Summary
Här presenterar vi en metod för att isolera binjurarna från möss, fixa vävnader, avsnitt dem och utföra immunofluorescens färgning.
Abstract
Immunofluorescens är en väl etablerad teknik för detektion av antigen i vävnader med anställning av fluorokrom-konjugerade antikroppar och har ett brett spektrum av applikationer. Påvisande av antigen tillåter för karakterisering och identifiering av flera celltyper. Ovanför njurarna och inkapslade av ett lager av mesenkymala celler, är binjuren ett endokrina organ som består av två olika vävnader med olika embryologiska ursprung, mesonephric intermediate mesoderm-derived yttre cortex och den neurala Crest-derived inre medulla. Binjurebarken utsöndrar steroider (dvs mineralkortikoider, glukokortikoider, könshormoner), medan binjuremärgen producerar katekolaminer (dvs, adrenalin, noradrenalin). Samtidigt bedriva adrenal forskning, är det viktigt att kunna skilja mellan unika celler med olika funktioner. Här tillhandahåller vi ett protokoll som utvecklats i vårt laboratorium som beskriver en serie sekventiella steg krävs för att få immunofluorescens färgning att karakterisera celltyper i binjuren. Vi fokuserar först på dissektion av mus binjurarna, mikroskopiska borttagande av periadrenal fett följt av fixering, bearbetning och paraffin inbäddning av vävnad. Sedan beskriver vi snittning av vävnad blocken med en roterande mikrotom. Slutligen, detalj vi ett protokoll för Immunofluorescerande färgning av binjurarna som vi har utvecklat för att minimera både icke-specifik antikropp bindande och autofluorescens för att uppnå en optimal signal.
Introduction
Immunhistokemi är en teknik för att upptäcka vävnad komponenter med hjälp av antikroppar mot specifika cellulära molekyler och efterföljande färgning tekniker för att upptäcka den konjugera antikroppar1. Proceduren immunhistokemisk kräver specifika fixering och bearbetning av vävnader som bestäms ofta empiriskt för specifika antigenet, vävnad och antikropp används2. Fixering är avgörande för att bevara det ”ursprungliga” tillståndet för vävnaden och därigenom bibehålla intakt cellulär och subcellulär strukturer och uttrycksmönster. Ytterligare krävs bearbetning och inbäddning förfaranden för att förbereda vävnaden för snittning i tunna skivor som används för histologiska studier med immunhistokemi.
Immunfärgning kan utföras med antingen kromogen eller fluorescerande upptäckt. Kromogen upptäckt kräver utnyttjandet av ett enzym att konvertera ett lösligt substrat i en olöslig färgade produkt. Medan detta enzym kan vara konjugerat med den antikropp som känner igen antigenet (primär antikropp), är det mer ofta konjugerat till antikroppen erkänner den primär antikroppen (dvs, den sekundära antikroppen). Denna teknik är mycket känsliga; färgade orsakats av den enzymatiska reaktionen är fotostabil och kräver endast ett brightfield Mikroskop för avbildning. Kromogen immunfärgning kan dock inte lämplig när man försöker visualisera två proteiner som tillsammans lokaliserar, eftersom nedfall av en färg kan maskera nedfall av annan. När det gäller samtidig färgning, har immunofluorescens visat sig vara mer fördelaktiga. Tillkomsten av immunofluorescens tillskrivs Albert Coons och kollegor, som utvecklat ett system för att identifiera vävnad antigener med antikroppar märkta med fluorescein och visualisera dem i sektionerad vävnader under ultraviolett ljus3. Fluorescens upptäckt är baserad på en antikropp konjugerat med en fluorophore som avger ljus efter magnetisering. Eftersom det finns flera fluorophores med utsläpp vid olika våglängder (med ingen eller liten överlappning), är denna detektionsmetod idealisk för studier av flera proteiner.
Binjuren är en Parade organ sitter ovanför njurarna och kännetecknas av två embryologically distinkta komponenter omgiven av en mesenkymala kapsel. Yttre binjurebarken, härrör från mesonephric intermediate mesoderm, utsöndrar steroidhormoner medan inre medulla, härrör från neural crest, producerar katekolaminer inklusive adrenalin, noradrenalin och dopamin. Binjurebarken är histologiskt och funktionellt uppdelad i tre koncentriska zoner, med varje zon som utsöndrar olika klasser av steroidhormoner: den yttre zona glomerulosa (zG) tillverkar mineralkortikoider som reglerar elektrolyter homeostas och intravaskulär volym; den mellersta zona fasciculata, zF, utsöndrar direkt under zG, glukokortikoider som medlar stress svar genom mobilisering av energidiversehandel att öka plasmaglukos; och de inre zona reticularis (zR), som syntetiserar kön steroid prekursorer (dvs dehydroepiandrosteron (DHEAS))4.
Viss variation i adrenokortikal Colouir finns mellan arter: exempelvis Mus musculus saknar zR. Unik födsel X-zonen av M. musculus är en kvarleva av fostrets cortex kännetecknas av små lipid-fattiga celler med acidofiler cytoplasms5. X-zonen försvinner vid puberteten hos hanmöss och efter den första graviditeten hos honmöss, eller urartar gradvis i inte-uppfödda honor6,7. Dessutom märkt den tortuosity och tjocklek av zG utställningsföremålen variation mellan arter som gör organisationen av perifera stamceller och stamceller celler i och intill zG. Råtta, till skillnad från andra gnagare, har en synlig odifferentierade zon (zU) mellan zG och zF som fungerar som en stamcell zon eller en zon av övergående förstärkande stamfäder. Huruvida zU är unik för råttor eller helt enkelt en mer tydligt organiserade kluster av celler är okänd8,9.
Celler i binjurebarken innehåller lipid droppar som lagra kolesterol estrar som fungerar som föregångare till alla steroidhormoner10,11. Termen ”Steroidsyntes” definierar processen för produktion av steroidhormoner från kolesterol via en serie enzymatiska reaktioner som involverar aktiviteten av steroidogena faktor 1 (SF1), vars uttryck är en markör för steroidogena potential. I binjuren förekommer Sf1 uttryck endast i celler i cortex12. En intressant studie hittade uttrycket av endogena biotin i adrenokortikal celler med steroidogena potentiella13. Medan detta kan vara orsaken till en högre bakgrund i biotin/streptividin-baserade färgning metoder, på grund av upptäckten av endogena biotin av antikropp konjugerat med streptividin, kunde detta kännetecken också användas för att skilja de steroidogena celler från andra populationer inom binjuren, dvs endothelial, kapsulära och märgen celler.
Binjuremärgen är innerveras av sympatiska preganglionära nervceller, och kännetecknas av basofila celler med ett granulat cytoplasman innehåller adrenalin och noradrenalin. Märgen celler namnges ”chromaffin” på grund av det höga innehållet av katekolaminer som bildar ett brunt pigment efter oxidation14. Tyrosin hydroxylas (TH) är det enzym som katalyserar det hastighetsbegränsande steget i syntesen av katekolaminer och i binjuren, uttrycks endast i medulla15.
Här presenterar vi ett protokoll för isolering av mus binjurarna, deras bearbetning för ingjutning i paraffin och snittning, och en metod att utföra immunofluorescens färgning på adrenal sektioner för att identifiera cellulära typer som utgör den adrenal cortex och medulla. Detta protokoll är en standard i vårt laboratorium för immunfärgning med flera antikroppar som rutinmässigt används i vår forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder har utförts i enlighet med institutionellt godkända protokoll under auspicen av universitet utskottet för användning och skötsel av djur vid University of Michigan.
1. förberedelser inför kirurgi
- Dagen före operationen, förbereda 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) / fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Händelse av frysta portioner, Fortsätt att Tina en och förvaras vid 4 ° C.
Obs: 4% PFA är inte stabila i mer än 48 h.
FÖRSIKTIGHET: PFA är giftiga, Undvik kontakt med hud och ögon och kasta i en lämplig behållare. - Samma dag som operationen, förbereda de kirurgiska instrument genom sterilisering av sax och pincett med 70% etanol (EtOH) och låt dem torka på ett hushållspapper.
- Plats en 24-väl tallrik fylld med 1 x PBS (1 mL per brunn räcker) i en ishink.
Obs: Binjurar kommer att hållas i denna multi väl kultur maträtt efter operation.
2. adrenal dissektion
- Avliva musen efter standardprotokoll som godkänts av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC). Det krävs en sekundär metod för eutanasi att säkerställa död (till exempel halshuggning).
- För eutanasi av isofluran överdos, Placera musen i en kammare fylld med isofluran ångor tills andning upphör, ta sedan bort musen från kammaren, Lägg det på en yta och utföra cervikal dislokation.
Obs: De flesta dödshjälp metoder orsaka lidande för djuret och är inte lämpliga för stress studier eftersom de kan lägga till variabeln confounding av aktivering av hypofys-binjure axeln och medullär katekolamin release. I detta fall är halshuggning den föreslagna tekniken att anta.
- För eutanasi av isofluran överdos, Placera musen i en kammare fylld med isofluran ångor tills andning upphör, ta sedan bort musen från kammaren, Lägg det på en yta och utföra cervikal dislokation.
- Låg liggande musen, sterilisera området snitt på buken och flankerna med 70% EtOH.
Obs: Medan rakning päls kommer att öka sterilitet, för det aktuella programmet det är inte nödvändigt. - Skära huden i mitten av buken med sax, separera huden från bukhinnan, deskin musen genom att nypa huden runt snittet och dra det i två motsatta riktningar (kaudala och rostralt). Sedan skär bukhinnan tills de når de bakre vänstra och högra flankerna.
- Ta bort murina binjuren skärning runt omgivande fettvävnaden och placera den i den 24-multiwell plate fylld med 1 x PBS och förvaras på is.
3. Peri-binjure fettborttagning
- I dissekera Mikroskop, placera binjure på ett glas bas eller en petriskål på scenen plattan, placera ljuskällan, Välj förstoring och justera fokus för att få en klar bild av det hela binjure.
Obs: Den förstoring som används kan variera beroende på personliga preferenser. En total förstoring 30 X med en plan lins 1 X, zoom 3 X och okular 10 X gör det möjligt för att visualisera hela körteln med en bra synfält. - Snabbt ta bort intilliggande fettvävnader med två 25 G injektionsnålar, undvika uttorkning av binjure. Om detta händer innan allt fett tas bort, flytta binjurarna tillbaka i brunnen som innehåller 1 x PBS för 1 – 2 min och sedan fortsätta med borttagningen av fett.
- Tvätta 2 x 2 min varje i 1 x PBS.
4. vävnad behandling och inbäddning
- Fixa vävnader i 4% PFA/PBS vid 4 ° C på en gungande plattform för 2 h.
- Ta bort 4% PFA och tvätta vävnader med 1 x PBS, 3 x 15 min varje vid 4 ° C.
FÖRSIKTIGHET: PFA är giftigt och farligt avfall; Det bör hanteras med försiktighet under en kemisk huva och omhändertas i en behållare för farligt avfall. - Inkubera i binjurarna i 50% EtOH vid 4 ° C på en gungande plattform för 2 h.
- Inkubera i binjurarna i 70% EtOH vid 4 ° C på en gungande plattform för minst 2 h.
Obs: Om inte fortsätter med vävnad behandling för inbäddning, binjurar kan lagras i 70% EtOH vid 4 ° C. Att undvika långtidslagring i 70% ger EtOH och fortsätter till vävnad behandling så snart som möjligt bättre kvalitet prover. - Förbereda adrenal vävnad behandling genom att linda den i gasbinda och bifoga det i en vävnad inbäddning kassett. Placera kassetten i en burk fylld med 70% EtOH och förvaras vid 4 ° C tills de ska flytta till vävnad processorn. Sätt in kassetten i vävnad processorn programmeras som redovisas i tabell 1 och kör programmet.
- Överföra kassett i en inbäddning station fyllas med smält paraffin på 65 ° C. Om det inte finns en kylande station, placera en kall kyla fack bredvid den.
- Märka en inbäddning mögel och öppna vävnaden inbäddning kassett. Använder ett par pincett, packa upp gasväv och placera adrenal försiktigt i önskad position i mitten av basen i inbäddning mögel. Häll smält paraffinet på binjure. Om det behövs håller du binjurarna med pincett att säkra sin position i formen annars det kan flytta runt inuti formen.
- Försiktigt flytta inbäddning mögel att kyla facket och vänta tills härdning av paraffinet. Efter det, för att underlätta snittning, lagra inbäddning formarna svalt.
5. snittning med en roterande mikrotom
- Kontrollera att mikrotomen är rent innan du börjar, borsta bort alla kasserade paraffin rester, se till att kniven (eller blad) slipas, olja inre mekanism och fullt tillbaka hållaren block vid behov.
- Märka en serie av objektglas (positivt laddat eller belagda förhindra förlust av vävnad (se Tabell för material)), Lägg dem på en varmare bildspelsgrupp vid 37 ° C och fördela vissa Ånghärdad typ 1 ultrarent vatten ovanpå varje bild.
- Ställ in snittjocklek på 5 µm.
- Sätt i mikrotomen bladet i bladhållaren, kontrollera vinkeln på bladet, att bladet är ordentligt säkrad i hållaren och kontrollera clearance av den paraffin-block och block hållare.
- Ta block innehavaren till sin högsta position och, om möjligt, låsa operativa handtaget, bort paraffin blocket från mögel och placera den i block hållaren säkra den ordentligt med klämman. Vinkel av centrera fodrar av bladet med motstående ytan av blocket bör vara ca 20°. Om nödvändigt, justera paraffin blocket.
FÖRSIKTIGHET: Bladet är vasst. - Om tidigare låst lås inställningsratten och lägre paraffin blocket tills dess ansikte är nivå med kanten av mikrotomen bladet. Vrid handhjulet med en stadig rytm. Utföra inledande trimning till ta bort paraffinet och till exponera binjure.
- Hålla vrida inställningsratten, och avsnitt till slutet av binjure. Använda en brightfield eller dissekera Mikroskop för att kontrollera förekomsten av vävnad i avsnitten. Lossa menyfliken från bladet och med hjälp av ett annat par pincett placera den på vattnet på en glasskiva. Det kan vara bra att placera i menyfliksområdet på en yta, sträcka ut den försiktigt och sedan montera den på bilden.
- Låt glasen torka på värmeplattan. Sedan lägga dem platt på en bild bricka och baka vid 37 ° C över natten eller längre om vattnet är kvar. När torr, lagra bilder i en bild box vid rumstemperatur.
- Lägga undan alla den begagnade utrustningen och rengör mikrotomen.
6. immunofluorescens
- Markera bilderna för immunfärgning och placera dem i en hållare.
- På en värmeplatta, föra en bägare fylld med 0,01 M citrat vid pH 2,0 koka. Volymen av bufferten beror på storleken bägare och måste vara tillräckligt för att täcka avsnitten på bilderna under kokning (vissa avdunstning måste beaktas). Täck bägaren med aluminiumfolie.
Obs: Andra metoder för hämtning av antigen är tillgängliga (se diskussion). - Deparaffinize bilder i 100% xylen 2 x 5 minuter varje. Rehydrera bilderna med hjälp av följande serier: 100% EtOH 2 x 5 min, 70% EtOH 2 x 5 min, skriv 1 ultrarent vatten i 5 min.
Obs: Efter avparaffinering, är det viktigt att inte låta avsnitten torka ut: vävnadssnitt måste alltid täckas med buffertar eller lösningar fram till slutet av förfarandet eller vävnad struktur kan skadas. - För antigen retrieval, placera bilderna i en metall hållare och infoga den i bägaren med kokande citrat utan aluminiumfolie. Låt det koka i 10 min.
- Ta bort bägaren från värmeplattan och låt den svalna för 20 min. Kontrollera att avsnitten adrenal fortfarande är täckta med bufferten.
- Bered den blockerande. Om använder kommersiellt tillgängliga färgningen kit anställd för Representativa resultat (se Tabell för material), i en tub lägga till 1,25 mL 1 x PBS, 1 droppe (motsvarar ca 45 µL) av mus Ig blockerar reagens och 5% av normal get serum. Den blockerande förvaras vid 4 ° C eller på is medan du arbetar.
Obs: Serum används beror på sekundära antikroppens värdart. Här har sekundära antikroppar uppvuxen i geten använts. För andra antikroppar, kan olika serumkoncentrationer vara nödvändigt. Empiriskt bestämma rätt serumkoncentration genom att testa flera koncentrationer. - Över bilderna till en Coplin burk som innehåller 1 x PBS och tvätta 3 x 10 min varje på en rocker med mild gunga.
- Förbereda en befuktade kammare för färgningen.
- Försiktigt, skaka av PBS från en bild; torka bild med en luddfri torka bort överflödig PBS.
- Med en speciell markör för diabilder med hydrofoba egenskaper, rita en cirkel som omger varje binjure avsnitt, se till att glasytan är torrt för att undvika spridning av bläck lösningen till avsnittet. Om nödvändigt, noggrant torka ytan. Placera bilden i befuktade kammaren.
- Snabbt, överför med pipett 50 μl (eller tillräckligt för att täcka avsnitt) för att blockera lösning på varje avsnitt. Inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
Obs: Blockera lösningsvolym som behövs kan variera; Det är viktigt att avsnitten är väl täckta med lösningen. - Bered den spädningsvätska från kommersiellt tillgängliga kit med 7,5 mL 1 x PBS, 600 µL av proteinet koncentrera beståndet lösning och 5% normalt get serum (eller andra serum och koncentration som används i den blockerande lösningen). Den spädningsvätska förvaras vid 4 ° C eller på is medan du arbetar.
- Förbereda de primär antikropp lösningar att späda de primära antikropparna på de lämpliga koncentrationerna i spädningsvätska lösningen. För samtidig färgning, Lägg en alikvot av varje antikropp i en ny tub och blanda försiktigt. Plats antikroppar och antikropp lösningar på is tills klar att använda.
Obs: Här vi anställt anti-SF1 antikropp upp i kanin och en anti-TH antikropp upp i musen. För att förbereda antikroppen följa fungerande lösningar enligt anvisningarna.- För SF1 fungerande lösning, i en tub, lägga till 1 µL anti-SF1 antikropp i 999 µL spädningsvätska lösning (slutlig koncentration på 1,5 µg/mL). För TH fungerande lösning, i en tub, lägga till 1 µL anti-TH antikropp i 499 µL spädningsvätska lösning (beräknad slutlig koncentration på 2-6 µg/mL).
- För SF1 + TH antikropp arbetande mix, i en färsk tube, Pipettera 250 µL av SF1 fungerande lösning och 250 µL av TH fungerande lösning. Blanda försiktigt genom pipettering. Förvaras på is.
- Överföra bilder i en Coplin burk som innehåller 1 x PBS och tvätta 3 x 5 min varje på en rocker med mild gunga.
- Ställ glasen igen in i befuktade kammaren efter avtorkning av överskott av PBS, pipett SF1 + TH antikropp arbetande mix (eller annan primär antikropp lösning) på varje avsnitt, Stäng den befuktade kammaren och lämnar det över natten vid 4 ° C.
- Följande dag, flytta bilderna till en Coplin burk som innehåller 1 x PBS och tvätta 3 x 15 min på en rocker med mild gunga.
- När du tvättar glasen, Bered den sekundära antikroppar i spädningsvätska lösningen med hjälp av lämpliga koncentrationen. Om utför samtidig färgning, lägga lika stor mängd varje sekundär antikropp-lösning i en ny tub. Blanda försiktigt genom pipettering. Förvaras på is. Skydda rören mot ljus och lagra på is tills klar att använda.
Obs: Här, de sekundära antikroppar som används är 488 nm fluorescerande färgämne-märkt antimus uppvuxen i geten och 549 fluorescerande färgämne-märkt anti-kanin upp i geten. Sekundära antikroppar lösningen förbereddes genom att lägga till 0,5 µL av varje sekundär antikropp i 799 µL spädningsvätska lösning (slutliga koncentrationer på 1,2 µg/mL). - Placera glasen tillbaka i befuktade kammaren efter att ta bort överskott av PBS, snabbt Pipettera sekundär antikropp lösningen på avsnitten adrenal, Stäng den befuktade kammaren och ljuskänsligt. Inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
- Tvätta objektglasen i en Coplin burk med 1 x PBS och tvätta 3 x 15 min på en rocker med mild gunga, se till att skydda dem från ljus.
- Förbereda den 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) lösning för nukleär färgning: 1 µL DAPI (20 mg/mL) i 1 mL 1 x PBS.
Obs: Blå fluorescerande nukleära motfärg kan också uppnås med Hoechst färgämne. - Pipettera DAPI lösning på avsnitten adrenal, täcka från ljus och inkubera vid rumstemperatur i 7 min.
- Tvätta objektglasen i en Coplin burk med 1 x PBS och tvätta 3 x 5 min på en rocker med mild gunga samtidigt skydda bilderna från ljus.
- I ett område som skyddad från direkt ljus, fastställa en täckglaset och Pipettera 60 µL eller ca 3 droppar av montering agent lämplig för immunofluorescens längs ytan av täckglaset.
- Torka försiktigt på baksidan av en bild med en luddfri torka, position i bilden nedåt mot täckglaset och parallellt med det, så vävnadssnitt möta täckglaset med montering agent på det. Lätt tryck på bilden på täckglaset och se till att inga luftbubblor är instängd mellan bilden och skyddsglaset.
- Om det behövs, applicera ytterligare tryck ta bort luftbubblor och överskottet av montering agent.
- Fastställa bilden i en mörk behållare och härdning vid rumstemperatur i minst 24 h (eller den tid som anges i informationsbladet av montering agent används) och sedan vidare till imaging.
7. imaging
Obs: Fluorescens Mikroskop ansluten till en kamera krävs för att upptäcka och fånga fluorescensen som avges av vävnader efter excitation vid bestämda våglängder. Uppenbara, är det viktigt att komma ihåg att välja sekundär antikropp konjugerat med fluorokromer vars excitation och utsläpp spectra är kompatibla med utrustningen som finns. Imaging inställningar varierar beroende på mikroskopet och den programvara som används för att fånga bilder. Det finns några grundläggande regler som gäller för imaging adrenal sektioner, såsom att se till att exponeringstiden, kameran få inställningar och ljuskälla intensiteten hålls konstanta.
- Slå på ljuskällan och kameran, starta avbildningsprogrammet efter tillverkarens anvisningar.
Obs: Ordningen på dessa åtgärder kan variera beroende på den utrustning som används. - Säkra i bilden på scenen, öppna slutaren och tittar i Mikroskop okularen använder nukleär färgning (DAPI) kanal och låg förstoring (4 X) för att identifiera vävnaden på bilden: adrenal sektioner är små, och deras visualisering kan kräva lite tid.
- Ändra till en högre förstoring (10 X), fokus och stänga slutaren.
Obs: Det är viktigt att undvika onödigt lång exposition under ljuset som kan orsaka fotoblekning, vilket resulterar i förlust av signal. - Med kommandona programvara, Välj målet (10 X) och kanalen används (DAPI), justera exponeringstid (1 s, kan justeras om signalen är för stark eller svag). Om tillgängligt, ställa binning för levande imaging (inte förvärv) att '2 X 2', konvertering vinna till 'mid', avläsning hastighet till 20 MHz'. Om den programvara som används inte visas skalstapeln i slutet av imaging, Välj alternativet skala bar menyn och placera baren om så önskas.
- Öppna slutaren, och justera fokus vid behov och växla kanaler (FITC, TRITC, DAPI). Om mikroskopet inte är automatiserad, ta en bild av adrenal i varje kanal utan att flytta scenen och se till att justera markeringen vid kanalen i användning. Nära slutaren när klar.
Obs: Skriv ned inställningarna anställd om programvaran inte automatiskt sparar dem. - Spara bilderna.
Obs: Sammanslagna bilder kan ofta skapas med mikroskopets programvara eller andra grafik editor programvarupaket. - Upprepa imaging för andra områden av avsnittet och/eller med en högre förstoring.
Obs: En 20 X förstoring ofta kräver en kortare exponeringstid (dvs 800 ms). - I slutet av imaging, Stäng av all utrustning i rätt ordning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 representerar en schematisk av hela protokollet beskrivs ovan. Binjurarna skördas från möss, intilliggande fettvävnad tas bort under en dissekera Mikroskop och adrenal korrigeras sedan i 4% PFA. Efter detta steg, binjurar bearbetas och inbäddade i paraffin, och sektioneras med en mikrotom skär orgeln i tunna skivor som deponeras på objektglas. Efter torkning av avsnitten, immunofluorescens utförs och avsnitten är avbildade på mikroskopet.
Avlägsnande av angränsande fett (figur 2A) är viktigt för att underlätta vidare bearbetning och snittning av binjurarna. Lyckad borttagning av omgivande fettvävnaden visas i figur 2B, där binjurarna är lätt påvisbara och inget extra fett är synlig. Under detta steg är det kritiska, men för att inte låta torka ut binjuren eller detta kunde skada vävnad struktur. Torrhet är igenkännligt när adrenal förutsätter en rynkig utseende (figur 2C). Problemet kan enkelt lösas genom återfuktande i binjurarna i 1 x PBS innan du fortsätter med fettborttagning.
Slutresultatet erhålls följande detta protokoll presenteras i figur 3. Immunofluorescens bilderna illustrerar immunfärgning av en binjure vid två olika förstoringar. Röd nukleär SF1 färgning etiketter adrenokortikal cellerna, medan cytoplasmisk färgning gröna etiketter celler av medulla. Den yttersta kapseln är märkt av nukleär färgning i blått (DAPI) eftersom det inte är steroidogena (SF1-negativa).
Figur 1 : Schematisk representation av protokollet. Efter skörd binjurarna och ta bort intilliggande fettvävnaden, vävnader är fasta i 4% PFA, bearbetas för paraffin inbäddning och sektioneras. Avsnitten är sedan immunostained och avbildas med fluorescens Mikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Borttagande av peri-binjure fett. (A), fettet kring binjuren tas bort under en dissektion Mikroskop. (B) binjuren efter den rena upp. (C) exempel på vävnaden torkar upp och som kräver återfuktning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Immunofluorescens avbildning av binjuren. Exempel på immunofluorescens imaging (vid olika förstoringar) av en binjure färgas med markörer i binjurebarken (SF1, nukleär färgning) och av binjuremärgen (TH, cytoplasmiska grön). Atomkärnor (DAPI) markeras i blått. C: kapsel; CO: cortex; m: medulla. Skala barer = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Reagens | Station | Temperatur | Varaktighet |
| 70% EtOH | 1 | RT | 1 h |
| 90% EtOH | 2 | RT | 1 h |
| 90% EtOH | 3 | RT | 1 h |
| Absoluta EtOH | 4 | RT | 1 h |
| Absoluta EtOH | 5 | RT | 1 h |
| Absoluta EtOH | 6 | RT | 1 h |
| Absoluta EtOH | 7 | RT | 1 h |
| Xylen | 8 | RT | 1 h |
| Xylen | 9 | RT | 1 h |
| Xylen | 10 | RT | 1 h |
| Paraffinvax | 11 | 62 ° C | 1 h |
| Paraffinvax | 12 | 62 ° C | 1 h |
| Paraffinvax | 13 | 62 ° C | 1 h |
Tabell 1: Vävnad processor program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det här protokollet beskriver en metod för isolering av mus binjurarna tillsammans med beredning och färgning av sektionerad paraffin-inbäddat mus binjurar.
Jämfört med andra protokoll som vi testade, immunofluorescens protokollet har visat sig lämplig för majoriteten av antikroppar används i vårt laboratorium. I vissa fall kan det dock kräva vissa justeringar förbättra färgning resultaten. En variabel som kan enkelt ändras och testade är längden av fixering. I vårt laboratorium, inkubering i 4% PFA kan variera från 1 h 4 h, medan i andra laboratorier fixering tiden förlängs till 12 – 24 h16. I våra händer, dock längre fixering tid ledde till ökad bakgrundsljud och var inte optimal för flera antikroppar som rutinmässigt används i vår forskning.
PH-värdet i antigen retrieval kan också spela en roll i framgången för färgning. Värme-inducerad epitop hämtning (HIER) kan utföras genom att använda kommersiellt tillgängliga lösningar med pH alltifrån sura alkaliska, samt andra interna gjorde buffertar som citrat (pH 6), etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA, pH 8), Tris-EDTA (pH 9), Tris (pH 10). Enzymatisk behandling kan också vara ett alternativ för antigen demaskerar. Ruvning deparaffinized bilderna under en begränsad tid med en lösning som innehåller en lämplig koncentration av ett enzym (till exempel proteinas K) kan vara en alternativ metod till HIER. Det är dock viktigt att titrera enzym koncentration och att bestämma den idealiska inkubationstiden, sedan över matsmältningen kan påverkas negativt av vävnad17.
Valet av blockerande buffert är också en annan variabel för felsökning. Förutom användningen av normala get serum och de kommersiellt tillgängliga blockerande buffert som nämns i detta protokoll (bekvämt i det här fallet när du använder primära musantikroppar på mus vävnader för att förhindra hög bakgrund på grund av endogena mus-IgG), finns Ytterligare alternativ tillgängliga såsom protein lösningar (bovint serumalbumin (BSA) eller torr mjölk) eller andra kommersiellt tillgängliga buffertar. Det är viktigt att se till att bufferten inte innehåller substanser som kan interferera med färgningen, såsom biotin med en biotin-streptividin baserade metod.
Binjuren är ett endokrina organ som kännetecknas av höga fetthalten som ofta kan göra immunfärgning utmanande på grund av hög autofluorescens av lipid. Adrenal cortices från möss och råttor är dessutom rika på autofluorescent intracytoplasmatisk lipofuscin, ett pigmenterat granulat och amorfa material som varierar i färg från gult till brunt. För att lösa detta problem, kan föreningar såsom Sudan svart B (SBB) släcka den fluorescens som genereras av lipofuscins18. En annan faktor som äventyrar resultatet av en bra färgning är förekomsten av blodkroppar. Hemoglobin finns i erytrocyterna absorberar ljus av våglängder < 600 nm och kan störa fluorokromer som spänner över det våglängd19,20. Medan perfusion tekniker kan användas för att rensa blodkroppar från vävnad fartyg, hjälper också användning av 10 mM Kopparvitriol vid pH 5 innan du utför nukleära counterstaining i undertrycka oönskade fluorescens21.
Ett avgörande steg i detta protokoll är adrenal dissektion. Binjuren är ett organ vars läge kan vara svårt att hitta i situ: hos möss, körtlar är små och deras ställning är något varierande. Speciellt i äldre djur, är binjurar också omgivet av fettvävnad som kan störa upptäckt av körtlar och deras påföljande isolering, därför är det viktigt att ha en klar bild av området under detta steg i protokollet. Borttagning av peri-binjure fettborttagning är ett delikat steg. Särskild uppmärksamhet bör ägnas binjurar medan du lossar fettet så att inte brista kapseln. Körteln måste också hållas fuktig med PBS under förfarandet för att undvika vävnadsskada.
Vid snittning, kan påvisa förekomst av liten del av adrenal vävnad i avsnitten vara svårt på grund av vävnad hypopigmentering efter bearbetningssteget. Ett Mikroskop är mycket användbart vid snittning för kräsna vävnaden från vax.
Immunfärgning på paraffin-inbäddat sektioner är en värdefull teknik för immunolabeling proteiner av intresse samtidigt bevara morfologi av vävnaden. Metoden presenteras här baseras på fluorescens upptäckt och det är särskilt funktionella för studier som sysselsätter flera primära antikroppar, fluorescens signalen är ljuskänsliga och kan enkelt förlorat eller försvagas om bilderna inte hanteras korrekt (dvs, långvarig exponering för mikroskopet ljus eller onödig exponering för omgivande ljus). Dessutom kan vi märka en nedgång av kvaliteten på själva fluorescens signalen över tid. Detta problem kan undvikas med kromogent systemidentifiering, som är fotostabil och kan visualiseras i många år. Denna metod, men saknar fördelarna med fluorescens upptäckt, såsom högre märkning precision och samtidiga märkning av flera proteiner i en studie.
Paraffin inbäddning är en bekväm metod för att bearbeta och lagra flera vävnadsprover. Vävnaden bearbetning för paraffin inbäddning sig är dock inte lämplig för avbildning av fluorescerande reportrar endogenously uttrycks i vissa transgena djur utan användning av en specifik antikropp inriktning reportern. Frysförvaring är en metod att undvika nedbrytning av fluorescerande protein och låta dess direkt visualisering under ett mikroskop. Undvika användning av en extra antikropp kan representera en fördel. Däremot, kan frysförvaring också vara begränsande eftersom det påverkar vävnad morfologi; Det kräver också olika utrustning för snittning, och lagring av bilder och vävnad block är möjligt i frysar endast.
En stor begränsning av imaging en sektionerad vävnad är förmågan att få bilder av strukturella komponenter med hög rumslig upplösning. Vävnadssammansättning, i själva verket är en viktig variabel i kvalitetsbestämning av imaging eftersom det påverkar ljuspenetrering och kan leda till dålig upplösning. Binjuren är en vävnad som är rik på lipider som orsakar ljus spridning22. I hjärnan, som också har en hög fettinnehållet, har vävnad-clearing tekniker såsom klarhet, BABB, iDISCO och 3DISCO utvecklats för att förbättra vävnad visualisering, möjliggör bättre bildbehandling och 3D vävnad rekonstruktion23. Dessa tekniker ger forskare hög kvalitet imaging data, och som anpassas till ett stort antal olika vävnader, och i framtiden, vi hoppas att använda dessa metoder för adrenal imaging samt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Mohamad Zubair för hans användbara förslag och tekniskt bistånd för inrättandet av detta protokoll. Detta arbete stöds av nationella institutet för Diabetes- och mag- och njursjukdomar, nationella institut för hälsa forskningsbidrag 2R01-DK062027 (till G.D.H).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25 G x 5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated, 22 mm square top tapered to 12 mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3" x 3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4 inch x 8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22 x 50 x 1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20 mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | American Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
References
- Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Yates, R., et al. Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease. Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).
- Jones, I. C. Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory. Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).
- Sucheston, M. E. C., Samuel, M. The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland. The Ohio Journal of Science. 72, n2 (March, 1972) 120-126 (1972).
- Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).
- Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling. Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. Lipid droplets and steroidogenic cells. Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).
- Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. Hedgehog signaling and steroidogenesis. Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Lowe, J., Anderson, P. Stevens & Lowe's Human Histology, 4th Edition. , Elsevier/Mosby. 263-285 (2015).
- Nagatsu, T. Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes. Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).
- Berthon, A., et al. Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function. Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).
- Brown, C. Antigen retrieval methods for immunohistochemistry. Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins. Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).
- Watson, J. Suppressing autofluorescence of erythrocytes. Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
