Summary
여기, 선물이 D. discoideum (아메바)를 사용 하 여 호스트 planktonic 또는 표면에 부착 된 세균의 독성을 측정 하는 프로토콜. 독성은 1 시간 동안 측정 하 고 호스트를 죽이 형광 현미경 검사 법 및 이미지 분석을 사용 하 여 계량. 이 프로토콜 P. 농 균박테리아를 사용 하 여 설명 합니다.
Abstract
전통적인 세균 독성 분석 실험 호스트 셀에 몇 시간에 걸쳐 박테리아의 장기간된 노출을 포함 됩니다. 이 기간 동안 박테리아 호스트 성장 환경에 노출 하 고 호스트 세포의 존재로 인해 생리에 변화를 받을 수 있습니다. 우리는 빠르게는 박테리아 호스트 세포의 성장 정도 최소화 하는 박테리아의 독성 상태를 측정 하는 분석 결과 개발. 박테리아와 amoebae 함께 혼합 하 고 천 패드를 사용 하 여 단일 영상 평면에 움직일 수 있다. 절차는 호스트 세포 건강의 지표로 서 에스테 르 calcein acetoxymethyl (calcein-오전) 단일 셀 형광 이미징을 사용합니다. 호스트 세포의 형광 박테리아 epifluorescence 현미경 검사 법을 사용 하 여 호스트 세포의 노출의 1 시간 후 분석 된다. 이미지 분석 소프트웨어는 호스트 살인 인덱스를 계산 하는 데 사용 됩니다. 이 방법은 planktonic 및 표면 부착 녹 농 균 에서 독성을 측정 하기 위해 사용 되었습니다 biofilm 형성의 초기 단계에서 하위 인구 및 다른 박테리아와 biofilm 성장의 다른 단계에 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜 독성을 측정 하는 신속 하 고 강력한 방법을 제공 합니다 그리고 많은 성장과 포유류 세포의 유지 보수와 관련 된 복잡성을 방지 합니다. 여기 amoebae를 사용 하 여 측정 하는 독성 고기 또한 마우스 대 식 세포를 사용 하 여 확인 되었습니다. 특히,이 분석 결과 피 녹 농 균에 그 표면 첨부 파일 upregulates 독성 설정 하 사용 되었다.
Introduction
세균 감염 인간과 동물1,2사망률의 주요 원인 중 하나입니다. 문화 또는 biofilms에 박테리아의 독성을 측정 하는 능력은 의료 및 연구 설정에 중요 합니다. 여기, 세균성 독성을 계량 하는 다재 다능 한, 빠른, 그리고 상대적으로 간단한 방법을 설명 합니다. 진 핵 유기 체 Dictyostelium discoideum (아메바) 모델 호스트 유기 체로 사용 됩니다. D. discoideum 은 녹 농 균 (P. 녹 농 균)3,,45 에 다른 박테리아6,7 독성 요소를 식별 하는 호스트로 사용 되었습니다. ,8 주로 같은 독성 요인 유형 III 분 비9,10을 포함 한 포유류 세포를 죽이 게 쉽습니다. D. discoideum 를 사용 하 여 이전 독성 분석 실험 시간3,,45의 과정을 통해 디 discoideum 세포를 가진 박테리아의 장기간된 노출을 관련 있다. 프로토콜, 여기,이 아메바를 사용 하 여 독성을 결정 하는 빠른 방법을 제공 합니다. 이 프로토콜 (그림 1) 설명 하는 방법: (1) axenically (에서 박테리아의 부재) amoebae 성장, (2) 분석 결과 대 한 박테리아, (3) 준비 박테리아 성장과 현미경 검사 법, (4)에 대 한 호스트 셀 epifluorescence 현미경 검사 법, 수행 하 고 (5) 아메바 분석 형광입니다.
Amoebae 처음 냉동된 주식에서 줄무늬 고는 amoebae 포자를 생산 하는 곳의 대장균 (대장균), 잔디밭에 성장. 이 포자는 포착 하 고 axenic 성장 위한 풍부한 매체에 주사. amoebae는 영양분이 풍부한 조건에서 axenic 성장을 통해 세균 독성의 평가 대 한 박테리아와 혼합 될 준비가 될 때까지 유지 됩니다. 생존 또는 amoebae의 죽음은 calcein-acetoxymethyl (calcein-오전), 세포내 esterases에 의해 죽 습 이며, 따라서, 형광11,12에 대 한 활성화의 형광을 측정 하 여 정량. 강조 하는 반면 라이브 amoebae 거의 비슷하게 형광을 전시 하 고 죽어가는 세포 형광 강렬 하지. 이 결과 calcein-오전 건강 amoebae와 법인의 조금 또는 전혀 설립 및 스트레스 amoebae13기판의 분열. 이 문제는 특히 포유류 세포11,,1415,16calcein 오전 형광 다릅니다.
박테리아 독성에 대 한 평가 별도로 성장 된다. 여기, 우리는 기회 주의 병원 체 피 녹 농 균 의 독성을 측정 planktonic (수영) 및 표면 부착 부분 모집단의 독성을 계량 하는 방법에 자세히 설명 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 박테리아의 독성 테스트를 적용할 수 있습니다. 대표적인 결과 섹션에서 우리는 독성 표면 부착 세포에서 활성화 되 고 보여줄 낮은 planktonic 셀에 이전13보고 했다. 비 악성 planktonic 세포는 amoebae 소비 하는 동안 표면에 부착 된 독성 활성화 P. 농 균 amoebae 죽인다. Planktonic 박테리아의 독성은 전적으로 분석 되 고, 박테리아는 프로토콜에 설명 된 대로 접시를 사용 하는 것 보다는 일반 문화 관에서 경작 될 수 있습니다.
P. 농 균 문화는 amoebae 영양분이 풍부한 조건에서 안정 된 상태에서 성장 하는 동안 의도 성장 단계에 도달 되도록 amoebae의 P. 농 균 문화 성장 조정 해야 합니다. 이 상태는 일반적으로 그들은 박테리아와 혼합 되어 적어도 1 일 하기 전에 희석 amoebae 문화를 필요 합니다. Amoebae 및 박테리아 천 패드를 사용 하 여 움직일 수는, 1 시간에 대 한 공동 incubated 이며 객관적인, 녹색 형광 단백질 (GFP) 필터, 낮은 해상도 (10 X, 숫자 조리개 0.3)와 이미징 카메라를 사용 하 여 몇 군데. 분석은 ImageJ 소프트웨어를 자유롭게 사용할 수를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 또는 이미지 분석 소프트웨어를 사용자 정의. 우리의 분석은 과학적인 분석 패키지13를 사용 하 여 작성 하는 우리 자신의 소프트웨어를 사용 하 여 수행 되었다. 소프트웨어 단계 명암 이미지를 사용 하 여 마스크를 만들고 형광 이미지의 마스크 된 영역에서 형광 값을 추출 해야 합니다. 형광 값은 적어도 100 셀, 숫자 호스트 살인 색인 결과 이상 평균 했다.
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Protocol
모든 실험 절차, Irvine가 주 대학에 실행 되었다.
1. 버퍼 및 솔루션
- 이중 증 류 물 (ddH2O) 1 L에 파운드-밀러 믹스의 25 g을 추가 하 여 1 리터 유리병에 Lysogeny 국물 (파운드)를 준비 합니다. 접시, 한 천의 추가 20 g 추가. 오토 클레이 브 소독. 10 cm 직경 접시에 녹은 한 천 매체의 25 mL를 붓고 고 실 온에서 응고를 허용 합니다. 실내 온도에 액체 미디어와 4 ° c.에 한 천 배지를 저장
- D-포도 당 1 g을 혼합 하 여 1 리터 유리병에 포도 당 효 모 펩 (GYP) 접시를 준비, 펩, 효 0.25 g의 2 세대 추출, KH2포4의 4.2 g, 나2HPO47 H2O, 5.1 g, 한 천의 ddH2 1 리터에 25 g O. 고압 소독입니다. 10 cm 직경 접시에 녹은 한 천 25 mL를 붓고 고 실 온에서 응고를 허용 합니다. 4 ° c.에 게
- 펩의 10 g을 혼합 하 여 1 리터 유리병에 펩 S (PS) 매체를 준비, 7 g의 효 모 추출 물, D-포도 당, 나2HPO47 H2O, KH2포4의 1.4 g, 비타민 B12 의 40 µ g의 0.12 g의 15 g 80 µ g ddH2오의 800 mL에서 엽 산의 하루 내 pH 미터를 사용 하지 않은 경우 pH 4와 pH 7 표준 사용 하 여 전자 pH 미터 보정.
- PH 미터를 사용 하 여 PS 매체의 pH를 측정 합니다. 5 M 코 또는 5 M H3포4 pH 6.5 조정 하려면 추가 합니다. 1 l 최종 볼륨 조정 ddH2오 필터를 사용 하 여 0.22 μ m 진공 필터를 사용 하 여 소독 및 4 ° c.에 저장
참고: 장갑, 보호복, 눈 보호, 보호 장비를 착용 하 여 pH 조정으로 신중 하 게 진행 하 고 얼굴을 보호.
- PH 미터를 사용 하 여 PS 매체의 pH를 측정 합니다. 5 M 코 또는 5 M H3포4 pH 6.5 조정 하려면 추가 합니다. 1 l 최종 볼륨 조정 ddH2오 필터를 사용 하 여 0.22 μ m 진공 필터를 사용 하 여 소독 및 4 ° c.에 저장
- 10 개발 버퍼 프라임 배 준비 (DB') KH2포4나2HPO4 7 H2O, 그리고 ddH2O의 13.4 g 3.4 g 800 mL의 총 볼륨을 추가 하 여 1 리터 유리병에 버퍼. 하루 내 pH 미터를 사용 하지 않은 경우 pH 4와 pH 7 표준 사용 하 여 전자 pH 미터 보정.
- 전자 산도 측정기를 사용 하 여 버퍼의 pH를 측정 합니다. 부드럽게 5 M 코 또는 5 M H3포4 필요에 따라 추가 하 여 6.5에 pH를 조정 합니다. 1 l ddH2O를 사용 하 여 최종 볼륨을 조정 하 고 압력가 마로 소독 하 여 소독. 실내 온도에 상점.
참고: 장갑, 보호복, 눈 보호, 보호 장비를 착용 하 여 pH 조정으로 신중 하 게 진행 하 고 얼굴을 보호.
- 전자 산도 측정기를 사용 하 여 버퍼의 pH를 측정 합니다. 부드럽게 5 M 코 또는 5 M H3포4 필요에 따라 추가 하 여 6.5에 pH를 조정 합니다. 1 l ddH2O를 사용 하 여 최종 볼륨을 조정 하 고 압력가 마로 소독 하 여 소독. 실내 온도에 상점.
- 1 개발 버퍼 (DB) x 10 100 mL를 혼합 하 여 만들 DB x'의 1 mL와 버퍼 2 M MgCl2, 소독 하 고 1 mL의 1 M CaCl2소독. 1 l 1 L 유리 병 실내 온도에 압력가 마로 소독 멸 균된 ddH2O. 저장소를 사용 하 여 최종 볼륨을 조정 합니다.
- 멸 균된 PS 매체의 100 mL를 혼합 하 여 1 리터 유리병에 PS:DB 매체를 준비, 100 mL의 멸 균 10 DB x' 버퍼, 그리고 소독된 ddH2O 1 L. 보충의 총 볼륨의 1 mL을 소독 2 M MgCl2 와 1 mL의 1 M CaCl 소독 2. 4 ° c.에 게
- Calcein-am는 제조업체에서 제공 하는 플라스틱 용기에서 50 µ g에 DMSO의 50 µ L을 추가 하 여 calcein 오전 재고 솔루션을 준비 합니다. -20 ° c.에 게
2. 성장과 Amoebae의 유지 보수
- 초기 성장 기간 동안 대장균 스트레인 B/r17 amoebae 위한 음식 근원으로 성장. 행진 대장균 냉동된 재고에서 B/r 파운드 한 천 격판덮개에-80 ° C에 저장 하 고 37 ° C 하룻밤 단일 식민지를에서 품 어.
- LB 매체의 2 mL에 대장균 B/r의 단일 식민지를 접종 하 고 하룻밤 롤러 드럼 또는 37 ° C에서 통에서 품 어.
- 실 온에 하룻밤 대장균 문화를 가져와. 나무 막대기를 사용 하 여, 야간 문화 750 µ L로-80 ° C에서 보관 냉동된 재고에서 amoebae 접종.
참고: 사용 디 discoideum 스트레인 AX3, axenic 성장18수 있는. 이 단계는 axenic 성장, 필요 하지 않습니다 하지만 후속 단계 그의 요구를 해야 합니다. - 즉시 포도 당 효 모 펩 (GYP) 접시에 amoebae-대장균 혼합물의 700 µ L를 추가 합니다. 뒤로-및-앞뒤와 측면-투-사이드 필요에 따라 그것을 기울이기로 접시의 표면에 균등 하 게 문화를 확산. 스프레더 사용을 하지 않습니다.
- GYP 접시를 한 높은 습도 유지 하는 상자에 향하도록 넣습니다. 2 일회용 플라스틱 용기를 사용 하 여 (183 cm x 183 cm x 91 cm) 서로 위에 쌓아. 물 약 25 mL와 하단 컨테이너와 상위 컨테이너에는 물이 저수지에서 이동 수 분 수 있도록 컨테이너의 바닥을 통해 교 련된 여러 0.5 cm 직경 구멍 최고 컨테이너를 놓습니다.
- 4-5 일 아메바 포자 표면 근처에 있는 격판덮개 (그림 2)의 성장 관찰 하는 때까지 GYP 접시와 22 ° C에서 상자를 품 어. 냉장된 인큐베이터를 사용 하 여 접시 보다는 실 온에서 부 화를 품 어.
참고: 포자, 성장 후 그들은 남아 있다 4 ° c.에 저장 될 때 몇 주 동안 접시에 가능한 한 천 면이 위로 향하도록 접시를 저장 합니다. 3-4 일 후 부 화, 세균성 잔디밭에서 비운의 영역 관찰할 수 있습니다, 아메바 포자 형성의 발병을 나타내는.- 인큐베이션 (그림 2)의 4-5 일 후 작은 amoebae 플레이트 표면 위에 포자를 관찰 합니다.
참고:이 기간을 넘어 포자의 품질 저하로, 일주일 이상 amoebae를 성장 하지 않습니다.
- 인큐베이션 (그림 2)의 4-5 일 후 작은 amoebae 플레이트 표면 위에 포자를 관찰 합니다.
- 수집 amoebae 포자 균 1 mL 피 펫 팁 접시의 표면에 병렬 스윕하여는 amoebae의 axenic 성장을 위한 준비를 합니다. 10 cm 배양 접시의 절반에서 포자를 수집 합니다.
참고:이 모션 대장균의 다 수 수집 됩니다 한 천 격판덮개의 표면에 팁을 만지지 마십시오. - PS 매체의 1 mL에 팁을 immersing 하 고 부드럽게 위아래로 pipetting으로 피 펫의 끝에는 amoebae를 resuspend.
- 0.25 배 농도에서 항생제 antimycotic 솔루션과 보완 PS 매체의 25 mL를 포함 하는 250 mL 플라스 크에 접종된 혼합물을 전송 합니다.
참고:-20 ° c.에 250 µ L aliquots 항생제 antimycotic 솔루션 저장 해빙이 그 효능을 줄일 수로이 솔루션의 동결의 반복된 주기를 하지 마십시오. - 100 rpm 회전 통에 22 ° C에서 axenically amoebae 성장. 5 단계에서 독성 분석 결과 대 한 600에서 측정 하는 광학 밀도 세포 성장 0.2 0.5 nm (OD600).
참고:이 단계는 접종 (2.7 단계)의 시간에서 3-4 일을 요구 한다. 더 높은 밀도에 세포 성장, PS는 OD600 0.05 이하로 중간에 다시 문화를 희석 하 고 0.2 0.5의600 세 다시 성장.
3. P. 녹 농 균 의 성장
- 파운드 플레이트에서 P. 녹 농 균 에의 한 식민지 선택, PS:DB 문화 2 mL에 접종 하 고 채도를 37 ° C에서 하룻밤 성장.
참고: PS:DB 미디어 항생제 antimycotic 솔루션을 추가 하지 마십시오. - PS:DB를 사용 하 여 6 cm 직경 샬레에 숙박 문화 1: 100 또는 1:1,000를 희석. Planktonic 세포 독성은 전적으로 분석 되 고, 만약 성장 대신 기존의 문화 관을 사용 하 여 문화. 37 ° c.에서 100 rpm에서 설정 벤치탑 회전자에 문화를 흔들어
- 재현성을 보장 하기 위해 특정 시간 포인트에서 문화를 수확. 독성을 평가 하는 앞서 1 h 30 분 천 패드 섹션 4에서에서 설명한 대로 준비 합니다.
참고: 피 녹 농 균 에 독성 약 8 h의 표면에 성장에 의해 유도 된다. - 표면 부착 세포 분리, 배양 접시에서 액체 매체를 제거 하 고 즉시 planktonic 셀을 제거 하려면 DB 버퍼의 1 mL로 씻어 5.1 단계로 바로 진행.
주의: 30 이상 세척 하지이 것으로 s 교란 및 표면 부착 세포를 분리 하 고 독성 측정에 영향을 미칠 수 있습니다. - Planktonic 세포를 분리, 깨끗 한 배양 접시에 배양 접시에서 문화의 10 µ L를 전송 하 고 5.1 단계로 바로 진행 합니다.
4. 현미경-천 패드의 준비
- Amoebae P. 농 균혼합 준비가 전에 천 패드 1 시간 30 분 정도 준비 합니다.
- 250 mL 플라스 크에 DB 버퍼 한 천 1% (w/v) 50 mL를 전자 레인지. Agar의 대단히 짧은 시간까지 혼합 모든 20 s가 사라집니다.
- 15 분 동안 데워 55 ° C 물 욕조에 그것을 배치 하 여 녹은 agar를 냉각 하십시오.
- 15 ml 원뿔 튜브에 녹은 agar의 calcein 오전 재고 솔루션의 15 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 반전 튜브 4-5 배 하 여 혼합 하 고 즉시 다음 단계를 진행 합니다.
참고: 폴 리 프로필 렌 15 mL 원심 분리기 튜브에서이 단계를 수행 합니다. 이를 너무 빨리 응고 한 발생할 것입니다 두꺼운 유리 용기를 사용 하지 마십시오. - 12 cm x 10 cm 유리 접시 위에 녹은 한 천 혼합물을 부 어 하 고 실 온에서 10 분간 응고 agar를 허용 합니다. 유리 접시 인쇄 된 격자에 놓고 절단 금속 눈금자를 사용 하 여 그리드를 따라 작은 1.5 c m x 1.5 c m 섹션으로 응고 한 천 패드를 잘라.
- 사용할 준비가 될 때까지 습 한 상자에 수 화 젤을 유지.
5. 현미경-영상에 대 한 박테리아 아메바 샘플의 준비
- 표면에 부착 된 세균 세포의 독성을 분석 결과, 추가 10 µ L 아메바 세포의 단계 2.10에서에서 3.4 단계에서 표면에 부착 된 박테리아를.
참고:이 단계는 박테리아와 amoebae의 혼합을 설명 합니다. - Planktonic 세포의 독성을 분석 결과, 단계의 3.5 planktonic 박테리아의 10 µ L로 단계 2.10에서에서 아메바 세포의 10 µ L을 혼합 한다.
참고: 박테리아와 혼합 하기 전에 (한 OD600 0.2 0.5) axenically 성장 아메바 세포 씻지 않는. 아니 대장균 성장 항생제 antimycotic 솔루션의 사용으로 인해 아메바 문화에서 관찰 됩니다. - 바로 페 트리 접시 표면에 박테리아 아메바 혼합물 위에 4.5 단계에서 1.5 c m x 1.5 c m calcein 오전 천 패드를 놓습니다.
참고: 빠른 부드러운 모션을 사용 하 여 혼합물 위에 천 패드를 놓습니다. 이 모션 주변 그리고 패드의 아래쪽에서 세포를 밀어 경향이 있다 혼합물에 천천히 패드를 낮출 하지 않습니다. 이 단계는 박테리아와 amoebae는 균등 하 게 보장 한다 혼합, 움직일 수 두 종류 세포 같은 평면에 수감 된다. - 천 패드를 둘러싼 나머지 액체 밖으로 부드럽게 pipetting으로 과잉 액체를 제거 합니다. 실 온에서 20 분 동안 건조를 페 트리 접시를 허용 합니다.
- Petri 접시 뚜껑으로 커버 하 고는 추가 40 분 진행 단계 6.1에 대 한 실 온에서 고정된 아메바-박테리아 혼합물을 품 어.
참고: 시간, 시간이 지남에 배경 형광 증가의 동일한 금액에 대 한 모든 샘플을 품 어 중요 하다. 1 h의 외피 시간 것이 좋습니다. 1 시간 이상 외피는 덜 재현할 amoebae 셀 버스트를 시작할 수 있습니다.
6입니다. 현미경-이미지 수집
- 이미지 amoebae 명시 및 녹색 형광 이미지 수 있는 형광 현미경을 사용 하 여. 474/27와 녹색 형광 단백질 (GFP) 필터 사용 녹색 형광에 대 한 및 525/45 nm 여기 및 방출, 각각. 10 X (≥0.3 숫자 조리개) 목표는 amoebae의 이미지를 사용 합니다.
참고:는 agar에 calcein 오전 녹색 형광 채널에서 죽어가는 amoebae 형광을 발생 합니다. 건강 한 amoebae는 달리 형광. - GFP 이미지 농도의 동적 범위를 최적화 하 고 phototoxicity, 제한 채널 위상 대조에 대 한 수집 시간을 조정 합니다. 필요한 경우 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 단계 대조를 대체 합니다.
참고: 가능 하면 위상 대비 및 GFP 형광 100-200 ms 노출을 사용 합니다. 전체 실험을 통해 그대로 노출 및 악기 설정을 유지 합니다. 이것은 호스트 살인 지 계산 중요 합니다. - 살인 지 계산 하는 호스트에 대 한 좋은 통계를 얻기 위하여 적어도 100 아메바 세포에 대 한 이미지를 취득 합니다.
7. 이미지 분석 및 호스트 살인 인덱스
- ImageJ를 사용 하 여 이미지 분석을 수행 합니다.
- ImageJ에서 파일을 클릭 하 여 단계 대조 이미지 파일을 열고 | 오픈 이미지를 선택 하 고. 이미지를 클릭 하 여 임계값을 조정 | 분석 | 임계값. 강도 피크 (그림 3A)만 선택 하는 하위 및 상위 임계값을 조정 합니다.
- 프로세스를 클릭 하 여 이진 이미지를 변환 | 이진 | 이진 하 게. 프로세스를 선택 하 여 구멍을 채우기 | 이진 | 구멍 채우기.
참고: 그림 1 에서 이미지를 사용 하 여 원본으로, 단계 7.1-7.2 amoebae 및 표면 연결 박테리아 어두운 영역 (그림 3B)으로 표시 한 이미지를 생산할 예정 이다. - 지역 및 회색 값 의미 상자 분석에에서 체크 확인 | 측정을 설정. 주 도구 모음에서 타원 도구를 선택 하 여는 amoebae의 대략적인 크기를 측정 합니다. 클릭 분석 | 측정 고 대표 amoebae의 영역.
- 분석을 클릭 하 여는 amoebae에 대 한 마스크를 만들기 | 입자 분석. 크기 상자에는 amoebae 포함 되지만 박테리아 제외 영역을 입력 합니다. 보기 옵션에 대 한 드롭다운 메뉴 막대에서 마스크 를 선택 합니다. 관리자 추가 상자가 선택 되어 있는지 확인 합니다.
- 확인 및 이미지 표시만 amoebae와 ROI 관리자 대화 상자가 나타납니다 (그림 3C) 클릭 합니다.
- 파일을 사용 하 여 형광 이미지를 엽니다 | 오픈 적절 한 파일을 선택 하 고. Shift 키를 누른 채 목록 (그림 3D)에서 각 지역에 클릭 수익 관리자 에서 모든 영역을 선택 합니다.
- 투자 수익 관리자에서 측정 버튼을 클릭 합니다. 이 각 아메바의 평균 휘도 값 표시 결과 창이 열립니다.
- 스프레드시트 프로그램에 각 아메바의 형광 값을 복사 하 고 모든 형광 값의 평균을 취 함으로써 인덱스를 죽이고 호스트를 계산.
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Representative Results
우리 야생-타입 성장 P. 농 균 PA1419 스트레인 또는 ΔlasR 6 cm 직경 접시에 동일한 PA14 배경에서20 를 변형 하 고 planktonic 및 표면에 연결 된 세포의 독성을 분석. 문화는 PS:DB 문화, 채도를 37 ° C에서 롤러 드럼에 문화 관에서 하룻밤 성장에 단일 식민지에서 주사 했다, PS:DB, 100 rpm, 떨고 6 cm 직경 접시에 8 h에 대 한 성장 planktonic 고 표면 부착에 1: 100 희석 P. 농 균 하위 인구 격리 섹션 3에서에서 설명 했다.
야생-타입 표면 부착 P. 농 균 사망 amoebae, 라운드 아메바 세포 모양 및 calcein 형광 (그림 4A, 왼쪽 패널)의 관찰에 의해 표시 되었다. 이 결과 높은 호스트 살인 인덱스 (그림 4B). Planktonic 셀 비정 질 아메바 세포 형태와 배경 (그림 4A, 오른쪽 상단 패널) 위에 거의 비슷하게 calcein 형광 관찰에 의해 표시 되었다 amoebae 소비 했다. 이 결과 상대적으로 낮은 호스트 살인 인덱스 (그림 4B). 두 표면 부착 하 고 ΔlasR 스트레인의 planktonic 셀 인덱스 (그림 4B, 하단 패널)를 죽이 낮은 호스트에 의해 표시 되었다 amoebae에서 사용 했다. 결과 따라서 표시 독성 upregulated 표면 부착 된 인구에서는 LasR 표면 활성화 독성에 대 한 필요는13위에서 설명한 했다. 이러한 실험은 따라서 미래 실험을 위한 강력한 긍정 및 부정적인 컨트롤을 설정합니다.
그림 1 : 독성 분석 결과 대 한 개요를 설명 하는 도식. (1) 아메바 호스트 세포 성장 하는, (2) 세균성 문화는 성장, 그리고 (3) planktonic 또는 표면에 부착 된 세균 세포는 amoebae 혼합 한 천 패드를 사용 하 여 동일한 영상 평면에 움직일. 호스트 셀 calcein 오전, 형광 현미경 검사 법, 이미지 분석을 사용 하 여 건강에 대 한 정량 된다. 스케일 바 대표 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 아메바 GYP 10 cm 직경 접시 배양 접시에 성장의 5 일 후 포자. 페 트리 접시 표면 위에 포자 형태입니다. 삽입 접시 표면의 단일 섹션의 확대 보기를 표시합니다. 표면에이 해상도 분별 없는 박테리아를 포함할 수 있습니다. 주요 및 삽입 된 이미지에서 스케일 바 1 cm 2 mm를 각각 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 이미지 ImageJ를 사용 하 여 현미경 검사 법 데이터 분석. (A) 임계값 도구를 사용 하 여 피크 강도의 선택. (B) 결과 이미지에 그림 1 에서 단계 대조 소스 이미지 바이너리 이미지를 변환 됩니다 후. (C) 결과 이미지 이미지 마스크 변환 이후에 후. (D) 투자 수익 관리자를 사용 하 여 관심 영역 선택의 스크린샷. 스케일 바 대표 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 피 녹 농 균 셀에 의해 살해 하는 아메바의 대표적인 결과. (A) Calcein 오전 형광 위상 현미경 이미지와 인덱스의 표면 부착 또는 planktonic 야생-타입 또는 ΔlasR P. 녹 농 균을 죽이 (B) 호스트에 중첩. 야생-타입 표면 부착 P. 농 균 죽 amoebae, 중요 한 calcein 형광을 전시 하 고 따라서 상당한 호스트 죽이고 인덱스. Planktonic 셀 amoebae 작은 calcein 형광을 전시 하 고 낮은 호스트 살인 색인 생성에 의해 사용 됩니다. 둘 다 표면 부착 및 planktonic ΔlasR amoebae 결과 낮은 호스트 살인 인덱스에 의해 사용 됩니다. 스케일 바 바 년 대표 50 µ m. 3 개의 독립적인 실험의 평균 나타내고 오류 막대 표준 편차를 표시 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜 P. 녹 농 균에 독성 분석 결과를 신속 하 고 양적 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 박테리아와 테스트할 수 있습니다. 그러나, 그것은 성장 매체 아메바 성장 조건와 호환 되어야 하는 마음에 유지 하는 것이 중요입니다. 특히, 우리는 세균성 성장 매체로 PS:DB를 사용 하 여 프로토콜을 최적화 했습니다. 다른 미디어를 사용 하는 경우에는 셀이 없으면 세균성 매체는 amoebae와 호환 되는지 확인 하려면 현재 성장 미디어 전용 제어를 수행할 필요할 수 있습니다.
이 메서드는 독성의 성장 단계 의존도 분석 결과를 확장할 수 있습니다. 특히, 세균성 문화 다양 한 고정된 시간 포인트 대신 시간에 대 한 성장 될 수 있다. 우리의 경험에서는, 그것은 피 녹 농 균 에 독성 성장 단계에 종속 되도록 나타나는 특정 시간 포인트에서 세균성 문화를 수확 하는 것이 중요. P. 녹 농 균 에 독성의 배양 접시에 성장 6-8 h 사이 유도 되었다 관찰 합니다.
성장 환경과 관련 된 많은 변수는 호스트 및 세균성 독성 영향을. 따라서, 각 실험에 대 한 적절 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤을 사용 하는 것이 중요 하다. 우리는 긍정적인 제어 및 ΔlasR 부정적인 컨트롤로 야생-타입 표면 부착 피 녹 농 균 을 이용 했다. 독성 시험 수행 때마다 이러한 컨트롤을 수행 하는 것이 좋습니다. 이러한 컨트롤은는 호스트 셀 사망자가 하지 어떤 외부 요인으로 인해 amoebae, 온도, 등등 에 있는 변이의 나이 또한, 우리는 것이 좋습니다 생물 복제 설정 하에 모든 실험을 수행과 같은 중요 한 독성 고기의 재현성입니다.
우리는 우리의 실험에 사용 하 여 amoebae 0.2 0.5의 광학 밀도에 한 희석 후 최소한 1시 10분 공연과 amoebae 문화를 정확 하 게 22 ° c.의 온도 통제 이러한 성장 조건 이외의 우리 악성 박테리아 amoebae의 민감성과 독성 분석 결과의 재현성 변경 것으로 나타났습니다. 아메바 세포는 비교적 신속 하 게 작은. 문화 바로 광학 밀도 측정 되기 전에 아래로 pipetting으로 resuspended는 확인 하십시오. 높은 밀도를 성장에 영향을 미치는 실험의 재현성으로 아메바 문화 1 OD600 밀도 보다 높은 성장 하지 않습니다. 1 주 보다는 더 이상에 대 한 axenic 문화를 전파 합니다. 또한, 그건 amoebae axenically 성장 확인 하는 것이 중요 (단계 2.7에서에서 시작) 20 X 또는 고배율 현미경 등을 통해 다른 미생물 문화에 존재 하지 않습니다. 성장 초기 접종을 다음의 2 일 후 문화 단계 2.10에서에서 혼 탁 한 경우,이 가능성이 미생물 오염 물질의 존재를 나타낼 것 이다. 세균성 오염 의심 되는 경우 4-8 h 37 ° C에서 amoebae 문화의 1 mL를 성장 하는 것이 좋습니다. 이러한 조건에서 혼 탁 한 문화 관찰 세균 오염 제안. 세균성 오염 관찰, 반복 하는 경우 항생제 antimycotic 솔루션을 대체 되어야 한다.
호스트 죽이 인덱스는 세균성 인구는 악성 또는 avirulent의 신뢰할 수 있는 표시기입니다. 이 분석 결과 독성 (즉, 낮은 독성 낮음 독성에 비해)의 다른 중간 수준 사이의 비교에 대 한 최적화 되지 하 고 과잉 해석 결과의 피해 야 한다. 잠재적인이 문제를 해결 하는 추가 복제 실험을 수행 하 고 적절 한 수행 결과에 신뢰를 설정 하려면 호스트 세포의 다른 배치를 사용 하 여 여러 일 동안 독성 분석 결과의 반복 통계 분석입니다.
Planktonic 세포의 감염 (MOI)의 다양성은 세균성 문화의 광학 밀도 정상화 하 여 제어할 수 있습니다. 그러나,이 분석 결과 표면에 부착 된 세균 세포의 나를 제어 하지 않습니다. 우리 세균 표면 밀도 시간 증가 관찰 했습니다. 따라서, 페 트리 접시에 성장 시간 조정 될 수 있습니다 해당 변경에 표면 밀도. 또한, 표면 밀도 표면 재질에 따라 달라 집니다. P. 농 균 세포 분석 결과 설명에 폴리스 티 렌 표면에 연결 합니다. 그러나, 유리, 천, 그리고 polyacrylamide를 포함 하 여 다른 표면 분석13수도 있습니다. 확대 단계 현미경 X 100을 사용 하 여 단일 레이어 세균성 인구의 표면 밀도 측정할 수 있습니다. 표면 밀도 다층, confocal 현미경 검사 법에 적절 한 수 있습니다.
여기, 우리는 세균성 독성을 측정 하는 신속 하 고 강력한 방법을 설명 했습니다. 보육 시간, 형광 염료, 세균성 긴장, 호스트 세포 유형, 또는 성장 매체와 같은 개별 매개 변수를 수정 하 여이 메서드는 다양 한 유기 체 및 성장 조건에서 독성을 계량을 확장할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
KP와 그대로 쓴 원고를 수정. KP는 실험 및 분석을 수행합니다. 이 작품을 다른 이름으로 국립 보건원 (NIH) 경력 전환 상 (K22AI112816)에 의해 지원 되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
References
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
- Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).
- Alibaud, L., et al. Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model. Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).
- Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).
- Cosson, P., et al. Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System. Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).
- Pukatzki, S., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).
- Steinert, M., Heuner, K. Dictyostelium as host model for pathogenesis. Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).
- Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella. Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).
- Matz, C., et al. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae. ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).
- Hauser, A. R. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).
- Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, Abstract 304 58 (1990).
- Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -P., Cushion, M. T. Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes. Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).
- Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A., Gitai, Z. Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).
- Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).
- Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).
- Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).
- Witkin, E. M. Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).
- Loomis, W. F. Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues. Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).
- Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
- O'Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).
