AM agar pad uit stap 4,5 op de top van de mengeling van de bacteriën-amoeba onmiddellijk op het oppervlak van de petrischaal.
Opmerking: Plaats de agar pad bovenop het mengsel met behulp van een snelle vloeiende beweging. Het stootkussen langzaam op het mengsel niet lager als deze motie de neiging om de cellen te duwen naar de periferie en weg van de onderkant van het pad. Deze stap zal ervoor zorgen dat bacteriën en amoeben gelijkmatig gemengd, geïmmobiliseerd en dat beide typen cel zijn beperkt tot hetzelfde vlak. - Verwijder overtollige vocht door zachtjes pipetteren uit eventuele resterende vloeistof rondom de agar-pad. Laat de petrischaal gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur drogen.
- Bedek met de petrischaal met een deksel en Incubeer het mengsel geïmmobiliseerdet amoeba-bacteriën bij kamertemperatuur voor een extra 40 min. doorgaan naar stap 6.1.
Opmerking: Het is belangrijk dat alle monsters voor de zelfde hoeveelheid tijd, aangezien de achtergrond fluorescentie stijgt na verloop van tijd uit te broeden. Een incubatietijd van 1 uur wordt aanbevolen. Incubations voor meer dan 1 h zijn minder reproduceerbare als amoeben cellen beginnen kunnen te barsten.
6. microscopie - Beeldacquisitie
- Afbeelding amoeben met behulp van een fluorescentie Microscoop staat helderveld en groen fluorescentie afbeeldingen ophalen. Voor groene fluorescentie, groene fluorescentie proteïne (GFP) filters gebruiken met 474/27 nm en 525/45 nm voor excitatie en emissie, respectievelijk. Gebruik een 10 X (≥0.3 numerieke diafragma) doelstelling om het imago van de amoeben.
Opmerking: De calceïne-AM in de agar zal veroorzaken stervende amoeben aan fluorescentie in het groene fluorescentie-kanaal. Gezonde amoeben zijn anders niet tl. - Overname tijden voor de fase contrast, GFP kanalen beperken fototoxiciteit en optimaliseren van het dynamisch bereik van de intensiteit van de afbeelding aanpassen. De differentiële interferentie contrast (DIC) fase contrast vervangen indien nodig.
Opmerking: Gebruik 100-200 ms posities voor fase contrast en GFP fluorescentie indien mogelijk. Houd de instellingen van het instrument en blootstelling ongewijzigd gedurende het gehele experiment. Dit is essentieel voor het berekenen van de host doden index. - Afbeeldingen voor ten minste 100 amoeba cellen verwerven om goede statistieken voor het berekenen van de host doden index.
7. het beeld van analyse en Host doden Index
- Uitvoeren met behulp van ImageJ beeldanalyse.
- De fase contrast-afbeeldingsbestand in ImageJ openen door te klikken op bestand | Open en selecteren van de afbeelding. De drempel aanpassen door te klikken op de afbeelding | Analyse | Drempel. Aanpassen van de onderste en bovenste drempel Schakel alleen de piek van de intensiteit (Figuur 3A).
- De afbeelding converteren naar een binair getal door te klikken op proces | Binaire | Maken van binaire. Vul gaten door het selecteren van proces | Binaire | Vul gaten.
Opmerking: Het gebruik van de afbeelding in Figuur 1 als bron, zal stappen 7.1-7.2 produceren een afbeelding waarin de amoeben en oppervlakte-ingeschrevenen bacteriën worden weergegeven als donkere gebieden (Figuur 3B). - Zorgen dat de ruimte en het gemiddelde grijze waarde selectievakjes zijn ingeschakeld in analyseren | Instellen van metingen. De geschatte grootte van de amoeben meten door het selecteren van het gereedschap Ovaal op de hoofdwerkbalk. Klik analyseren | Maatregel en merk op het gebied van representatieve amoeben.
- Maskers voor de amoeben maken door te klikken op analyseren | Analyseren van deeltjes. Geef het gebied dat zal omvatten de amoeben maar uitsluiten van de bacteriën in het vak grootte. Selecteer maskers in het dropdown menu voor de optie weergeven. Ervoor zorgen dat het selectievakje toevoegen aan Manager is ingeschakeld.
- Klik op OK en een afbeelding toont alleen de amoeben en een ROI-Manager dialoogvenster verschijnt (Figuur 3C).
- Open de afbeelding van de fluorescentie met behulp van bestand | Open en selecteer het juiste bestand. Selecteer alle regio's in de ROI Manager door de Shift-toets ingedrukt te houden en te klikken op elk gebied in de lijst (Figuur 3D).
- Klik op de knop van de maatregel in de Manager van de ROI. Dit opent een resultatenvenster met de intensiteitswaarde van de gemiddelde voor elke amoeba.
- De fluorescentie-waarden voor elke amoeba kopiëren naar een spreadsheetprogramma en de host index doden door het nemen van het gemiddelde van alle waarden van de fluorescentie te berekenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wij groeide wild-type P. aeruginosa stam PA1419 of een ΔlasR stam20 op de dezelfde PA14 achtergrond in 6 cm-diameter petrischalen en vehiculumcontrolegroep de virulentie van de planktonische en oppervlakte-ingeschrevenen cellen. Culturen waren geënt uit single-koloniën in PS:DB culturen, 's nachts uitgegroeid in cultuur buizen in de trommel van een roller bij 37 ° C tot verzadiging, 1:100 in PS:DB, geteeld voor 8u in 6 cm-diameter petrischalen schudden bij 100 omwentelingen per minuut, en plankton en oppervlakte-ingeschrevenen verdund P. aeruginosa subpopulatie werden geïsoleerd zoals beschreven in sectie 3.
Oppervlakte-ingeschrevenen wild-type P. aeruginosa gedood amoeben, werd aangegeven door een ronde amoeba cel vorm en de observatie van calceïne fluorescentie (Figuur 4A, linker-deelvenster). Dit resulteerde in een hoge host doden index (Figuur 4B). Planktonische cellen werden verbruikt door de amoeben, werd aangegeven door amorf amoeba cel vormen en de observatie van weinig of geen calceïne fluorescentie boven achtergrond (Figuur 4A, rechterbovenhoek paneel). Dit resulteerde in een relatief lage host doden index (Figuur 4B). Oppervlakte-ingeschreven én planktonische cellen van de stam ΔlasR werden verbruikt door de amoeben, waarin werd aangegeven door lage host doden indexen (Figuur 4B, onderste paneel). Uit de resultaten blijkt dus dat virulentie upregulated in populaties oppervlak-ingeschrevenen is en de LasR vereist voor de oppervlak-geactiveerde virulentie is, die was eerder13beschreven. Deze experimenten opzetten dus robuuste positieve en negatieve controles voor toekomstige experimenten.
Figuur 1 : Schematische beschrijving van een overzicht van de virulentie assay. (1) amoeba ontvangst cellen worden gekweekt, (2) bacteriële culturen worden geteeld, en (3) planktonische of oppervlak-ingeschrevenen bacteriecellen worden gemengd met amoeben en geïmmobiliseerd op hetzelfde imaging vlak met behulp van een agar-pad. Cellen van de gastheer worden gekwantificeerd voor de gezondheid met behulp van calceïne-AM, fluorescentie microscopie en beeldanalyse. Schaal staven 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Amoeba sporen op een GYP 10 cm-diameter petrischaal plaat na 5 dagen van de groei. Sporen vorm boven het oppervlak van de petrischaal. De inzet toont een vergrote weergave van één onderdeel van het oppervlak van de schotel. Het oppervlak kan bevatten bacteriën die niet kunnen worden onderscheiden in deze resolutie. Schaal staven in hoofd- en inzet beelden 1 cm en 2 mm, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Analyse van microscopie gegevens met behulp van ImageJ image. (A) selectie van de piek intensiteit, het hulpprogramma voor de drempel. (B) Resulting beeld na de fase contrast bronafbeelding uit Figuur 1 wordt omgezet in een binaire afbeelding. (C) Resulting beeld na de afbeelding vervolgens in een masker omgezet wordt. (D) Screenshots van de selectie van regio's van belang gebruikend de Manager van de ROI. Schaal staven 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Representatieve resultaten voor amoeba doden door P. aeruginosa cellen. (A) calceïne-AM fluorescentie overlay op fase microscopie beelden en (B) host indexen van oppervlak-ingeschreven of planktonische wild-type of ΔlasR P. aeruginosadoden. Wild-type oppervlak-ingeschrevenen P. aeruginosa doodt amoeben, die aanzienlijke calceïne fluorescentie vertonen en dus een significante host doden index. Planktonische cellen worden verbruikt door amoeben, fluorescentie vertonen weinig calceïne en produceren van een lage host doden index. Oppervlakte-ingeschreven én planktonische ΔlasR worden verbruikt door amoeben en resulteren in een lage host doden index. Schaal bars vertegenwoordigen 50 µm. staven geven het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten en fouten staven geven standaard deviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol wordt een snelle en kwantitatieve methode assay virulentie in P. aeruginosabeschreven. Dit protocol kan worden getest met andere bacteriën. Het is echter belangrijk om te houden in het achterhoofd dat het groeimedium verenigbaar met de voorwaarden van de groei amoeba zijn moet. In het bijzonder, hebben wij het protocol gebruikt PS:DB als de bacteriële groeimedium geoptimaliseerd. Als andere media worden gebruikt, is het mogelijk dat het noodzakelijk is voor het uitvoeren van een groei-dit is een alleen-media-besturingselement waarin er geen bacteriële cellen aanwezig zijn om te verifiëren zijn dat het medium compatibel met de amoeben is.
Deze methode kan worden uitgebreid om de groei fase afhankelijkheid van virulentie assay. In het bijzonder, kunnen bacteriële culturen worden gekweekt voor een breed scala van tijd in plaats van een vast tijdstip. In onze ervaring is het belangrijk om te oogsten van bacteriële culturen op specifieke tijdstippen zoals virulentie in P. aeruginosa lijkt te zijn afhankelijk van de groeifase. We hebben vastgesteld dat de virulentie in P. aeruginosa tussen 6-8 h van groei in petrischalen werd opgewekt.
Veel variabelen die zijn gekoppeld aan de groei-omgeving invloed op de gezondheid van de gastheer en bacteriële virulentie. Het is dus belangrijk om goede positieve en negatieve controles voor elk experiment. Wild-type oppervlak-ingeschrevenen P. aeruginosa hebben we gebruikt als een positieve controle en ΔlasR als negatieve controle. Wij stellen voor dat deze controles verricht telkens die de virulentie-test wordt uitgevoerd. Deze besturingselementen zijn belangrijk voor het controleren dat host cel sterfgevallen niet te wijten aan alle externe factoren zijn, zoals de leeftijd van de amoeben, variaties in temperatuur, etc. Bovendien raden we alle experimenten uitvoeren in biologische repliceren om vast te stellen de reproduceerbaarheid van de virulentie fenotypen.
We hebben onze experimenten met behulp van amoeben op een optische dichtheid van 0,2 tot 0,5 na een verdunning op ten minste 1:10 uitgevoerd en hebben geregeld de temperatuur van de amoeben cultuur juist tot 22 ° C. Buiten deze groei-omstandigheden, hebben we vonden dat de gevoeligheid van de amoeben aan virulente bacteriën en de reproduceerbaarheid van de virulentie bepaling worden gewijzigd. Amoeba cellen pellet relatief snel. Ervoor zorgen dat culturen zijn geresuspendeerde door omhoog en omlaag pipetteren direct voorafgaand aan de meting van de extinctie wordt gemaakt. De amoebe culturen hoger dan een OD600 dichtheid van 1 niet groeien zoals groei te hoge dichtheden de reproduceerbaarheid van het experiment beïnvloedt. Propageren een culturen niet langer dan 1 week. Daarnaast is het belangrijk om te verifiëren dat de amoeben axenically worden geteeld (begin in stap 2.7) door middel van 20 X of hoge vergroting microscopie, dergelijke dat andere microben zijn niet aanwezig in de cultuur. Als culturen troebele in stap 2.10 na 2 dagen van groei na eerste inenting zijn, zou dit waarschijnlijk duiden op de aanwezigheid van een microbiële verontreinigingen. Als bacteriële besmetting wordt vermoed, is het raadzaam de groeiende 1 mL van de cultuur van de amoeben bij 37 ° C gedurende 4-8 uur. De waarneming van een troebel cultuur onder deze omstandigheden zou het suggereren van bacteriële besmetting. Als herhaald bacteriële besmetting wordt waargenomen, moet het antibioticum-antimycotic oplossing worden vervangen.
De host doden index is een betrouwbare indicator van of een bacteriële bevolking virulente of Avirulente is. Deze test is niet geoptimaliseerd voor vergelijkingen tussen verschillende tussenliggende niveaus van virulentie (dat wil zeggen, lage virulentie in vergelijking met Midden-lage virulentie) en overmatige interpretatie van de resultaten moet worden vermeden. Potentiële methoden om dit probleem te verhelpen zijn de herhaling van de virulentie bepaling over meerdere dagen verschillende batches van gastheer cellen gebruikt om het vertrouwen in de resultaten, extra repliceren experimenten uitvoeren en uitvoeren van passende statistische analyses.
De veelheid van infectie (MOI) van planktonische cellen kan worden gecontroleerd door het normaliseren van de extinctie van de bacteriecultuur. Deze test controleert echter niet de MOI van oppervlak-ingeschrevenen bacteriën cellen. Wij hebben geconstateerd dat bacteriële oppervlakte densiteit met de tijd toeneemt. Dus, aanpassing van de tijd van de groei in de petrischaal kan resulteren in een overeenkomstige wijziging in oppervlakte dichtheid. De oppervlakte dichtheid is daarnaast afhankelijk van het materiaal van het oppervlak. P. aeruginosa cellen koppelen aan polystyreen oppervlakken in de hier beschreven test. Andere oppervlakken zoals glas, agar en polyacrylamide kunnen echter ook worden getest13. De oppervlakte dichtheid van single-gelaagde bacteriële populaties kan worden gemeten met behulp van 100 X vergroting fase microscopie. Als oppervlakte dichtheden multi-gelaagde, kan confocal microscopie dienstig zijn.
Wij hebben hier een snelle en robuuste methode voor het meten van bacteriële virulentie beschreven. Door het wijzigen van afzonderlijke parameters zoals incubatie tijden, de fluorescente kleurstof, de bacteriële stam, de gastheer celtype of groei media, kan deze methode om te kwantificeren van virulentie in een breed scala van organismen en groei omstandigheden worden verlengd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
KP AS schreef en herziene versie van het manuscript. KP de experimenten en de analyse uitgevoerd. Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (NIH) Career Transition Award (K22AI112816) te AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
References
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
- Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).
- Alibaud, L., et al. Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model. Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).
- Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).
- Cosson, P., et al. Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System. Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).
- Pukatzki, S., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).
- Steinert, M., Heuner, K. Dictyostelium as host model for pathogenesis. Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).
- Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella. Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).
- Matz, C., et al. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae. ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).
- Hauser, A. R. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).
- Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, Abstract 304 58 (1990).
- Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -P., Cushion, M. T. Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes. Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).
- Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A., Gitai, Z. Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).
- Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).
- Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).
- Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).
- Witkin, E. M. Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).
- Loomis, W. F. Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues. Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).
- Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
- O'Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).
