Um ensaio rápido de virulência bacteriana baseada em imagem usando ameba

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para medir a virulência das bactérias planctônicas ou conectado à superfície usando d. discoideum (ameba) como um host. Virulência é medida durante um período de 1h e anfitrião matando é quantificada usando análise de imagem e de microscopia de fluorescência. Vamos demonstrar a este protocolo utilizando a bactéria p. aeruginosa.

Abstract

Ensaios de virulência bacteriana tradicionais envolvem exposição prolongada de bactérias ao longo de várias horas para células hospedeiras. Durante este tempo, as bactérias podem sofrer alterações na fisiologia devido a exposição ao ambiente de crescimento de host e a presença de células hospedeiras. Desenvolvemos um ensaio para avaliar rapidamente o estado de virulência de bactérias que podem minimizar a extensão a que as bactérias crescem na presença de células hospedeiras. As bactérias e as amebas são misturadas e imobilizadas em um avião de imagem usando um bloco de ágar. O procedimento usa imagens de fluorescência de célula única com calceína-acetoximetil éster (calceína-AM) como um indicador da saúde de célula do hospedeiro. A fluorescência das células do hospedeiro é analisada após 1 h de exposição das células do hospedeiro para bactérias usando microscopia de epifluorescência. Software de análise de imagem é usado para calcular um índice de mortes do anfitrião. Este método tem sido usado para medir a virulência dentro planctônicos e conectado à superfície Pseudomonas aeruginosa sub-populações durante o estágio inicial de formação de biofilme e pode ser adaptado para outras bactérias e outras fases de crescimento do biofilme. Este protocolo fornece um método rápido e robusto de virulência de medição e evita muitas das complexidades associadas ao crescimento e manutenção de linhas de células de mamíferos. Fenótipos de virulência medidos aqui usando amebas também foram validados usando macrófagos de rato. Em particular, este ensaio foi usado para estabelecer essa virulência de upregulates acessório superfície em p. aeruginosa.

Introduction

Infecção bacteriana é uma das principais causas de mortalidade em humanos e animais,^1,2. A capacidade de medir a virulência de bactérias em culturas ou biofilmes é importante em contextos de cuidados de saúde e pesquisa. Aqui, descrevemos um método relativamente simples, rápido e versátil para quantificar a virulência bacteriana. O organismo eucariótico Dictyostelium discoideum (ameba) é usado como o organismo hospedeiro do modelo. D. discoideum tem sido usado como um host para identificar fatores de virulência em Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa)^3,4,5 e outras bactérias^{6,7 ,8} e é suscetível a em grande parte os mesmos fatores de virulência que matam células de mamíferos incluindo tipo III secreção^9,10. Ensaios de virulência anterior usando d. discoideum envolveram exposição prolongada de bactérias com células de d. discoideum ao longo de horas^3,4,5. O protocolo, aqui, apresenta um método rápido de determinar a virulência usando essa ameba. Este protocolo (Figura 1) descreve como: (1) crescem as amebas axenically (na ausência de bactérias), (2) crescer bactérias para o ensaio, (3) preparar as bactérias e células hospedeiras para microscopia, (4) realizar microscopia de epifluorescência e (5) analisar ameba fluorescência.

Amebas são inicialmente listradas fora dos estoques congelados e crescidas em um gramado de Escherichia coli (e. coli), onde as amebas produzem esporos. Estes esporos são escolheu e inoculados em um meio enriquecido para o crescimento axénica. As amebas são mantidas através de crescimento axénica em condições ricas em nutrientes até que estejam prontos para serem misturados com as bactérias para a avaliação de virulência bacteriana. A sobrevivência ou a morte das amebas é quantificada pela medição da fluorescência de calceína-acetoximetil (calceína-AM), que é clivada por esterases intracelulares e, desse modo, ativado por fluorescência^11,12. Ao vivo amebas apresentam pouca ou nenhuma fluorescência Considerando que salientou e células morrendo brilham intensamente. Este resultado é devido a uma pequena ou nenhuma incorporação de calceína-AM em amibas saudáveis e incorporação e clivagem do substrato em amibas estressado¹³. Esse comportamento é notavelmente diferente da fluorescência de calceína-AM em células de mamíferos^11,14,15,16.

Bactérias que serão avaliadas para virulência são cultivadas separadamente. Aqui, descrevemos como medir a virulência do patógeno oportunista p. aeruginosa e detalhe como quantificar a virulência de planctônica (natação) e as subpopulações conectado à superfície. Este protocolo pode ser adaptado para testar a virulência de outras bactérias. Na seção de resultados de representante, mostramos que virulência é ativada nas células conectado à superfície e baixa em células planctônicas, que foi relatado anteriormente¹³. Virulência-ativado conectado à superfície de p. aeruginosa mata amebas enquanto não-virulenta células planctônicas são consumidas pelas amebas. Se a virulência das bactérias planctônicas unicamente está sendo analisada, as bactérias podem ser cultivadas em tubos de cultura comum, ao invés de usar placas de Petri, conforme descrito no protocolo.

O crescimento das amebas e p. aeruginosa culturas deve ser coordenado, tal que p. aeruginosa culturas alcançar a fase de crescimento pretendido enquanto as amebas estão crescendo no estado estacionário em condições ricas em nutrientes. Esta condição geralmente requer culturas amebas para ser diluído pelo menos 1 dia antes de quando eles são misturados com bactérias. Amebas e bactérias são imobilizadas usando almofadas de ágar, são incubadas co por 1h e fotografaram usando uma resolução baixa (10 X, abertura numérica 0.3) filtra proteínas fluorescência objetiva, verde (GFP) e uma câmera de imagens. Análise pode ser realizada usando disponível gratuitamente software ImageJ ou personalizado software de análise de imagem. Nossa análise foi realizada usando nosso próprio software escrito usando um pacote de análise científica¹³. O software deve criar uma máscara usando a imagem de contraste de fase e extrair valores de fluorescência das áreas mascaradas na imagem de fluorescência. Valores de fluorescência são calculados pelo menos 100 células, resultando em um índice de mortes de anfitrião numérica.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram realizados na Universidade da Califórnia, Irvine.

1. buffers e soluções

1. Prepare o caldo de lisogenia (LB) em um frasco de vidro de 1 L, acrescentando 25 g de mistura de LB-Miller em 1 litro de água bidestilada (ddH₂O). Para placas de Petri, adicione um adicional 20 g de ágar-ágar. Autoclave para esterilizar. Despeje a 25 mL de ágar-ágar fundido Petri de 10 cm de diâmetro e deixar para solidificar à temperatura ambiente. Armazenar a mídia líquida à temperatura ambiente e placas de ágar a 4 ° C.
2. Preparar pratos de glicose levedura peptona (cigano) em um frasco de vidro de 1 L misturando-se 1 g de D-glicose, extrato de 2 g de peptona, 0,25 g de levedura, 4,2 g de KH₂PO₄, 5,1 g de Na₂HPO₄7 H₂O e 25 g de ágar-ágar em 1 L de DDQ₂ O. Autoclave para esterilizar. Despeje a 25 mL de ágar fundido Petri de 10 cm de diâmetro e deixar para solidificar à temperatura ambiente. Loja a 4 ° C.
3. Prepare o suporte de peptona S (PS) em uma garrafa de vidro 1L pela mistura de 10g de peptona, extrato de 7 g de fermento, 15 g de D-glicose, 0,12 g de Na₂HPO₄7 H₂O, 1,4 g de KH₂PO₄, 40 µ g de vitamina B₁₂ , e 80 µ g de ácido fólico em 800 mL de DDQ₂O. calibrar um medidor de pH eletrônico usando padrões de pH 7 e pH 4 se o medidor de pH não tenha sido usado dentro de um dia.
   1. Medir o pH do meio PS usando o medidor de pH. Adicione 5 M KOH ou 5 M H₃PO₄ para ajustar o pH a 6.5. Ajustar o volume final para 1 L usando ddH₂O. Filter esterilizar usando filtro de vácuo 0,22 µm e armazenar a 4 ° C.
      Nota: Proceda com cautela com os ajustes do pH através do uso de equipamento de proteção incluindo luvas, roupas de proteção, óculos de proteção e protecção facial.
4. Prepare-se 10 x desenvolvimento Buffer Prime (DB') buffer em um frasco de vidro de 1 L, adicionando 3,4 g de KH₂PO₄, 13,4 g de Na₂HPO₄ 7 H₂O e ddH₂O para um volume total de 800 mL. Calibre um medidor de pH eletrônico usando padrões de pH 7 e pH 4 se o medidor de pH não tenha sido usado dentro de um dia.
   1. Medir o pH do buffer usando o medidor de pH eletrônico. Ajuste o pH a 6.5 adicionando suavemente ou 5m KOH ou 5 M H₃PO₄ conforme necessário. Ajustar o volume final para 1 L usando ddH₂O e esterilizar em autoclave. Armazenar em temperatura ambiente.
      Nota: Proceda com cautela com os ajustes do pH através do uso de equipamento de proteção incluindo luvas, roupas de proteção, óculos de proteção e protecção facial.
5. Fazer 1 x buffer de desenvolvimento (DB) misturando-se 100 mL de 10 x DB' buffer com 1 mL de esterilizados de MgCl 2 M₂, e 1 mL de esterilizados 1 M CaCl₂. Ajuste o volume final para 1 L em um frasco de vidro de 1 L usando um de DDQ esterilizado autoclavado₂loja O. à temperatura ambiente.
6. Prepare PS:DB médio em um frasco de vidro de 1 L misturando-se 100 mL de meio de PS esterilizado, 100 mL de esterilizado 10 x DB' buffer e esterilizado ddH₂O para um volume total de 1 L. suplemento com 1 mL de esterilizados de MgCl 2 M₂ e 1 mL de esterilizados 1 M CaCl ₂. loja a 4 ° C.
7. Prepare a solução-mãe de calceína-AM, acrescentando 50 µ l de DMSO para 50 µ g de calceína-AM no recipiente plástico fornecido pelo fabricante. Loja a-20 ° C.

2. o crescimento e manutenção das amebas

1. Cresce Escherichia coli estirpe b/r¹⁷ como fonte de alimento para as amebas durante o período de crescimento inicial. Raia Escherichia coli b/r de um estoque congelado armazenado a-80 ° C em uma placa de ágar LB e incubar a 37 ° C durante a noite para obter colônias única.
2. Inocular uma única colônia de e. coli b/r em 2 mL de meio LB e incubar durante uma noite em um tambor de cilindro ou um agitador a 37 ° C.
3. Trazer o pernoite cultura de e. coli para a temperatura ambiente. Usando uma vara de madeira, inocule as amebas de um estoque congelado mantida a-80 ° C em 750 µ l de cultura durante a noite.
   Nota: Use d. discoideum estirpe AX3, que é capaz de crescimento axénica¹⁸. Esta etapa não requer crescimento axénica, mas as etapas subsequentes, terão sua exigência.
4. Imediatamente adicione 700 µ l de amebas -Escherichia coli mistura em um prato de glicose levedura peptona (cigano). Difundir a cultura uniformemente sobre a superfície da placa, inclinando-se e para trás e de lado conforme necessário. Evite o uso de um difusor.
5. Coloque a placa de cigano com agar para cima em uma caixa que mantém a umidade elevada. Use dois recipientes de plástico descartáveis (183 x 183 cm x 91 cm) empilhadas no topo de um ao outro. Encha o recipiente de fundo com cerca de 25 mL de água e coloque o recipiente superior com vários 0,5 cm de diâmetro furos através do revestimento do recipiente para permitir que a umidade mover o reservatório de água para o recipiente superior.
6. Incube a placa de cigano e caixa a 22 ° C por 4-5 dias até ameba esporos são observados crescendo perto da superfície da placa (Figura 2). Use uma incubadora refrigerada para incubar as placas, ao invés de incubação à temperatura ambiente.
   Nota: Depois de esporos têm crescido, eles permanecem viáveis em placas durante várias semanas, quando armazenadas a 4 ° C. Armazene as placas com agar para cima. Após 3-4 dias de incubação, zonas de clareira dentro do gramado bacteriana podem ser observadas, que indicam o início de esporulação de ameba.
   1. Observe as amebas pequenas esporos acima da superfície da placa após 4-5 dias de incubação (Figura 2).
      Nota: Não crescem as amebas por mais de uma semana, como a qualidade dos esporos diminui além deste período de tempo.
7. Colete esporos de amebas para se preparar para o crescimento axénica das amebas varrendo uma ponta da pipeta estéril mL 1 paralela à superfície da placa. Colete os esporos de metade de uma placa de Petri de 10 cm.
   Nota: Evite tocar a superfície da placa de ágar como este movimento irá recolher um grande número de Escherichia coli.
8. Resuspenda as amebas na ponta da pipeta por imergindo a ponta em 1 mL de meio de PS e suavemente pipetagem para cima e para baixo.
9. Transfira a mistura inoculada em um frasco de 250 mL contendo 25 mL do meio de PS, suplementado com a antibiótico antimicótico solução na concentração de x 0,25.
   Nota: Guarde a solução antibiótico antimicótico como 250 alíquotas µ l a-20 ° C. Evite ciclos repetidos de congelamentos e descongelamentos desta solução como isto pode diminuir sua eficácia.
10. Crescem as amebas axenically a 22 ° C, em um agitador rotativo a 100 rpm. Para o ensaio de virulência na etapa 5, desenvolvem-se células para uma densidade óptica medida em 600 nm (OD₆₀₀) de 0,2 a 0,5.
    Nota: Esta etapa exige 3-4 dias de crescimento desde o momento da inoculação (passo 2.7). Se as células têm crescido de uma densidade mais elevada, diluir a cultura no médio e PS uma OD₆₀₀ de 0,05 ou inferior e crescer para uma OD₆₀₀ de 0,2 a 0,5.

3. o crescimento de p. aeruginosa

1. Escolher uma única colônia de p. aeruginosa de uma placa LB, inoculá-lo em um 2 mL PS:DB cultura e crescer durante a noite a 37 ° C, a saturação.
   Nota: Não adicione a solução de antibiótico antimicótico para a mídia PS:DB.
2. Dilua a 1: 100 de cultura durante a noite ou 1:1,000 em um prato de Petri de 6 cm de diâmetro usando PS:DB. Se a virulência das células planctônicas unicamente está sendo analisada, crescem as culturas utilizando tubos de cultura convencional em vez disso. Agite a cultura em rotacao bancada fixado em 100 rpm a 37 ° C.
3. Colheita de culturas em pontos de tempo específico para garantir a reprodutibilidade. A 30 min a 1 h antes de avaliar a virulência, prepare uma almofada de ágar, conforme descrito na seção 4.
   Nota: Virulência em p. aeruginosa é induzida por cerca de 8 h de crescimento em superfícies.
4. Para isolar as células conectado à superfície, retire o prato de Petri o meio líquido, lavar imediatamente com 1 mL de tampão de DB para remover células planctônicas e proceder de imediato à etapa 5.1.
   Atenção: Não lave mais de 30 s como este irá perturbar e desanexar conectado à superfície de células e pode afetar a medição de virulência.
5. Para isolar as células planctônicas, transferir 10 µ l da cultura da caixa de Petri para um prato de Petri limpo e proceder de imediato à etapa 5.1.

4. microscopia - preparação do ágar Pad

1. Prepare-se almofadas de ágar cerca de 30 min a 1 h antes de amebas estão prontas para ser misturado com p. aeruginosa.
2. 50 mL de ágar de 1% (p/v) em tampão de DB em um balão de 250 mL de microondas. Mix cada 20 s até grupos de ágar desaparecer.
3. Legal o ágar fundido, colocando-o num banho de água pré-aquecida a 55 ° C por 15 min.
4. Adicione 15 µ l de solução-mãe calceína-AM a 15 mL de ágar fundido em um tubo cônico. Misture suavemente invertendo o tubo-4 - 5 vezes e dirijam-se para a próxima etapa.
   Nota: Execute esta etapa em um tubo de centrífuga de polipropileno 15 mL. Não utilize um recipiente de vidro grosso como isso fará com que o ágar solidificar demasiado rapidamente.
5. Despeje a mistura de ágar derretido em cima de uma placa de vidro de 12 cm x 10 cm e permitir que o ágar solidificar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Corte o bloco de ágar solidificado em seções menores de 1,5 x 1,5 cm, colocando a placa de vidro sobre uma grade impressa e corte ao longo da grade usando uma régua de metal.
6. Manter o gel hidratado em uma caixa de úmido, até que esteja pronto para uso.

5. microscopia - preparação da amostra bactérias-ameba para a imagem latente

1. Para ensaiar a virulência das células bacterianas conectado à superfície, adicione 10 µ l de células de ameba de passo 2.10 para bactérias conectado à superfície da etapa 3.4.
   Nota: Este passo descreve a mistura de amebas com bactérias.
2. Para ensaiar a virulência das células planctônicas, misture 10 µ l de células de ameba da etapa 2.10 com 10 µ l de bactérias planctônicas da etapa 3.5.
   Nota: Não lave as células cultivadas axenically ameba (em um OD de₆₀₀ de 0,2-0,5) antes de misturar com as bactérias. Não há crescimento de Escherichia coli será observado na cultura ameba devido ao uso da solução de antibiótico antimicótico.
3. Imediatamente, coloque a almofada de ágar de calceína-AM de 1,5 x 1,5 cm da etapa 4.5 em cima a mistura de bactérias-ameba na superfície do prato de Petri.
   Nota: Coloque a almofada de ágar em cima a mistura usando um movimento rápido e suave. Não inferiores a almofada lentamente na mistura como este movimento tende a empurrar as células em direção a periferia e longe da parte de baixo da almofada. Esta etapa irá garantir que as bactérias e as amebas são uniformemente misturado, imobilizada e que os dois tipos de células estão confinados ao mesmo plano.
4. Remova o excesso de líquido pipetando suavemente para fora de qualquer líquido restante em torno do bloco de ágar. Permitir que a placa de Petri secar por 20 min em temperatura ambiente.
5. Cubra com o prato de Petri com uma tampa e incubar a mistura de ameba-bactérias imobilizadas em temperatura ambiente por um adicional 40 min. prosseguir para a etapa 6.1.
   Nota: É importante incubar todas as amostras para a mesma quantidade de tempo, como o plano de fundo da fluorescência aumenta ao longo do tempo. Recomenda-se um tempo de incubação de 1 h. Incubação por mais de 1h é menos reprodutível como células de amebas podem começam a estourar.

6. microscopia - aquisição de imagem

1. Amebas de imagem usando um microscópio de fluorescência, capaz de adquirir imagens de fluorescência brightfield e verde. Para fluorescência verde, use filtros de proteína (GFP) fluorescência verde com 474/27 nm e 525/45 nm de excitação e emissão, respectivamente. Use um objectivo de (≥0.3 abertura numérica) X 10 para as amebas de imagem.
   Nota: O calceína-AM em agar causará amebas morrendo de fluorescência no canal de fluorescência verde. Amebas saudáveis, caso contrário não são fluorescentes.
2. Ajuste os tempos de aquisição para o contraste de fase, canais GFP limitar fototoxicidade e otimizar a gama dinâmica das intensidades da imagem. Se necessário, substitua o contraste de fase de contraste (DIC) de interferência diferencial.
   Nota: Use exposições de 100-200 ms para contraste de fase e fluorescência de GFP, se possível. Manter as configurações de exposição e instrumento inalteradas ao longo de todo o experimento. Isto é crítico para o cálculo do índice de matar o hospedeiro.
3. Adquira imagens pelo menos 100 células de ameba a fim de obter boas estatísticas para calcular o host índice de mortes.

7. análise e índice de mortes de Host de imagem

1. Realizar análise de imagem usando o ImageJ.
2. Abra o arquivo de imagem de contraste de fase em ImageJ clicando no arquivo | Abra e selecionar a imagem. Ajustar o limite clicando na imagem de | Análise | Limiar de. Ajuste o limite superior e inferior para selecionar somente o pico de intensidade(Figura 3).
3. Converter a imagem para binário clicando processo | Binário | Tornar binário. Preencher os buracos, selecionando processo | Binário | Preencher os buracos.
   Nota: Usando a imagem na Figura 1 como a fonte, etapas 7.1-7.2 produzirá uma imagem na qual as amebas e bactérias conectado à superfície aparecem como regiões escuras (Figura 3B).
4. Certifique-se de que as caixas da área e quer dizer valor cinza são verificadas em Analyze | Definir medidas. Medir o tamanho aproximado das amebas, selecionando a ferramenta oval na barra de ferramentas principal. Clique em analisar | Medida e observe a área de amebas representativas.
5. Criar máscaras para as amebas clicando Analyze | Analisar as partículas. Na caixa tamanho, digite a área que irá incluir as amebas mas excluir as bactérias. Selecione máscaras na barra de menus dropdown para a opção de mostrar. Certifique-se de que a caixa Adicionar ao Gerenciador é verificada.
6. Clique Okey e uma imagem mostrando apenas as amibas e um gerente de ROI diálogo aparecerá (Figura 3C).
7. Abra a imagem de fluorescência usando arquivo | Abra e selecionando o arquivo apropriado. Selecione todas as regiões no ROI Manager mantendo pressionada a tecla Shift e clicar em cada região na lista (Figura 3-D).
8. Clique no botão de medida no ROI Manager. Isto irá abrir uma janela de resultados, exibindo o valor de intensidade média de cada ameba.
9. Copiar os valores de fluorescência para cada ameba em um programa de planilha e calcular o host matando o índice, tendo a média de todos os valores de fluorescência.

Representative Results

Nós crescemos selvagem-tipo p. aeruginosa esforçar PA14¹⁹ ou um Δúltima estirpe²⁰ no mesmo fundo PA14 em pratos de Petri 6 cm de diâmetro e analisada a virulência das células planctônicas e conectado à superfície. Culturas foram inoculadas de single-colônias em culturas PS:DB, crescidas durante a noite em tubos de cultura em um tambor de cilindro, a 37 ° C, a saturação, diluído 1: 100 em PS:DB, cultivado para 8 h em pratos de Petri 6 cm de diâmetro a 100 rpm, a tremer e planctônicos e conectado à superfície As subpopulações de p. aeruginosa foram isoladas, conforme descrito na seção 3.

Conectados à superfície selvagem-tipo p. aeruginosa matou as amebas, que foi indicado por uma forma de célula de ameba redondo e a observação da fluorescência de calceína (Figura 4A, painel superior esquerdo). Isto resultou em um índice de mortes de anfitrião alta (Figura 4B). Células planctônicas foram consumidas pelas amebas, que foi indicado por formas de célula ameba amorfo e a observação da fluorescência de calceína pouca ou nenhuma acima de fundo (Figura 4A, canto superior direito do painel). Isto resultou em um índice de mortes de acolhimento relativamente baixa (Figura 4B). Tanto conectado à superfície e células planctônicas da estirpe Δúltima foram consumidas pelas amebas, que foi indicado pelo host baixa matando índices (Figura 4B, painel inferior). Os resultados mostram assim que virulência é upregulated em populações conectado à superfície e a última é necessária para a virulência de superfície está ativado, o que foi descrito anteriormente a¹³. Estas experiências assim estabelecem robustos controles positivos e negativos para experiências futuras.

Figura 1 : Esquema descrevendo uma visão geral do ensaio virulência. (1) células do hospedeiro ameba são cultivadas, culturas (2) bacterianas são cultivadas, e (3) planctônicas ou conectado à superfície de células bacterianas são misturadas com amebas e imobilizadas no mesmo plano de imagem usando um bloco de ágar. Células hospedeiras são quantificadas para saúde usando calceína-AM, microscopia de fluorescência e análise de imagem. Barras de escala representam 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Ameba esporos sobre uma placa de Petri GYP 10 cm-diâmetro após 5 dias de crescimento. Forma de esporos acima da superfície da placa de Petri. A inserção mostra uma visão ampliada de uma única seção da superfície do prato. A superfície pode conter bactérias que não podem ser discernidas a esta resolução. Barras de escala principal e inserir imagens representam 1 cm e 2 mm, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Análise de dados de microscopia usando o ImageJ de imagem. (A) seleção do pico de intensidade usando a ferramenta de limiar. (B) imagem de resultante após a imagem de origem de contraste de fase da Figura 1 é convertida em uma imagem binária. (C) resultando imagem depois que a imagem é posteriormente convertida em uma máscara. (D) Screenshots da seleção de regiões de interesse usando o Gerenciador de ROI. Barras de escala representam 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Resultados representativos de ameba matando por células de p. aeruginosa . (A) fluorescência de calceína-AM sobreposta em imagens de microscopia de fase e (B) anfitrião matando índices conectado à superfície ou planctônicos selvagem-tipo ou Δúltima p. aeruginosa. Conectados à superfície do selvagem-tipo p. aeruginosa mata as amebas, que apresentam fluorescência calceína significativa e, portanto, um significativo host matando o índice. Células planctônicas são consumidas por amebas, que apresentam fluorescência de calceína pouco e produzem um índice de assassinato de baixo anfitrião. Tanto conectado à superfície e planctônicos Δúltima são consumidos por amebas e resultam em um índice de assassinato de baixo anfitrião. Escala barras representam 50 µm. barras indicam a média de três experimentos independentes e erros barras indicam o desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Este protocolo descreve um método rápido e quantitativo para ensaio de virulência em p. aeruginosa. Este protocolo pode ser testado com outras bactérias. No entanto, é importante ter em mente que o meio de crescimento deve ser compatível com as condições de crescimento de ameba. Em particular, otimizamos o protocolo usando PS:DB como meio de crescimento bacteriano. Se forem utilizados outros meios de comunicação, pode ser necessário realizar um controle de somente mídia de crescimento em que não há nenhuma célula bacteriana presente para verificar se o meio é compatível com as amebas.

Esse método pode ser expandido para ensaiar a dependência de fase de crescimento da virulência. Em particular, culturas bacterianas podem ser crescidas para uma ampla gama de vezes em vez de um ponto fixo de tempo. Em nossa experiência, é importante para a colheita de culturas bacterianas em pontos específicos de tempo como virulência em p. aeruginosa parece ser dependente da fase de crescimento. Observamos que a virulência em p. aeruginosa foi induzida entre 6-8 h de crescimento em placas de Petri.

Muitas variáveis associadas ao ambiente de crescimento afetam a saúde do hospedeiro e virulência bacteriana. Assim, é importante usar controles adequados em positivos e negativos para cada experimento. Nós usamos conectado à superfície do selvagem-tipo p. aeruginosa como um positivo controle e Δúltima como controlo negativo. Sugerimos realizar esses controles cada vez que o ensaio de virulência é executado. Esses controles são importantes para verificar que mortes de pilha de anfitrião não são devido a quaisquer fatores externos tais como a idade das amibas, as variações de temperatura, etc. além disso, sugerimos que executar todas as experiências em replicar biológica para estabelecer a reprodutibilidade dos fenótipos de virulência.

Já realizamos nossos experimentos usando amebas na densidade óptica de 0,2-0,5 após uma diluição de no mínimo 01:10 e ter regulado a temperatura da cultura de amebas precisamente a 22 ° C. Fora dessas condições de crescimento, nós encontramos que a susceptibilidade de amebas para bactérias virulentas e a reprodutibilidade do ensaio virulência sejam alteradas. Células de ameba pelota relativamente rapidamente. Certifique-se de que as culturas são resuspended pipetando acima e para baixo, imediatamente antes de feita a medição da densidade óptica. Não crescem as culturas de ameba superiores uma densidade de₆₀₀ OD de 1 como crescimento a altas densidades afeta a reprodutibilidade do experimento. Propaga as culturas axénica para não mais de 1 semana. Além disso, é importante verificar que as amebas são cultivadas axenically (começando na etapa 2.7) através de 20 X ou microscopia de alta magnificação que outros micróbios não estão presentes na cultura. Se as culturas são turvas na etapa 2.10 após 2 dias de crescimento após inoculação inicial, isto provavelmente indica a presença de contaminantes microbianos. Se houver suspeita de contaminação bacteriana, sugerimos que 1 mL da cultura a 37 ° C para 4-8 h as amebas a crescer. A observação de uma cultura turva sob estas condições gostaria de sugerir contaminação bacteriana. Se repetiu a contaminação bacteriana é observada, a antibiótico antimicótico solução deve ser substituída.

O índice de mortes de acolhimento é um indicador fiável de saber se uma população bacteriana é virulenta ou avirulentas. Este ensaio não foi otimizado para comparações entre diferentes níveis intermediários de virulência (i.e., baixa virulência em comparação com a média-baixa virulência) e excesso de interpretação dos resultados deve ser evitada. Métodos possíveis para resolver esse problema são a repetição do ensaio virulência ao longo de vários dias usando diferentes lotes de células hospedeiras para estabelecer a confiança nos resultados, realizando experiências adicionais de replicar e desempenho adequado análises estatísticas.

A multiplicidade de infecção (MOI) de células planctônicas pode ser controlada por normalizar a densidade óptica da cultura bacteriana. No entanto, este ensaio não controla o MOI de células de bactérias conectado à superfície. Temos observado que a densidade de superfície bacteriana aumenta com o tempo. Assim, ajustar o tempo de crescimento na prato de Petri pode resultar em uma mudança correspondente na densidade de superfície. Além disso, a densidade da superfície depende do material da superfície. Células de p. aeruginosa anexar para superfícies poliestireno no ensaio descrito aqui. No entanto, outras superfícies, incluindo vidro, ágar e poliacrilamida também podem ser analisado¹³. A densidade da superfície das populações bacterianas de camada única pode ser medida usando 100 X microscopia de fase de ampliação. Se a superfície densidades são multi-camadas, microscopia confocal pode ser apropriada.

Aqui, descrevemos um método rápido e robusto para medir a virulência bacteriana. Modificando os parâmetros individuais tais como tempos de incubação, o corante fluorescente, a estirpe bacteriana, o tipo de célula do hospedeiro ou mídia de crescimento, esse método pode ser prorrogado para quantificar a virulência em uma ampla gama de organismos e as condições de crescimento.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Bacto agar, dehydrated	BD Difco	214010
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Life Technologies	15240062	Aliquot < 1 mL and store at -20 °C
Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM)	Life Technologies	C34852	Calcein Acetoxymethyl (AM)
Calcium chloride, anhydrous	Sigma-Aldrich	C1016
D-Glucose	Fisher Chemical	D16500	Dextrose
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879
Folic acid	Sigma-Aldrich	F8758
LB-Miller	BD Difco	244620
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Yeast extract	Oxoid	LP0021
Special peptone	Oxoid	LP0072
Potassium hyroxide	Fisher Chemical	P250
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Chemical	S373
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V2876
Strains
Dictyostelium discoideum	Siryaporn lab	Strain AX318
Escherichia coli	Siryaporn lab	Strain B/r17
Pseudomonas aeruginosa	Siryaporn lab	PA14	PA14 strain19
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	Siryaporn lab	AFS20.1	PA14-derived strain20
Supplies
0.22 µm filter	Millipore	SCGPT01RE	For filter sterilization
Conical tube, 15 mL	Corning	352097
Glass storage bottles	Pyrex	13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
Petri dish, 6 cm diameter	Corning	351007	60 x 15 mm polystyrene plates
Petri dish, 10 cm diameter	Fisher	FB0875712	100 x 15 mm polystyrene plates
Plastic containers with lid	Ziploc	2.57E+09	Square 3-cup containers
Glass plates	Bio-Rad	1653308	For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions.
Wooden sticks	Fisher	23-400-102
Equipment
Eclipse Ti-E microscope	Nikon	MEA53100	Microscope setup
10X Plan Fluor Ph1 objective  0.3 NA	Nikon	MRH20101	Microscope setup
Fluorescence excitation source	Lumencor	Sola light engine	Microscope setup
Fluorescence filter set	Semrock	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	Microscope setup
Orca Flash 4.0 V2 Camera	Hamamatsu	77054098	Microscope setup
ImageJ	NIH	v. 1.49	Software for image analysis
MATLAB	Mathworks	R2013	Software for image analysis
Orbital shaker incubator	VWR	89032-092	For growth of bacteria at 37 °C
Platform shaker	Fisher	13-687-700	For growth of amoebae at 22 °C
Spectrophotometer	Biochrom	Ultrospec 10
Undercounter refrigerated incubator	Fisher	97990E	For growth of amoebae at 22 °C
Isotemp waterbath	Fisher	15-462-21Q	For cooling media to 55 °C