Summary
여기 우리는 마우스에서 아드레날린을 분리, 조직, 그들, 섹션 고치고 면역 형광 염색 법을 수행 하는 방법을 제시.
Abstract
면역 형광 형광 색소 활용 된 항 체의 고용으로 조직에 항 원의 검출을 위한 기초가 튼튼한 기술 이며 애플 리 케이 션의 광범위 한 스펙트럼 있다. 항 원의 검출 특성화 및 여러 종류의 세포 식별 수 있습니다. 신장 위에 있는 층의 중간 엽 세포에 의해 캡슐, 부 신 동맥은 다른 embryological 기원과 두 개의 다른 조직, mesonephric 중간 mesoderm 파생 바깥쪽 피 질 고는 신경에 의해 구성 된 내 분 비 기관 크레스트 파생 내부 모 반면 catecholamines (즉, 아드레날린, 더욱)를 생산 하는 부 신 수 질 부 신 피 질 스테로이드를 (즉, mineralocorticoids, 스테로이드 제제, 성 호르몬)를 은닉 한다. 부 신 연구를 수행 하는 동안 그것은 서로 다른 기능을 가진 독특한 세포를 구별할 수 있어야 하는 것이 중요입니다. 여기 우리가 제공 하는 프로토콜 일련의 하 부 신 동맥의 세포 유형 면역 형광 염색 법을 얻기 위해 필요한 일련의 단계를 설명 하는 우리의 실험실에서 개발. 우리는 먼저 마우스 아드레날린의 해 부 현미경 고정, 처리 및 파라핀 조직을 포함 하는 periadrenal 지방 제거에 집중 한다. 우리는 다음 로타리 톰와 함께 조직 블록의 단면을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 최적의 신호를 달성 하기 위하여 일반적인 항 체 바인딩 및 autofluorescence를 최소화 하기 위해 개발 했습니다 아드레날린의 immunofluorescent 얼룩에 대 한 프로토콜 세부.
Introduction
Immunohistochemistry 특정 세포 분자 및 후속 얼룩 기법1활용 된 항 체 검출 하기 위하여 항 체의 사용과 조직 구성 요소를 감지 하는 기술 이다. 이 immunohistochemical 절차 요구 특정 고정 하 고 조직의 특정 항 원에 대 한 자주 실험적으로 결정 되는 처리, 조직 및 항 체 활용2. 고정은 조직과 그대로 세포 및 subcellular 구조와 식 패턴 유지의 "원래" 상태를 유지 하기 위해 중요 합니다. 추가 처리 및 절차를 포함 immunohistochemistry 포함 하는 조직학 연구에 사용 되는 얇은 조각으로 단면 조직 준비 필요 합니다.
Immunostaining 비 또는 형광 탐지를 수행할 수 있습니다. 비 검출 불용 성 컬러 제품으로 수용 성 기질을 변환 하는 효소의 활용을 필요 합니다. 이 효소 항 체 (1 차적인 항 체) 항 원 인식에 활용 될 수 있습니다, 하는 동안 (즉, 이차 항 체) 1 차적인 항 체를 인식 하는 항 체를 더 자주 활용 이다. 이 기술은 이다 매우 중요 한; 효소 반응에서 발생 하는 컬러 제품 photostable 고 영상에 대 한 명시 야 현미경만을 요구 한다. 그러나, 비 immunostaining 않을 수 있습니다 적합 한 공동 지역화, 다른 것의 증 착 마스크를 한 색상의 증 착 이후 두 가지 단백질을 시각화 하려고 할 때. 공동 얼룩의 경우 면역 형광 더 유리한 것을 입증 했다. 면역 형광 검사의 출현은 알 버트 너구리와 동료, 조직 항 원 항 체 fluorescein 표시와 식별 하 고 자외선 빛3sectioned 조직에 그들을 시각화 하는 시스템 개발에 기인 된다. 형광 탐지 여기 후 빛을 방출 하는 fluorophore와 활용 된 항 체를 기반으로 합니다. (또는 작은 오버랩)와 다른 파장에서 배기 가스와 함께 여러 fluorophores 있기 때문에,이 검색 메서드는 여러 단백질의 연구에 이상적입니다.
부 신 동맥은 신장 위에 있는 고 엽 캡슐에 의해 포위 두 embryologically 가지 구성 요소에 의해 특징 이점된 기관 이다. 신경 크레스트에서 파생 된 내부 수 질 catecholamines 아드레날린, 도파민, 더욱, 등을 생성 하는 동안 mesonephric 중간 mesoderm에서 파생 된 외부 부 신 피 질 스테로이드 호르몬을 secretes. 부 신 피 질은 조직학 및 기능적으로 서로 다른 급의 스테로이드 호르몬을 분 비 하는 각 영역 3 동심 지역에서 분할: 외부 zona glomerulosa (zG) 생성 mineralocorticoids 전해질 항상성 조절 및 혈관 내 볼륨; 중간 zona fasciculata (zF), 직접 zG, 아래 은닉 한다 플라스마 포도 당; 증가 에너지 저장소의 동원을 통해 스트레스 응답을 중재 하는 스테로이드 제제를 그리고 내부 zona reticularis (zR), 합성 성 스테로이드 선구자 (즉, dehydroepiandrosterone (DHEAS))4.
Adrenocortical zonation에 일부 유사 종 사이 존재 하는: 예를 들어 생쥐 는 zR 부족. 독특한 출생 후 X 영역 M. 생쥐 의 태아 피 질 acidophilic cytoplasms5작은 지질 가난한 세포 특징의 잔재 이다. X-존 사춘기 남성 쥐과 여성 쥐에 있는 첫 번째 임신 후 사라집니다 또는 점차적으로 썩 어 빠진 안 자란 여성6,7. 또한, 고 tortuosity zG 전시의 두께 표시 종 사이의 변화는 주변 줄기와 조상 세포의 조직에는 zG에 인접 한. 다른 설치류와는 달리 쥐 zG zF 사이 보이는 undifferentiated 영역 (zU) 줄기 세포 영역 및 창시자를 증폭 하는 과도의 영역으로 그 기능을가지고. 여부는 zU 쥐에 유일 하다 또는 단순히 더 눈에 띄게 셀 클러스터 구성 알 수 없는8,9이다.
부 신 피 질 세포 콜레스테롤 에스테 르 모든 스테로이드 호르몬10,11의 선구자 역할을 저장 하는 지질 작은 물방울을 포함 합니다. 기간 "steroidogenesis" 콜레스테롤 통해 steroidogenic 요인 1 (SF1), 누구의 식 steroidogenic 잠재력의 감 적의 활동을 포함 하는 효소 반응의 시리즈에서 스테로이드 호르몬의 생산의 프로세스를 정의 합니다. 아드레날린 선 Sf1 식에서는 피 질12의 셀에만입니다. 흥미로운 연구 결과 steroidogenic 잠재적인13adrenocortical 셀에 생 biotin의 식을 발견. 이 특성 steroidogenic를 구별 하는 것 또한 고용 될 수이 biotin/streptavidin 기반 착 방법, 항 체와 streptavidin, 활용 하 여 내 생 biotin의 탐지 때문에 높은 백그라운드의 원인이 될 수 있다 다른 인구 내에서 부 신, 즉, 내 피, capsular, 모 세포에서에서 세포.
Preganglionic 공감 뉴런에 의해 innervated, 부 신 수 질 피 네 프 린 및 노르 세분화 된 세포질과 basophilic 세포에 의해 특징입니다. 모 셀 catecholamines 산화14후에 갈색 색소를 형성 하는의 높은 콘텐츠로 인해 "chromaffin" 이름이 지정 됩니다. 티로신 hydroxylase (TH)는 효소를 catalyzes 속도 제한 단계 catecholamines 합성 고, 아드레날린 선, 모15에 표시 됩니다.
여기에 우리가 현재 마우스 아드레날린, 파라핀 및 단면, 그리고 면역 형광 검사를 구성 하는 세포 종류를 식별 하기 위해 부 신 섹션에 얼룩을 수행 하는 방법에 대 한 그들의 처리의 격리에 대 한 프로토콜은 부 신 피 질과 수 질 이 프로토콜은 정기적으로 우리의 연구에 사용 하는 여러 항 체와 immunostaining에 대 한 우리의 실험실에서 표준입니다.
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Protocol
모든 방법은 사용 하 고 미시간 대학에서의 관리 동물에 대학 위원회의 원조 아래 제도 승인 된 프로토콜에 따라 수행 했다.
1입니다. 수술을 위한 준비
- 수술 전날에 준비 4 %paraformaldehyde (PFA) 인산 염 (PBS) 버퍼링 /. 냉동된 aliquots의 경우 한 해 동을 4 ° c.에 저장 진행
참고: 4 %PFA 없습니다 이상 48 h에 대 한 안정.
주의: PFA는 독성, 피부와 눈에 접촉 하지 않도록 하 고 적절 한 용기에 처분. - 수술 당일,가 위 및 70% 에탄올 (EtOH)으로 겸 살 균 하 여 수술 도구를 준비 하 고 그들이 말리 면 종이 타월에.
- 1 x PBS와 24-잘 접시 가득 장소 (1 mL/음은 충분 한) 얼음 양동이에.
참고: Adrenals 보관 됩니다이 다 잘 문화 접시에 수술 후.
2. 부 신 해 부
- 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 하는 표준 프로토콜에 따라 마우스를 안락사 죽음 (예: 잘린) 되도록 안락사의 보조 방법이 필요 합니다.
- Isoflurane 과다에 의해 안락사 호흡 중단 때까지 isoflurane 증기로 가득 챔버에 마우스를 놓은 다음, 상공에서 마우스를 제거에 대 한 표면에 누워 하 고 자 궁 경부 전위를 수행 합니다.
참고: 대부분 안락사 방법 조 난 동물 원인과 뇌 하 수 체-부 신 축과 골 수 카 테 콜 아민 출시의 활성화의 혼란 변수를 추가할 수 있습니다 그들은 때문에 스트레스 연구에 적합 하지 않습니다. 이 경우 잘린 채택 제안된 기술입니다.
- Isoflurane 과다에 의해 안락사 호흡 중단 때까지 isoflurane 증기로 가득 챔버에 마우스를 놓은 다음, 상공에서 마우스를 제거에 대 한 표면에 누워 하 고 자 궁 경부 전위를 수행 합니다.
- 부정사 마우스 하다, 복 부와 70%로 옆구리에 절 개 지역 소독 EtOH.
참고: 모피를 면도 하는 것은 불 임 증가 합니다, 하는 동안이 특정 응용 프로그램에 대 한 그것 필요는 없습니다. - 가 위를 사용 하 여 복 부 중간 피부 잘라, 복 막에서 피부를 분리, 컷 주위 피부를 꼬 집 고 당겨 두 반대 방향에 (꼬리 rostral) 하 여 마우스를 deskin. 그럼 후부 왼쪽 및 오른쪽 옆구리에 도달할 때까지 복을 잘라.
- 주변의 지방 조직 주위 murine 아드레날린 선 절단 제거 하 고 1 x PBS로 가득 하 고 얼음에 보관 24 multiwell 격판덮개에.
3. 페리-부 신 지방 제거
- 해 현미경 기본 유리에는 부 신 장소 또는 무대 접시에 배양 접시 광원 위치, 배율 선택 하 고 전체 부의 명확한 보기를 얻으려면 초점을 조정.
참고: 사용 하는 확대는 개인 환경 설정에 따라 달라질 수 있습니다. 총 확대 계획 렌즈 1 X 30 X 줌 3 배, 그리고 접 안 렌즈 10 X 좋은 시야와 전체 동맥을 시각화 수 있습니다. - 신속 하 게는 아드레날린의 탈수를 피하고 두 25 G 바늘, 인접 한 지방 조직을 제거 합니다. 이런 모든 지방이 제거 되기 전에, 이동 부 신 다시 우물에 1-2 분, 1 x PBS를 포함 하 고 지방 제거 프로세스를 계속 진행.
- 2 분 동안 2 x 1 x PBS에 세척.
4. 조직 처리 및 포함
- 4%에서 조직 수정 PFA/PBS 2 h 락 플랫폼에 4 ° C에서.
- 4 제거 %PFA 및 세척 1 x PBS 가진 조직, 4 ° c.에 15 분 각 3 배
주의: PFA 독성 이며 유해 폐기물; 그것은 화학 후드 주의 처리 한다 고 유해 폐기물 컨테이너를 삭제 합니다. - 50%에서 adrenals 품 어 EtOH 2 h 락 플랫폼에 4 ° C에서.
- 품 어 70%에서 adrenals EtOH 2 h의 최소 락 플랫폼에 4 ° C에서.
참고: 경우 하지 조직을 포함에 대 한 처리 절차, adrenals에에서 저장할 수 있습니다 70% EtOH 4 ° c.에 70%에서 장기 저장을 피 EtOH 조직을 최대한 빨리 처리를 진행 하는 더 나은 품질 샘플 생성 합니다. - 부 신 거 즈에 포장 하 고 카세트를 포함 하는 조직에 그것을 포함 하 여 처리 하는 조직에 대 한 준비. 조직 프로세서로 이동 준비까지 70 %EtOH 4 ° C에서 저장소 가득 항아리에 카세트를 넣습니다. 표 1 에 보고 된 프로그램 조직 프로세서에 카세트를 넣고 프로그램을 실행 합니다.
- 65 ° c.에 녹은 파라핀으로 가득 포함 역으로 카세트를 전송 냉각 역 사용할 수 없는 경우 차가운 냉각 트레이 옆 위치.
- 임베딩 몰드 라벨을 카세트를 포함 하는 조직. 집게의 쌍을 사용 하 여, 거 즈를 풀 다 고 포함 금형에서 기지의 중심에 원하는 위치에는 부 신을 부드럽게 장소. 부 신에 녹은 파라핀을 붓으십시오. 필요한 경우, 금형 안에 이동할 수 있습니다 그렇지 않으면 금형에서의 위치를 확보 하는 집게와는 부 신을 잡으십시오.
- 부드럽게 냉각 트레이 포함 금형을 이동 하 고는 파라핀의 경화 될 때까지 기다립니다. 그 후, 단면 촉진, 저장 포함 금형 장소에.
5. 로타리 톰와 단면
- 검사는 톰 깨끗 한 시작 하기 전에, 멀리 모든 폐기 파라핀 잔류물, 칼 (또는 톱날)은 날카롭게 확인, 내부 메커니즘을 기름 그리고 필요 하다 면 블록 홀더를 완전히 철회.
- 현미경 슬라이드의 일련을 레이블 (긍정적으로 위탁 되거나 조직 손실을 방지 하기 위해 코팅 ( 재료의 표참조)), 37 ° C에서 슬라이드 따뜻한 세트에 그들을 배치 하 고 일부 압력가 유형 1 초순 각 슬라이드 위에 분배.
- 섹션 두께 5 µ m에 설정 합니다.
- 톰 블레이드 블레이드 홀더에 삽입, 칼 날의 각도 조절, 블레이드 홀더에 단단히 확보 고 파라핀 블록 및 블록 홀더 클리어런스를 확인 합니다.
- 블록 홀더 그것의 가장 높은 위치를, 만약에 가능 하다 면, 운영 핸들 자물쇠, 파라핀 블록 형에서 제거 가져오고 클램프로 단단히 고정 하는 블록 홀더에 배치. 블록의 직면 하 고 표면으로는 잎의 센터 라인의 각도 약 20 ° 이어야 한다. 필요한 경우, 파라핀 블록 재조정.
주의: 블레이드의 날카로운입니다. - 이전에 잠근 경우 손으로 바퀴를 잠금 해제 및 파라핀 블록의 얼굴은 톰 블레이드 가장자리와 수준까지. 안정적인 리듬과 손으로 바퀴를 회전 합니다. 초기 트리밍은 파라핀을 제거 하 고 노출은 부 신을 수행 합니다.
- 손 바퀴를 선회 계속 하 고는 부 신까지 섹션. 명시 또는 해 부 현미경을 사용 하 여 섹션에서 조직의 존재에 대 한 확인. 잎에서 리본을 분리 하 고 또 한 쌍의 집게의 도움으로 유리 슬라이드에 물에 배치. 배치 하는 리본 표면에, 그것을 신중 하 게, 스트레칭 고 다음 슬라이드에 탑재 유용할 수 있습니다.
- 핫 플레이트에 건조 하는 슬라이드를 하자. 슬라이드 트레이에 그들을 하다 그리고 물이 여전히 존재 하는 경우 하룻밤 이상 37 ° C에서 구워. 일단 건조, 실 온에서 슬라이드 상자에 슬라이드를 저장 합니다.
- 모든 사용된 하는 장비를 치워 하 고 청소는 톰.
6입니다. 면역 형광 검사
- Immunostaining에 대 한 슬라이드를 선택 하 고 슬라이드 홀더에 그들을 배치.
- 뜨거운 접시, 비 커 pH 끓인 2.0에서 0.01 M 구 연산으로 가득 가져. 버퍼의 볼륨 비 커 크기에 따라 고 (일부 증발 해야 고려)을 끓는 동안 슬라이드에 섹션을 취재에 대 한 충분 한 되어야 합니다. 커버 알루미늄 호 일로 비 커.
참고: 항 원 복구를 위한 다른 방법을 제공 ( 토론참조) 있습니다. - Deparaffinize 100% 크 실 렌 2에서에서 슬라이드 5 분 x. 다음 시리즈를 사용 하 여 슬라이드를 rehydrate: 100% EtOH 2 x 5 분, 70% EtOH 2 x 5 분, 5 분 동안 1 초순 입력.
참고: 후에 deparaffinization, 그것은 밖으로 건조 하는 섹션을 못하게 하는 것이 중요: 조직 섹션 항상 덮여 있어야 버퍼 또는 솔루션 프로시저의 끝까지 또는 조직 구조를 손상 될 수 있습니다. - 항 원 검색, 슬라이드 금속 슬라이드 홀더에 놓고 알루미늄 호 일 없이 시트르산 끓는 비 커에 삽입 합니다. 10 분 동안 삶아 보자.
- 핫 플레이트에서 비 커를 제거 하 고 20 분 부 신 섹션은 여전히 버퍼 덮여 있는지 확인에 대 한 멋진 보자.
- 차단 솔루션을 준비 합니다. 경우 대표 결과 대 한 고용 키트 상용 얼룩을 사용 하 여 참조 테이블의 재료, 튜브에서 마우스 Ig 차단 시 약 및 정상 염소 혈 청의 5%의 1 x PBS, 1 방울 (약 45 µ L 같음)의 1.25 mL을 추가. 4 ° C에서 또는 일 하는 동안 얼음에 차단 솔루션을 저장 합니다.
참고: 사용 하는 혈 청 이차 항 체의 호스트 종에 따라 달라 집니다. 여기 염소에서 발생 하는 이차 항 체 사용 되었습니다. 다른 항 체에 대 한 다른 혈 청 농도 필요할 수 있습니다. 경험적으로 여러 농도 테스트 하 여 올바른 혈 청 농도 결정 합니다. - 1 x PBS 및 세척 3 x 10 분 각 부드러운 락와 로커 Coplin jar로 슬라이드를 전송 합니다.
- 습도 챔버는 얼룩을 위한 준비.
- 부드럽게, 한 슬라이드;에서 PBS를 떨쳐 슬라이드 하단 초과 PBS를 제거 보풀 닦아 닦아.
- 소수 성 특성을 가진 슬라이드에 대 한 특별 한 마커를 사용 하 여, 유리 표면 건조 섹션을 잉크 솔루션의 확산을 방지 하는 확인 하 고 각 부 신 섹션을 둘러싼 원을 그립니다. 필요한 경우, 신중 하 게 닦아 건조 표면. 습도 챔버 슬라이드를 놓습니다.
- 50 µ L (또는 섹션을 커버 하기에 충분 한) 플라스틱 신속 하 게 차단 하는 모든 섹션에는 솔루션의. 실 온에서 1 h에 품 어.
참고: 차단 솔루션 볼륨 필요 다를 수 있습니다; 그것은 중요 한 섹션 솔루션 잘 덮여 있다입니다. - 1 x PBS의 7.5 mL와 함께 상용 키트에서 희석제 솔루션을 준비, 단백질의 600 µ L 집중 재고 솔루션 및 5% 정상 염소 혈 청 (또는 어떤 다른 혈 청 농도 차단 솔루션에 사용). 희석제 솔루션 4 ° C에서 또는 일 하는 동안 얼음에 저장 합니다.
- 희석제 솔루션에 적절 한 농도에서 기본 항 체 희석 주 항 체 솔루션을 준비 합니다. 공동 얼룩에 대 한 새로운 튜브에 각 항 체의 약 수를 추가 하 고 부드럽게 혼합 합니다. 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 항 체 및 항 체 솔루션을 놓습니다.
참고: 여기 우리가 고용 토끼에서 안티 SF1 항 체와 마우스에서 안티-TH 항 체. 항 체를 준비 하려면 작업 솔루션 지시 대로 따릅니다.- SF1 작업 솔루션에 대 한 1 개의 관에 추가할 안티 SF1 항 체의 1 µ L 999 µ L 희석제 솔루션 (1.5 µ g/mL의 최종 농도)의. 목 작업 솔루션, 튜브, 희석제 솔루션 (2-6 µ g/mL의 예상된 최종 농도)의 499 µ L에 1 µ L 안티-번째 항 추가.
- SF1 + TH에 대 한 항 체 일 믹스 신선한 튜브, 플라스틱 SF1 작업 솔루션의 250 µ L, TH 작업 솔루션의 250 µ L. 부드럽게 pipetting으로 혼합. 얼음에 저장 합니다.
- Coplin jar 1 x PBS를 포함 하는 슬라이드를 전송 하 고 부드러운 락와 로커에 5 분 동안 3 배를 씻어.
- 장소 슬라이드 다시 PBS, 피 펫에 SF1 + TH 항 체 일 믹스 (또는 다른 1 차적인 항 체 솔루션) 각 섹션에의 과잉을 닦아 후 습도 챔버로 습도 챔버를 닫고 4 ° c.에 그것을 떠나 하룻밤
- 다음 날에는 Coplin에 슬라이드 1 x PBS 포함 된 jar와 부드러운 락와 로커에 15 분 동안 3 배 세척을 이동 합니다.
- 슬라이드를 세척 하는 동안 적절 한 농도 사용 하 여 희석제 솔루션에서 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다. 얼룩이 공동 수행, 새로운 관에 각 이차 항 체 솔루션의 동일한 금액을 추가 합니다. 부드럽게 pipetting으로 혼합. 얼음에 저장 합니다. 빛에서 튜브를 보호 하 고 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 저장.
참고: 여기, 사용 하는 2 차 항 체는 488 nm 형광 염료 표시 반대로 마우스에서 염소와 549 형광 염료 표시 방지 토끼 염소에서 발생. 이차 항 체 해결책 희석제 솔루션 (1.2 µ g/mL의 최종 농도)의 799 µ L에 각 이차 항 체의 0.5 µ L을 추가 하 여 준비 되었다. - 슬라이드 습도 챔버에 다시 PBS의 과잉을 제거 후, 신속 하 게 플라스틱 부 신 섹션에 이차 항 체 솔루션, 습도 챔버를 닫고 놓고 빛 으로부터 보호 합니다. 실 온에서 1 h에 품 어.
- 1 x PBS와 Coplin jar에 슬라이드를 세척 하 고 부드러운 락와 로커에 15 분 동안 3 배를 세척 하 여 빛에서 그들을 보호 하.
- 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 솔루션 핵 얼룩을 위한 준비: 1 x PBS의 1 mL에 DAPI (20 mg/mL)의 1 µ L.
참고: 블루-형광 핵 counterstain 또한 얻을 수 있습니다 Hoechst 염료를 사용 하 여. - 플라스틱 부 신 섹션에 DAPI 솔루션, 빛에서 커버 하 고 7 분 동안 실 온에서 품 어.
- 1 x PBS와 Coplin jar에 슬라이드를 세척 하 고 빛에서 슬라이드를 보호 하면서 부드러운 락와 로커에 3 x 5 분 동안 세척.
- 직접 빛 으로부터 차폐 된 지역에서 누워 커버 유리 그리고 플라스틱 60 µ L 또는 커버 유리의 표면에 따라 면역 형광 적합 장착 에이전트의 약 3 방울.
- 부드럽게 보풀 지우기, 슬라이드 커버 유리를 향해 직면 하 고 그래서 조직 단면도 그것에 장착 에이전트와 함께 커버 유리 얼굴, 병렬 위치와 슬라이드의 뒷면을 닦으십시오. 가볍게 커버 유리에 슬라이드를 누르고 아무 공기 방울이 슬라이드 및 덮개 유리 사이 갇혀입니다 있는지 확인 하십시오.
- 필요한 경우, 추가 압력 공기 방울 및 장착 에이전트의 초과 제거 하려면 적용 됩니다.
- 어두운 컨테이너와 치료 24 시간 (또는 사용 장착 에이전트의 정보 시트에 표시 된)의 최소 실 온에서 슬라이드를 내려 놓 아 라 하 고 영상 진행.
7입니다. 영상
참고: 카메라에 연결 된 형광 현미경은 감지 하 고 결정된 파장에서 여기 후 조직에 의해 방출 하는 형광을 캡처에 대 한 필요 합니다. 분명, 하는 동안 보조를 선택 하는 기억 항 체 활용 된 형광으로 누구의 여기 및 방출 스펙트럼은 사용할 수 있는 장비와 호환 중요 하다. 영상 설정 현미경 및 이미지를 캡처에 사용 되는 소프트웨어에 따라 다릅니다. 부 신 섹션 이미징에 대 한 적용 되는 몇 가지 기본적인 규칙 있다, 확인 하는 노출 시간, 같은 카메라 이득 설정, 그리고 광원 강도 일정 하 게 유지 됩니다.
- 광원 및 카메라, 제조업체의 지시 사항에 따라 이미징 소프트웨어를 시작 합니다.
참고: 이러한 작업의 순서는 사용 하는 장비에 따라 달라질 수 있습니다. - 무대에서 슬라이드를 확보, 셔터를 열고 현미경 접 안경으로 보고를 사용 하 여 핵 얼룩 (DAPI) 채널 및 낮은 배율 (X 4) 슬라이드에 조직을 식별: 부 신 섹션은 작은, 그리고 그들의 시각화는 시간이 좀 필요할 수 있습니다.
- 초점, 더 높은 확대 (10 배)를 변경 하 고 셔터를 닫습니다.
참고: photobleaching, 신호의 손실을 일으킬 수 있는 빛에서 불필요 하 게 긴 폭발을 피하기 위해 중요 하다. - 소프트웨어 명령을 사용 하 여, 사용 (DAPI) 목표 (10 배)와 채널을 선택, 노출 시간을 조정 (1 s, 신호가 너무 강 하거나 약한 경우 조정 될 수 있다). 사용 가능한 경우 설정 라이브 이미징 (안 인수) binning 얻으려면' 2 X 2' 변환 '중간', ' 20 mhz 판독 속도'. 사용 하는 소프트웨어는 영상의 끝에 눈금 막대를 표시 되지 않는 경우 메뉴에서 눈금 막대 옵션을 선택 하 고 바 위치 필요한.
- 셔터를 열고, 다시 필요한 경우, 초점을 조정 하 고 채널 (FITC, TRITC, DAPI) 전환. 현미경 자동화 되지 무대를 이동 하지 않고 각 채널에는 부 신의 사진의 찍을 하 고 사용에서 채널의 선택 영역을 조정할 수 있는지 확인 하십시오. 셔터 한 번 완료를 닫습니다.
참고: 자동으로 소프트웨어를 저장 하지 않는 경우 고용 설정을 적어 둡니다. - 그림을 저장 합니다.
참고: 병합 된 사진은 만들 수 있습니다 종종 현미경의 소프트웨어 또는 기타 그래픽 편집기 소프트웨어 패키지를 사용 하 여. - 섹션의 또는 더 높은 확대와 함께 다른 지역에 대 한 이미지를 반복 합니다.
참고: 20 배 확대 종종 짧은 노출 시간을 (즉, 800 ms) 필요합니다. - 영상의 끝에, 적절 한 순서로 모든 장비를 차단.
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Representative Results
그림 1 은 위에서 설명한 전체 프로토콜의 회로도를 나타냅니다. 아드레날린은 쥐에서 수확, 인접 한 지방 조직 해 현미경으로 제거 되 고는 부 신 다음 4% 고정 PFA. 이 단계 후 adrenals 파라핀에 포함 된 고 기관 현미경 슬라이드에 예금 된 얇은 조각으로 잘라 톰으로 구분 처리 됩니다. 섹션의 건조, 면역 형광 검사 수행 섹션 현미경에서 이미지를 만든 후에.
(그림 2A) 인접 한 지방의 제거는 추가 처리 및 부 신 땀 샘의 구분을 용이 하 게 중요 합니다. 주변의 지방 조직의 성공적인 제거는 그림 2B는 부 신 쉽게 감지 하 고 아무 여분의 지방을 표시 됩니다에 표시 됩니다. 그러나이 단계 동안에 그것은 중요 한,, 아드레날린 선 건조 또는이 못하게 수 손상 조직 구조. 부 신 가정 중 늙은이 모습 (그림 2C) 건조 인식할 때. 지방 제거를 계속 하기 전에 1 x PBS에 부 신 재 하 여이 문제를 쉽게 극복할 수 있습니다.
최종 결과 얻은 다음이이 프로토콜은 그림 3에 표시 됩니다. 면역 형광 이미지는 아드레날린 선 두 개의 서로 다른 배율에서의 immunostaining를 보여 줍니다. 반면 모 수의 셀을 레이블 세포질 녹색 얼룩 adrenocortical 셀 라벨 레드 핵 SF1 얼룩. 외부 캡슐 steroidogenic (SF1-부정) 이후 파란색 (DAPI) 핵 얼룩에 의해 표시 됩니다.
그림 1 : 프로토콜의 도식 대표. 아드레날린을 수확 후 인접 한 지방 조직 제거, 조직에서에서 수정 된 4 %PFA, 파라핀 포함, 처리 하 고 구분. 섹션은 다음 immunostained 그리고 형광 현미경 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Peri-부 신 지방의 제거. (A) 지방을 둘러싼 부 신 동맥 해 부 현미경 아래에서 제거 됩니다. (B) 아드레날린 선 정리 후. 최대 건조 하는 조직 및 그의 (C) 예 수 분을 필요 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 부 신 동맥의 면역 형광 영상. 부 신 피 질의 마커 부 신 동맥의 (다른 배율)에서 면역 형광 이미징의 예 물 (SF1, 핵 얼룩)과 부 신 수 질 (TH, 세포질 녹색). 핵 (DAPI)은 파란색으로 표시 됩니다. C: 캡슐; CO: 피 질; m: 모입니다. 스케일 바 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 시 약 | 역 | 온도 | 기간 |
| 70 %EtOH | 1 | RT | 1 h |
| 90 %EtOH | 2 | RT | 1 h |
| 90 %EtOH | 3 | RT | 1 h |
| 절대 EtOH | 4 | RT | 1 h |
| 절대 EtOH | 5 | RT | 1 h |
| 절대 EtOH | 6 | RT | 1 h |
| 절대 EtOH | 7 | RT | 1 h |
| 크 실 렌 | 8 | RT | 1 h |
| 크 실 렌 | 9 | RT | 1 h |
| 크 실 렌 | 10 | RT | 1 h |
| 파라핀 왁 스 | 11 | 62 ° C | 1 h |
| 파라핀 왁 스 | 12 | 62 ° C | 1 h |
| 파라핀 왁 스 | 13 | 62 ° C | 1 h |
표 1: 조직 프로세서 프로그램.
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Discussion
이 프로토콜 준비 함께 마우스 아드레날린의 고립과 sectioned 파라핀 끼워 넣어진 마우스 adrenals의 얼룩이 지는 방법을 설명 합니다.
우리가 테스트 하는 다른 프로토콜에 비교해,이 면역 형광 검사 프로토콜 우리의 실험실에서 사용 하는 항 체의 대부분을 위해 적당 한 입증 했다. 그러나, 특정 경우에 그것은 얼룩 결과 개선 하기 위해 일부 조정 해야 합니다. 하나의 변수를 쉽게 수정할 수 있고 테스트 고정 길이입니다. 우리 연구소에서 4%에서 부 화 PFA 변화할 수 있다 1 h에서 4 h, 다른 실험실에서 고정 시간이 12-24 h16에 확장 하는 동안. 그러나 우리의 손에서, 긴 고정 시간 증가 배경 잡음을 주도 하 고 정기적으로 우리의 연구에 사용 하는 여러 항 체에 대 한 최적의 없었다.
항 원 복구의 pH 또한 얼룩의 성공에 있는 역할을 재생할 수 있습니다. 열 유도 epitope 검색 (여기) ph 시트르산 (pH 6), ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA, pH 8), 산 성 알칼리 성, 뿐만 아니라 다른 사내 만든된 버퍼에서 트리 스-EDTA에 이르기까지 상용 솔루션을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. (pH 9), 트라이앵글 (pH 10). 효소 치료는 항이 면을 벗기기에 대 한 옵션을 수도 있습니다. 효소 (예: K 성분)의 적절 한 농도 포함 하는 솔루션으로 제한 된 시간에 대 한 deparaffinized 슬라이드 배양 하는 것은 여기에 다른 방법 될 수 있습니다. 그러나 그것은,, 필수적인 효소 농도 적정 하 고 오버 소화 조직의17를 저하 시킬 수 있습니다 이후 이상적인 보육 시간을 결정 하.
블로킹 버퍼의 선택 문제 해결에 대 한 또 다른 변수 이기도합니다. 정상 염소 혈 청이이 프로토콜 (생 마우스 IgG 인해 높은 백그라운드를 방지 하기 위해 마우스 조직에 기본 마우스 항 체를 사용 하는 경우이 인스턴스의 편리)에 언급 된 상용 블로킹 버퍼의 사용, 외 단백질 솔루션 (소 혈 청 알 부 민 (BSA) 또는 건조 우유) 또는 다른 상업적으로 이용 가능한 버퍼와 같은 추가 옵션. 버퍼는 얼룩, biotin 메서드를 기반으로 biotin streptavidin를 사용 하 여 때 같은 방해할 수 있는 물질을 포함 하지 않는 다는 것을 확인 하기 긴요 하다.
아드레날린 선 종종 immunostaining을는 지질의 높은 autofluorescence 때문에 도전 할 수 있는 높은 지질 내용을 특징 하는 내 분 비 기관 이다. 또한, 쥐 및 쥐에서 부 신 외피가 autofluorescent intracytoplasmic lipofuscin, 노란색에서 갈색에 색깔에서 범위 안료 세밀 하 고 비정 질 재료 풍부 합니다. 이 문제를 해결 하려면 화합물 수단 블랙 B (SBB) 같은 lipofuscins18에 의해 생성 된 형광을 끄다 수 있습니다. 좋은 착 색의 결과 타협 하는 또 다른 요인은 혈액 세포의 존재 이다. 파장의 빛을 흡수 하는 색소는 적혈구에 < 600 nm와 수는 그 파장19,20형광 방해. 관류 기법 조직 혈관에서 혈액 세포를 사용할 수 있습니다, 하는 동안 핵 counterstaining를 수행 하기 전에 pH 5에서 10 mM 구리 황산 염의 사용 수 또한 원치 않는 형광21억제에 도움이 됩니다.
이 프로토콜에서 중요 한 단계는 부 신 해 부 이다. 아드레날린 선 위치에서 제자리를찾을 어려울 수 있습니다 장기입니다: 마우스, 동맥은 작은 하 고 그들의 위치는 다소 변수. 더 오래 된 동물에서 특히 adrenals 또한 프로토콜의이 단계 동안 지역의 명확한 보기는 결정적 이다 이런 이유로 동맥 및 그들의 필연적인 절연의 검출을 방해할 수 있습니다 지방 조직에 의해 포위 된다. 요정-부 신 지방 제거의 제거는 섬세 한 단계입니다. 특히 관심을 캡슐 파열 지방을 분리 하는 동안는 adrenals에 지불 합니다. 선 또한 유지 되어야 한다 PBS와 촉촉한 조직 손상을 방지 하려면 절차 동안.
단면 때 섹션에서 부 신 조직의 작은 부분의 존재를 감지 전하실 수 있습니다 때문에 조직 hypopigmentation 처리 단계 후. 현미경은 안목 왁 스에서 조직 단면 중 매우 도움이 됩니다.
Immunostaining 파라핀 포함 된 섹션에는 조직의 형태를 유지 하면서 관심의 immunolabeling 단백질에 대 한 귀중 한 기술입니다. 형광 검출 시 여기에 제시 된 방법 기반 하 고, 특히 여러 기본 항 체를 사용 하는 연구 기능, 형광 신호는 빛에 민감한 및 수 있습니다 쉽게 분실 또는 약화 슬라이드 처리 되지 않을 경우 올바르게 (즉, 가벼운 현미경에 노출 또는 주변광을 불필요 한 노출 연장). 또한, 우리는 시간이 지남에 형광 신호 자체의 품질의 하락을 주의할 수 있다. 이 문제는 photostable 이며 몇 년 동안 구상 될 수 있다 비 탐지를 사용 하 여 피할 수 있습니다. 그러나이 메서드는, 형광 검출, 높은 정밀도 라벨에 대 한 연구에서 여러 가지 단백질의 동시 라벨 등의 장점을 부족 합니다.
파라핀 포함 처리 하 고 여러 조직 샘플을 저장 하는 편리한 방법입니다. 그러나, 조직 자체를 포함 하는 파라핀에 대 한 처리 형광 기자 endogenously 기자를 대상으로 하는 특정 항 체를 사용 하지 않고 일부 유전자 변형 동물 표시의 이미징 위해 적당 하다. Cryopreservation 형광 단백질의 저하를 방지 하 고 현미경의 직접 시각화를 허용 하는 방법입니다. 여분의 항 체의 사용을 피하고 이점을 나타낼 수 있습니다. 다른 한편으로, cryopreservation 수 있습니다 또한 수 제한 때문에 영향을 미치는 조직 형태학; 그것은 또한, 단면에 대 한 다른 장비 필요 그리고만 냉동 고에 슬라이드와 조직 블록의 저장 가능 합니다.
Sectioned 조직 이미징의 한 가지 주요 한계 구조 구성 요소 높은 공간 해상도 이미지를 기능입니다. 조직 구성, 사실, 가벼운 침투에 영향 때문에 가난한 해상도를 발생할 수 있습니다는 영상의 품질을 결정 주요 변수입니다. 아드레날린 선22를 산란 하는 빛을 일으키는 원인이 되는 지질이 풍부한 조직입니다. 높은 지질 함량이 또한, 두뇌에서 선명도, BABB, iDISCO, 3DISCO 조직 개간 기술이 조직 시각화, 더 나은 영상 및 3 차원 조직 재구성23허용을 개선 하기 위해 개발 되었습니다. 이 기술은 연구원 고품질 영상 데이터를 제공 하는 조직의 다양 한 범위에 적응 되는 그리고, 미래에 부 신 이미징을 위한 이러한 방법을 채택 하겠습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 그의 도움이 제안 및 기술 지원이이 프로토콜의 설립에 대 한 닥터 모하마드 Zubair 감사합니다. 이 작품은 국립 연구소의 당뇨병과 소화와 신장 질병, 건강 연구 그랜트의 국가 학회 2R01-DK062027 (G.D.H)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25 G x 5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated, 22 mm square top tapered to 12 mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3" x 3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4 inch x 8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22 x 50 x 1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20 mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | American Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
References
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