Summary
يتم تطوير تقنية النشاف الغربية فائقة السرعة من خلال تحسين حركية الأجسام المضادة المضادة المضادة الملزمة من خلال تقنية تجفيف الدوريات وتجديدها (CDR) بالاقتران مع عامل تعزيز رد المناعة.
Abstract
البقعة الغربية (المعروفة أيضا باسم مناعي) هي طريقة متعارف عليها لأبحاث الطب الحيوي. ويستخدم عادة لتحديد الحجم النسبي ووفرة بروتينات محددة، فضلا عن تعديلات البروتين بعد الترجمة. هذه التقنية لها تاريخ غني وتبقى في الاستخدام على نطاق واسع بسبب بساطتها. ومع ذلك ، فإن إجراء النشاف الغربي يستغرق ساعات ، حتى أيام ، لإكمال ، مع اختناق حرج هو أوقات الحضانة الطويلة التي تحد من الإنتاجية. هذه الخطوات الحضانة مطلوبة بسبب الانتشار البطيء للأجسام المضادة من المحلل السائبة إلى المستضدات المُشلّة على الغشاء: تركيز الأجسام المضادة بالقرب من الغشاء أقل بكثير من التركيز الأكبر. هنا، نقدم ابتكاراً يقلل بشكل كبير من فترات الحضانة هذه من خلال تحسين الربط المستضدي عن طريق استنزاف دوري وتجديد (CDR) من محلول الأجسام المضادة. كما استخدمنا تقنية تعزيز رد الفعل المناعي للحفاظ على حساسية الفحص. عزز مزيج من طريقة CDR مع عامل تحسين المناعة التجارية إشارة الإخراج وخفض بشكل كبير وقت حضانة الأجسام المضادة. يمكن إنجاز البقعة الغربية فائقة السرعة الناتجة في 20 دقيقة دون أي خسارة في الحساسية. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على البقع الغربية باستخدام كل من chemiluminescent والكشف الفلورسنت. يسمح هذا البروتوكول البسيط للباحثين باستكشاف تحليل تعبير البروتين بشكل أفضل في العديد من العينات.
Introduction
البقعة الغربية (المعروفة أيضا باسم مناعي) هي تقنية قوية وأساسية عبر مجموعة واسعة من التخصصات العلمية والسريرية. وتستخدم هذه التقنية لدراسة وجود, وفرة النسبية, كتلة جزيئية نسبية, والتعديلات بعد تحويل البروتينات1. جنبا إلى جنب مع تحليل الصور الرقمية، يمكن لهذه الطريقة تحليل موثوق وفرة من البروتينات والتعديلات البروتين2. على الرغم من أن يتم تنفيذ لطخة الغربية بشكل روتيني، بل هو وسيلة تستغرق وقتا طويلا والعمل المكثف. يتطلب حضانة طويلة من الأجسام المضادة مع الأغشية. هنا، نحن وصف تعديل طريقة الحضانة التي تتغلب على هذا القيد دون التضحية الحساسية.
أثناء حضانة الغشاء ، تطفو الأجسام المضادة في محلول بينما يتم تثبيت المستضدات على الغشاء. بسبب تقاربها عالية، ومعدل للجسم المضاد ملزمة المستضد هو أسرع من انتشار الأجسام المضادة من المحلل السائبة إلى الغشاء. وهذا يخلق تركيز منخفض "طبقة استنزاف"(الشكل 1). قد يستغرق ساعات للأجسام المضادة أكثر بعدا للوصول إلى الغشاء عن طريق الانتشار السلبي، الذي هو العامل الرئيسي المسؤول عن أوقات الحضانة الطويلة في هذه التقنية. هذا التأثير يسمى قيود النقل الجماعي (MTL)3. وقد اقترح أن استنزاف المتكررة وتجديد حل الأجسام المضادة التي تحتوي على قد تعطل طبقة الاستنفاد والتغلب على MTL4. هنا ، قمنا بتصميم تقنية فريدة من نوعها تنفذ هذا المفهوم استنزاف وتجديد دوري (CDR) لتقليل تأثير MTL في بروتوكول النشاف الغربي التقليدي وتقصير فترة الحضانة المطلوبة بشكل ملاحظ.
من أجل الحفاظ على حساسية الكشف مع فترة حضانة قصيرة ، قمنا باستخدام تقنية تعزيز رد المناعة التي تسرع تفاعل مستضد الأجسام ، وبالتالي تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء5. العديد من العوامل المتاحة تجاريا تعزيز رد الفعل المناعي (IRE) تتكون من 2 مكونات (الحل 1 و 2، انظر جدول المواد). لم يتم الكشف عن تكوين الملكية أو آلية عمل IRE ، ولكننا وجدنا سابقا أن IRE انخفض ثابت الانفصام بين المستضد والأجسام المضادة في مرحلة صلبة ملزمة المستويات ، مما يدل على زيادة تقارب ، على الأقل جزئيا ، مسؤولة عن تعزيز تأثير IRE6. مزيج من CDR مع IRE ينتج بروتوكول النشاف الغربية فائقة السرعة التي تقلل من الوقت الإجراء بأكمله دون التضحية الحساسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SDS-PAGE ونقلها إلى غشاء PVDF
- قم بإجراء SDS-PAGE لفصل البروتينات بناءً على الحجم النسبي.
ملاحظة: أي نظام هلام التجاري أو منزلي الصنع على ما يرام. الرجاء اتباع بروتوكول الشركة المصنعة. - نقل البروتينات المنفصلة من هلام على غشاء PVDF.
ملاحظة: طرق النقل الشائعة (شبه الجافة أو نقل الرطب) هي مناسبة. الرجاء اتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
2. حجب أغشية PVDF
- احتضان الأغشية في مخازن منع مناسبة لمدة 1 ساعة مع التحريض في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: استناداً إلى الأجسام المضادة الأولية ونظام الكشف، يجب تحديد مخزن حظر مناسب. على سبيل المثال، فإن حاصرات الأكثر نموذجية هي BSA، والحليب الجاف غير الدهني، والكاسين، والبوليمرات الاصطناعية التجارية. برنامج تلفزيوني و / أو TBS مع 0.1٪ Tween20 هي المخازن الأكثر استخداما. قد يتم هذا الحظر خطوة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
3. حضانة مع الأجسام المضادة الأولية
- إعداد 10٪ من العلاج المناعي تعزيز وكيل-1 حل (IRE-1) مع الماء المقطر. دوامة جيدا.
- إعداد الأجسام المضادة الأولية المخففة مع 10٪ IRE-1. امزجه بلطف ودقة.
- إذا كان استخدام غشاء أكبر (4 سم × 8 سم – 8 سم × 8 سم)، أضف 8 مل من محلول الأجسام المضادة إلى أنابيب أجهزة طرد مركزي مخروطية 50 مل. إذا كان استخدام غشاء أصغر (2 سم × 8 سم – 4 سم × 8 سم)، أضف 3 مل من محلول الأجسام المضادة إلى أنبوب البولي بروبلين دائري القاع 14 مل(جدول المواد).
- التقط غشاء PVDF مع ملاقط واستنزاف محلول الحجب لفترة وجيزة. أدخل غشاء PVDF في هذا الأنبوب بأصابع قفازة وتأكد من أن الغشاء بأكمله يتمسك بجدار الأنبوب. عندما يتم إدخال غشاء PVDF في أنبوب، وجه "الجانب البروتين" من الغشاء الذي كان في الأصل في اتصال مع هلام الداخل. أغلق الغطاء بإحكام.
- أدخل أنبوب 50 مل في زجاجة فرن التهجين.
ملاحظة: عندما يتم استخدام 14 مل أنابيب لهذه الحضانة، أدخل أنبوب 14 مل في أنبوب 50 مل، وذلك باستخدام زوج من أصحاب حلقة بلاستيكية للحفاظ على أنبوب الداخلية في وسط أنبوب 50 مل. - بدوره على فرن التهجين.
- احتضان الغشاء مع دوران 6 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق على الأقل.
ملاحظة: تأكد من أن الغشاء يتمسك بالجدران في جميع الأوقات وأن الأنبوب (الداخلي) أفقي لتغطية الغشاء بمحلول الأجسام المضادة بالتساوي. معايرة تخفيف الأجسام المضادة ووقت الحضانة قبل التجربة الفعلية.
4. غسل الأغشية
- أوقفوا الدوران
- إزالة بعناية غشاء PVDF من الأنبوب مع ملاقط، ووضع الغشاء في وعاء مع 50 مل من برنامج تلفزيوني-T.
- شطف الغشاء لفترة وجيزة مع برنامج تلفزيوني-T.
- شطف الغشاء في الحاوية بالماء المقطر حتى لا تظهر فقاعات. هذا هو لإزالة غالبية الأجسام المضادة.
- نقل غشاء PVDF من الحاوية إلى سلطة الدوار التي تحتوي على 250 مل من برنامج تلفزيوني-T.
- ضع سلة المصفاة في الدوار. تأكد من أن الغطاء قد تم وضعه بشكل آمن.
- تفعيل الدوار وتشغيله لحوالي 20-30 s.
- تجاهل الحل وشطف لفترة وجيزة داخل الدوار مع الماء المقطر.
- إضافة 250 مل من برنامج تلفزيوني-T في الدوار مرة أخرى.
- كرر الخطوات 4.6 و 4.7.
5. حضانة مع الأجسام المضادة الثانوية
- إعداد 10٪ من العلاج المناعي تعزيز وكيل-2 حل (IRE-2) مع الماء المقطر. دوامة جيدا.
- إعداد الأجسام المضادة الثانوية المخففة مع 10٪ IRE-2. امزجه بلطف ودقة.
- حدد حجم محلول الأجسام المضادة وأنبوب كما هو مذكور في الخطوة 3.3.
- التقط غشاء PVDF مع ملاقط واستنزاف المحلول لفترة وجيزة. أدخل غشاء PVDF في الأنبوب كما هو مذكور في الخطوة 3.4.
- أدخل أنبوب 50 مل في زجاجة فرن التهجين.
- بدوره على فرن التهجين.
- احتضان الغشاء مع دوران 6 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق على الأقل. تأكد من أن الغشاء يتمسك الجدار في جميع الأوقات وأن الأنبوب (الداخلي) أفقي لتغطية الغشاء بالتساوي مع حل الأجسام المضادة.
ملاحظة: معايرة وقت الحضانة قبل التجربة الفعلية. عندما يكون الجسم المضاد الثانوي مترافقاً بالفلورسنت، قم بإجراء الحضانة في الظلام.
6. غسل الأغشية
- اتبع الخطوات 4.1 إلى 4.10.
7. الحصول على صورة
- الكشف Chemiluminescent
- ضع قطعة من فيلم مرن شبه زراعة (10 سم × 15 سم) على سطح مستو.
- مزيج 2 مكونات الركيزة chemiluminescent في أنبوب 5 مل.
- نقل على الفور 1.5 مل من الركيزة المختلطة إلى فيلم مرن شبه زرع ووضع غشاء PVDF على ذلك. ثم، نقل بقية محلول الركيزة إلى الغشاء.
- احتضان غشاء PVDF مع الركيزة المختلطة على فيلم مرنة شبه شفافة لمدة 1 دقيقة.
- التقط غشاء PVDF مع ملاقط واستنزاف محلول الركيزة لفترة وجيزة.
- شطيرة الغشاء بين زوج من أفلام الشفافية.
- الحصول على الصورة تحت وضع chemiluminescent.
- الكشف عن الفلورسنت
- التقط غشاء PVDF مع ملاقط واستنزاف المحلول لفترة وجيزة.
- شطيرة الغشاء بين زوج من أفلام الشفافية.
- الحصول على الصورة تحت وضع الفلورسنت.
ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوتين 7.1 و 7.2 على مقربة من آلة التصوير لضمان أقصى حساسية. - عندما تكون إشارة الخلفية عالية، قم بإجراء خطوة غسيل في حاوية مع 80-100 مل من PBS-T: 10 دقيقة شطف 3 مرات للجسم المضاد الأساسي و 5 دقائق شطف 6 مرات للجسم المضاد الثانوي.
ملاحظة: يمكن استخدام كل من الأجسام المضادة الأولية والثانوية المخففة مع حلول IRE 10٪ ما يصل إلى 8-10 مرات دون فقدان الحساسية6. يجب أن يبقى الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح هذا المثال فعالية طريقة CDR مع تقنية المناعة على البقع الغربية. تم إجراء حضانة ثابتة على فيلم مرن شبه شفاف حيث تم احتضان أغشية PVDF مع محلول الأجسام المضادة ، في حين أن حضانة CDR كانت في فرن التهجين عن طريق تدوير الأنابيب التي تحتوي على الأغشية وحل الأجسام المضادة (Movie). ويبين الشكل 2 كميات من المستضد والأجسام المضادة، على التوالي، اللازمة للكشف عن الاجسام الكيميائية على البقع الغربية. في كل من حضانات ثابتة وCR، زاد استخدام حل IRE من الحساسية: خفض IRE أقل كمية من الخلايا (المستضد) اللازمة للكشف عن ß-actin من 2.2 ميكروغرام إلى 1.1 ميكروغرام في ظل ظروف ثابتة وتقليلها من 1.1 ميكروغرام إلى 0.275 ميكروغرام باستخدام CDR(الشكل 2A). وبالمثل، تم تخفيض الحد الأدنى للتركيز من المضادة 6x له الوسم الأجسام المضادة من 100 نانوغرام / مل إلى 50 نانوغرام / مل في ظل ظروف ثابتة ومن 100 نانوغرام / مل إلى 12.5 نانوغرام / مل تحت شرط CDR (الشكل 2B). CDR الحضانة إما 5 دقيقة أو 10 دقيقة خفضت بشكل كبير حد الكشف مقارنة مع الحضانة الساكنة (60 دقيقة مع الابتدائي و 30 دقيقة مع الأجسام المضادة الثانوية). وأخيرا، فإن الجمع بين CDR مع IRE كشفت حساسية متفوقة على لطخة الغربية (0.275 ميكروغرام من lysates الخلية للكشف عن ß-actin و 12.5 نانوغرام / مل من المضادة 6x له tag الأجسام) حتى في هذه الفترة حضانة قصيرة للغاية.
يوضح المثال الثاني التطبيق الناجح لهذه الطريقة على بقعة غربية مع الكشف عن الفلورسنت(الشكل 3). الكشف الفلورسنت، على النقيض من الكشف chemiluminescent، لديه قدرة فريدة للكشف عن أهداف متعددة على نفس البقعة في نفس الوقت دون تجريد / إعادة التحقيق الأجسام المضادة. (له) 6 تم الكشف عن 6 مبسومة AP و ß-actin في الخلية lysates في وقت واحد باستخدام فلوريوفور ذو لونين. حضانة CDR مع IRE ليس فقط تسارع الكشف ولكن أيضا زيادة حساسية, مما أدى إلى كشف تدهور (له)6 الموسومة AP (الشكل 3A).
الشكل 1: رسم توضيحي لطريقة إعادة تغذية استنزف الدوري.
(A) طبقة استنزاف بالقرب من الغشاء تتشكل بسرعة في ظل ظروف ثابتة عندما يكون للمسبار تقارب عالٍ للمستضد ولكن قدرة محدودة على الانتشار من خلال الحل. وهكذا، والسفر من المسبار إلى الغشاء يصبح معدل الحد من الخطوة وأوقات الحضانة طويلة تعويض عن الحد من نقل الشامل. (B) طريقة CDR عن طريق تدوير الأنبوب في حين أن الغشاء يتمسك الجدار يلغي طبقة الاستنفاد ويغذي نفس الحل التحقيق للحفاظ على تركيز المسبار بالقرب من ثابت الغشاء. وقد تم تعديل هذا الرقم من هيغاشي وآخرون6. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: (أ)تم فصل كميات مختلفة من 293 خلية (1:2 تخفيفات تسلسلي من 8.8 ميكروغرام /حارة) من قبل SDS-PAGE، تليها نقل إلى غشاء PVDF والحجب مع الحليب الخالي من الدسم 5٪ في PBS-T. تم فحص البقعة مع الأجسام المضادة لمكافحة ß-actin الماوس (1:3,000 تخفيف). (ب) بعد فصل الوسائط المشروطة المستمدة من الخلايا 293 المصابة بالعدوى مع pAPTAG5 (GenHunter) التي تحتوي على يفرز (له)6 الموسومة فوسفاتاتيز القلوية (AP, 8 x 10-14 مول / حارة), تم نقل البروتينات إلى أغشية PVDF. وقد تعرض كل غشاء للطخة الغربية مع تركيزات مختلفة من المضادة 6x له الوسم الأجسام المضادة (1:2 تخفيف المسلسل من 400 نانوغرام / مل). تم تصوير الأغشية كصورة واحدة وخطوط منقط تشير إلى حدود الأغشية الفردية. وقد تم تعديل هذا الرقم من هيغاشي وآخرون6. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الكشف المتزامن عن أهداف متعددة على بقعة غربية باستخدام الكشف الفلوري وCDR بالتزامن مع IRE.
تم فصل كميات مختلفة من الليزات (1:2 تخفيفات تسلسلي من 10 ميكروغرام /حارة) من 293 خلية مصابة بـ pAPTAG5 ونقلت إلى غشاء PVDF. بعد حجب مع العازلة حظر للكشف الفلورسنت (BFD) لمدة 1 ساعة، تم التحقيق في وصمة عار مع المضادة 6X له العلامة المضادة والأجسام المضادة ß-actin، تليها IRDye 800CW الماعز المضادة للأرانب IgG وIRDye 680RD الماعز المضادة للماوس IgG. A: الأجسام المضادة المخففة مع 10٪ حل IRE تحت شرط CDR، B: الأجسام المضادة المخففة مع BFD تحتوي على 0.1٪ Tween20 تحت شرط ثابت. بسبب حساسية أعلى مع CDR و IRE الجمع، وشوهدت تدهور (له)6 مُوسّمة AP. وقد تم تعديل هذا الرقم من هيغاشي وآخرون6. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: رسم توضيحي تخطيطي لطخة (CDR) الغربية المحسنة وعالية السرعة مقارنةً بطريقة ثابتة تقليدية.
وقد تم تعديل هذا الرقم من هيغاشي وآخرون6. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لطخة الغربية هي تقنية تحليلية تستخدم على نطاق واسع للكشف عن بروتينات محددة التي تم تطويرها ~ قبل 40 عاما7،8. ومنذ ذلك الحين، استمرت هذه التقنية في التطور، مع الابتكارات اللاحقة تحسين حساسية وسرعة، وكمية من تقنية2،9،10،11،12،13. تعزيز فائقة السرعة الغربية بروتوكول النشاف المعروض هنا يجعل العديد من التحسينات الكبيرة على التقنية القائمة. نحن تقليل وقت الحضانة دون التضحية الحساسية عن طريق خفض عتبة الكشف مع IRE. لا توجد حاجة إلى معدات خاصة أو باهظة الثمن: تدوير أنبوب في فرن التهجين يكفي للتغلب على MTL. الابتكار الرئيسي هو أن CDR يلغي بشكل فعال طبقة الاستنفاد في الفحص. على الرغم من أن جهاز الاستزراع الأسطواني يستخدم عادة لتقليل حجم الحل، إلا أن إمكانية هذه الطريقة للتغلب على MTL وتقليل أوقات الحضانة لم توضح. بسبب الانخفاض الجذري في الوقت الإجمالي لإجراء كامل(الشكل 4)، كميات أعلى بكثير من البيانات بقعة الغربية يوميا يمكن الحصول عليها عندما الأغشية المحظورة هي في يد واحد، وهو يكاد يكون من المستحيل القيام بذلك مع بروتوكول النشاف الغربية التقليدية. تجدر الإشارة إلى أن حضانة الغشاء على منصة هزاز شاكر هو ما يعادل الحضانة الساكنة4,6. الشطف أغشية PVDF في السلطة التجارية المنزلية الدوار مع حجم كبير من محلول الغسيل يقلل أيضا من مدة الإجراء (الشكل 4).
يعتمد الاستخدام الناجح لهذا البروتوكول على تحسين تخفيف الأجسام المضادة مع حل IRE ووقت الحضانة. ويوصى مجموعة واسعة من المعايرة الأجسام المضادة في بداية المقايسات منذ CDR بالتزامن مع IRE يزيد من حساسية كبيرة (الشكل 2). وقت الحضانة هو عامل آخر يجب النظر فيه. عندما يكون لدى المرء نتائج جيدة لطخة غربية مع حضانة 1 ح مع الأجسام المضادة الأولية في ظل ظروف ثابتة، يمكن تخفيض وقت الحضانة إلى 5-10 دقيقة تحت ظروف CDR بشكل عام. عندما تكون هناك حاجة الحضانة بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة الأولية على سبيل المثال، ينبغي تقييم وقت حضانة CDR أطول قليلا (30 دقيقة - 6 ح). التخفيف وحضانة الوقت مع الأجسام المضادة الثانوية هي أيضا حاسمة. الاحتضان أكبر من 30 دقيقة في ظل ظروف CDR عادة ما تعطي خلفية أعلى. وبالتالي، مطلوب المعايرة الدقيقة من الأجسام المضادة الثانوية مع ما يصل إلى 30 دقيقة من حضانة CDR. عندما تكون إشارة الخلفية عالية بعد المعايرة الدقيقة للأجسام المضادة ، يجب تنفيذ خطوات غسيل واسعة النطاق (10 دقائق شطف 3 مرات للجسم المضاد الأساسي و 5 دقائق شطف 6 مرات للجسم المضاد الثانوي في وعاء مع 80-100 مل من محلول الغسيل).
نوعية البيانات بقعة الغربية غالبا ما يعتمد على الأجسام المضادة المستخدمة. عندما كان لدينا جسم مضاد صعب يستخدم لللطخة الغربية ، أظهرت علامات البروتين في بعض الأحيان إشارات كبيرة حتى بعد معايرة الأجسام المضادة الدقيقة والغسيل المكثف. منذ أن لاحظنا أن طريقة CDR مع IRE يميل إلى زيادة الربط غير محددة، إضافة الكواشف منع (مثل الحليب الخالي من الدسم وغيرها) في ظائب الأجسام المضادة قد يحسن نسبة إشارة إلى الضوضاء14. إنها خطوة فحص تستغرق وقتا طويلا، ولكنها تستحق المحاولة.
وقد أصبحت البقعة الغربية مهمة للتطبيقات الكمية2. ويمكن إجراء نصف كمية مع الكشف chemiluminescent. الإجراء المعروض هنا ينطبق على تجريد وإعادة التحقيق لهذه الغاية6. بسبب نطاق ديناميكي أوسع، الكشف الفلورسنت هو الخيار الأفضل. مع هذا البروتوكول، يوفر الكشف الفلورسنت نطاق ديناميكي خطي للتحليل الكمي6. ومن الجدير بالذكر أن وقت حضانة CDR مع الكشف الفلورسنت يبدو أطول من ذلك مع الكشف chemiluminescent.
البقعة الغربية لديها مجموعة واسعة من التطبيقات وتبقى طريقة عالمية لدراسة وفرة البروتين، والتفاعلات البروتين البروتين، والتعديلات ما بعد الترجمة. على سبيل المثال، يمكن بسهولة المضادة المضادة الكربوهيدرات المضادة لاستخدامها في لطخة الغربية مع هذا البروتوكول14. منذ مجموعة متنوعة من ال moieties الكربوهيدرات التي أعرب عنها على السطح الخارجي لل الفيروسية, البكتيريا, وfugus هي الممرض محددة, فهي أهداف لا تقدر بثمن للتعرف على مسببات الأمراض وتشخيص الأمراض المعدية. وهكذا ، فإن تطبيق هذا البروتوكول البسيط يمكن أن يؤثر على العديد من مجالات التحقيق ، حلق ساعات من وقت الانتظار ليس فقط للتجارب ولكن أيضا التشخيص المناعي السريري التي تعتمد على تكنولوجيا النشاف الغربية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد أعلن أصحاب البلاغ أنه لا توجد مصالح متنافسة ذات صلة مباشرة بمحتويات هذه المادة.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل شعبة البحوث داخل الأمعاء، والمعهد الوطني للقلب والرئة والدم، والمعاهد الوطنية للصحة. وقد تم دعم S.H. من قبل اليابان الشراكة بين القطاعين العام والخاص طالب دراسة في الخارج، وH.N. وK.Y. كانت من قبل منحة التدريب ما وراء البحار والمخدرات V.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
References
- MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
- Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
- Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
- Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html (2020).
- Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
- Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852 (2016).
- Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
- Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).
