Summary
Eine Ultra-High-Speed-Western-Blotting-Technik wird entwickelt, indem die Kinetik der Antigen-Antikörper-Bindung durch zyklische Entwässerungs- und Auffüllungstechnologie (CDR) in Verbindung mit einem Immunreaktions-Verbesserungsmittel verbessert wird.
Abstract
Ein Westlicher Blot (auch als Immunoblot bekannt) ist eine kanonische Methode für die biomedizinische Forschung. Es wird häufig verwendet, um die relative Größe und Fülle von spezifischen Proteinen sowie post-translationale Proteinmodifikationen zu bestimmen. Diese Technik hat eine reiche Geschichte und bleibt in weit verbreiteter Verwendung aufgrund seiner Einfachheit. Das westliche Blotting-Verfahren dauert jedoch bekanntlich Stunden, sogar Tage, mit einem kritischen Engpass, die langen Inkubationszeiten sind, die seinen Durchsatz begrenzen. Diese Inkubationsschritte sind aufgrund der langsamen Diffusion von Antikörpern aus der Bulk-Lösung zu den immobilisierten Antigenen auf der Membran erforderlich: Die Antikörperkonzentration in der Nähe der Membran ist viel niedriger als die Massenkonzentration. Hier präsentieren wir eine Innovation, die diese Inkubationsintervalle drastisch reduziert, indem die Antigenbindung durch zyklisches Ablassen und Auffüllen (CDR) der Antikörperlösung verbessert wird. Wir haben auch eine Immunreaktions-Verbesserungstechnologie verwendet, um die Empfindlichkeit des Assays zu erhalten. Eine Kombination der CDR-Methode mit einem kommerziellen Immunreaktionsmittel steigerte das Ausgangssignal und reduzierte die Inkubationszeit des Antikörpers erheblich. Der resultierende Ultra-High-Speed-Western-Blot kann in 20 Minuten ohne Verlust der Empfindlichkeit erreicht werden. Diese Methode kann auf westliche Flecken angewendet werden, indem sowohl chemilumineszierender als auch fluoreszierender Nachweis verwendet wird. Dieses einfache Protokoll ermöglicht es Forschern, die Analyse der Proteinexpression in vielen Proben besser zu untersuchen.
Introduction
Ein western blot (auch bekannt als Immunoblot) ist eine leistungsstarke und grundlegende Technik in einer breiten Palette von wissenschaftlichen und klinischen Disziplinen. Diese Technik wird verwendet, um das Vorhandensein, die relative Häufigkeit, die relative Molekularmasse und posttranslationale Modifikationen von Proteinen1zu untersuchen. In Kombination mit der digitalen Bildanalyse kann diese Methode zuverlässig die Fülle von Proteinen und Proteinmodifikationen analysieren2. Obwohl Western Blot routinemäßig durchgeführt wird, ist es eine zeitaufwändige und arbeitsintensive Methode. Lange Inkubationen des Antikörpers mit Membranen sind erforderlich. Hier beschreiben wir eine Modifikation der Inkubationsmethode, die diese Einschränkung überwindet, ohne die Empfindlichkeit zu opfern.
Während der Inkubation der Membran schwimmen Antikörper in Lösung, während Antigene auf der Membran immobilisiert werden. Aufgrund ihrer hohen Affinität ist die Rate der Antikörperbindung an das Antigen schneller als die Diffusion von Antikörpern aus der Massenlösung zur Membran. Dadurch entsteht eine "Erschöpfungsschicht" mit geringer Konzentration (Abbildung 1). Es kann Stunden dauern, bis weiter entfernte Antikörper die Membran über passive Diffusion erreichen, was der Hauptfaktor für lange Inkubationszeiten in dieser Technik ist. Dieser Effekt wird als Massentransportbegrenzung (MTL)3bezeichnet. Es wurde vorgeschlagen, dass das wiederholte Entleeren und Auffüllen der antikörperhaltigen Lösung die Erschöpfungsschicht stören und MTL4überwinden kann. Hier haben wir eine einzigartige Technik entwickelt, die dieses cyclic Draining and Replenishing (CDR) Konzept implementiert, um die Wirkung von MTL in einem traditionellen westlichen Blotting-Protokoll zu verringern und die erforderliche Inkubationszeit zu verkürzen.
Um die Detektionsempfindlichkeit mit einer kurzen Inkubationszeit aufrechtzuerhalten, haben wir eine Immunreaktionsverbesserungstechnologie verwendet, die die Antigen-Antikörper-Reaktion beschleunigt und dadurch das Signal-Rausch-Verhältnis5verbessert. Viele kommerziell erhältliche Immunreaktions-Verbesserungsmittel (IRE) bestehen aus 2 Komponenten (Lösung 1 und 2, siehe Materialtabelle). Die proprietäre Zusammensetzung oder der Wirkmechanismus von IRE wurde nicht offenbart, aber wir haben zuvor festgestellt, dass IRE die Dissoziationskonstante zwischen Antigen und Antikörper in festen Phasenbindungstests verringerte, was darauf hindeutet, dass eine erhöhte Affinität zumindest teilweise für die verstärkende Wirkung von IRE6verantwortlich ist. Die Kombination von CDR und IRE ergibt ein ultrahochschnelles Western-Blotting-Protokoll, das die gesamte Prozesszeit reduziert, ohne die Empfindlichkeit zu opfern.
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Protocol
1. SDS-PAGE und Übertragung auf eine PVDF-Membran
- Führen Sie SDS-PAGE aus, um Proteine basierend auf der relativen Größe zu trennen.
HINWEIS: Jedes kommerzielle oder hausgemachte Gelsystem ist in Ordnung. Bitte folgen Sie dem Protokoll des Herstellers. - Übertragen Sie getrennte Proteine von einem Gel auf eine PVDF-Membran.
HINWEIS: Häufige Übertragungsmethoden (halbtrockener oder nasser Transfer) sind geeignet. Bitte folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
2. Blockierung von PVDF-Membranen
- Inkubieren Sie die Membranen in geeigneten Blockierpuffern für 1 h mit Rührung bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Abhängig vom primären Antikörper und Detektionssystem sollte ein geeigneter Blockierpuffer ausgewählt werden. Die typischsten Blocker sind beispielsweise BSA, fettfreie Trockenmilch, Casein und kommerzielle synthetische Polymere. PBS und/oder TBS mit 0,1% Tween20 sind die am häufigsten verwendeten Puffer. Dieser Sperrschritt kann über Nacht bei 4 °C erfolgen.
3. Inkubation mit primärem Antikörper
- Bereiten Sie 10% Immunreaktions-Verbesserungsmittel-1-Lösung (IRE-1) mit destilliertem Wasser vor. Wirbel gut.
- Bereiten Sie den verdünnten Primärantikörper mit 10% IRE-1 vor. Mischen Sie es sanft und gründlich.
- Bei Verwendung einer größeren Membran (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm) 8 ml der Antikörperlösung in 50 ml konische Zentrifugenrohre geben. Bei Verwendung einer kleineren Membran (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm) 3 ml der Antikörperlösung in 14 ml rundboden-Polypropylenrohr(Materialtabelle)geben.
- Nehmen Sie die PVDF-Membran mit einer Pinzette auf und entleeren Sie die Blockierlösung kurz. Setzen Sie die PVDF-Membran mit gehandicapten Fingern in dieses Rohr ein und stellen Sie sicher, dass die gesamte Membran an der Rohrwand haftet. Wenn die PVDF-Membran in eine Röhre eingeführt wird, stellen Sie sich der "Proteinseite" der Membran, die ursprünglich mit dem Gel nach innen in Berührung kam. Schließen Sie die Kappe fest.
- Legen Sie das 50 ml-Rohr für den Hybridisierungsofen in eine Glasflasche ein.
HINWEIS: Wenn 14 ml Rohre für diese Inkubation verwendet werden, legen Sie ein 14 ml Rohr in das 50 ml Rohr ein, mit einem Paar Kunststoffringhalter, um das Innenrohr in der Mitte des 50 ml Rohres zu halten. - Schalten Sie den Hybridisierungsofen ein.
- Inkubieren Sie die Membran mit 6 Rpm-Drehung für mindestens 5 min.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Membran jederzeit an der Wand haftet und dass das (innere) Rohr horizontal ist, um die Membran gleichmäßig mit der Antikörperlösung zu bedecken. Kalibrieren Sie die Verdünnung des Antikörpers und die Inkubationszeit vor dem eigentlichen Experiment.
4. Membranwäsche
- Beenden Sie die Drehung.
- Entfernen Sie die PVDF-Membran vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Rohr und legen Sie die Membran in einen Behälter mit 50 ml PBS-T.
- Spülen Sie die Membran kurz mit PBS-T.
- Spülen Sie die Membran im Behälter mit destilliertem Wasser, bis keine Blasen auftreten. Dadurch wird der Großteil des Antikörpers entfernt.
- Übertragen Sie die PVDF-Membran aus dem Behälter auf den Salatspinner, der 250 ml PBS-T enthält.
- Legen Sie den Siebkorb in den Spinner. Stellen Sie sicher, dass der Deckel sicher aufgesetzt wurde.
- Aktivieren Sie den Spinner und führen Sie ihn für ca. 20-30 s aus.
- Entsorgen Sie die Lösung und spülen Sie das Innere des Spinners kurz mit destilliertem Wasser ab.
- Fügen Sie 250 ml PBS-T wieder in den Spinner ein.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.6 und 4.7.
5. Inkubation mit dem sekundären Antikörper
- Bereiten Sie 10% Immunreaktionsverbesserungsmittel-2-Lösung (IRE-2) mit destilliertem Wasser vor. Wirbel gut.
- Bereiten Sie den verdünnten Sekundärantikörper mit 10% IRE-2 vor. Mischen Sie es sanft und gründlich.
- Wählen Sie das Volumen der Antikörperlösung und des Rohres gemäß Schritt 3.3 aus.
- Nehmen Sie die PVDF-Membran mit einer Pinzette auf und lassen Sie die Lösung kurz abtropfen. Setzen Sie die PVDF-Membran gemäß Schritt 3.4 in das Rohr ein.
- Legen Sie das 50 ml-Rohr für den Hybridisierungsofen in eine Glasflasche ein.
- Schalten Sie den Hybridisierungsofen ein.
- Inkubieren Sie die Membran mit 6 Rpm-Drehung für mindestens 5 min. Stellen Sie sicher, dass die Membran jederzeit an der Wand haftet und dass das (innere) Rohr horizontal ist, um die Membran gleichmäßig mit der Antikörperlösung zu bedecken.
HINWEIS: Kalibrieren Sie die Inkubationszeit vor dem eigentlichen Experiment. Wenn der sekundäre Antikörper fluoreszierend konjugiert ist, führen Sie die Inkubation im Dunkeln durch.
6. Membranwäsche
- Folgen Sie den Schritten 4.1 bis 4.10.
7. Bildaufnahme
- Chemilumineszenz-Erkennung
- Legen Sie ein Stück halbtransplantierender flexibler Folie (10 cm x 15 cm) auf eine flache Oberfläche.
- Mischen Sie 2 Komponenten des chemilumineszierenden Substrats in einem 5 ml Rohr.
- 1,5 ml des Mischsubstrats sofort auf die halbtransplantierbare flexible Folie übertragen und die PVDF-Membran darauf legen. Dann übertragen Sie den Rest der Substratlösung auf die Membran.
- Inkubieren Sie die PVDF-Membran mit dem gemischten Substrat auf einer halbtransparenten flexiblen Folie für 1 min.
- Nehmen Sie die PVDF-Membran mit einer Pinzette auf und entleeren Sie die Substratlösung kurz.
- Sandwich die Membran zwischen einem Paar Von-Transparenz-Filme.
- Erfassen Sie das Bild im chemilumineszierenden Modus.
- Fluoreszierende Detektion
- Nehmen Sie die PVDF-Membran mit einer Pinzette auf und lassen Sie die Lösung kurz abtropfen.
- Sandwich die Membran zwischen einem Paar Von-Transparenz-Filme.
- Erfassen Sie das Bild im Fluoreszenzmodus.
HINWEIS: Die Schritte 7.1 und 7.2 sollten in unmittelbarer Nähe zur Bildverarbeitungsmaschine durchgeführt werden, um eine maximale Empfindlichkeit zu gewährleisten. - Wenn das Hintergrundsignal hoch ist, führen Sie einen Waschschritt in einem Behälter mit 80-100 ml PBS-T durch: 10 min Spülen 3 mal für den primären Antikörper und 5 min Spülung 6 mal für den sekundären Antikörper.
HINWEIS: Sowohl primäre als auch sekundäre Antikörper, die mit 10% IRE-Lösungen verdünnt werden, können bis zu 8-10-mal ohne Verlust derEmpfindlichkeit6 verwendet werden. Die Lösung sollte bis zu einem Monat bei 4 °C aufbewahrt werden.
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Representative Results
Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirksamkeit der CDR-Methode zusammen mit der immunverstärkenden Technologie auf Western Blot. Die statische Inkubation erfolgte auf einem halbtransparenten flexiblen Film, bei dem PVDF-Membranen mit der Antikörperlösung inkubiert wurden, während die CDR-Inkubation in einem Hybridisierungsofen durch rotierende Rohre erfolgte, die die Membranen und die Antikörperlösung enthielten (Movie). Abbildung 2 zeigte Mengen an Antigen und Antikörpern, die für den chemilumineszierenden Nachweis auf westlichen Flecken erforderlich sind. Sowohl in statischen als auch in CDR-Inkubationen erhöhte die Verwendung der IRE-Lösung die Empfindlichkeit: IRE reduzierte die niedrigste Menge an Zelllysaten (Antigen), die benötigt wurde, um ß-Actin von 2,2 g auf 1,1 g unter statischen Bedingungen zu erkennen, und reduzierte sich mit CDR weiter von 1,1 auf 0,275 g (Abbildung 2A). In ähnlicher Weise wurde die Mindestkonzentration von Anti-6x His tag Antikörper von 100 ng/ml auf 50 ng/ml unter statischen Bedingungen und von 100 ng/ml auf 12,5 ng/ml unter CDR-Bedingungen gesenkt (Abbildung 2B). Die CDR-Inkubation für 5 min oder 10 min senkte die Nachweisgrenze im Vergleich zur statischen Inkubation (60 min mit primärer und 30 min mit sekundären Antikörpern). Schließlich zeigte die Kombination von CDR mit IRE auch innerhalb dieser extrem kurzen Inkubationszeit eine überlegene Empfindlichkeit auf dem westlichen Fleck (0,275 g Zelllysate zur ß-Aktin-Erkennung und 12,5 ng/ml Anti-6x His tag Antikörper).
Das zweite Beispiel zeigt die erfolgreiche Anwendung dieser Methode auf einen westlichen Blot mit Fluoreszenzdetektion (Abbildung 3). Die fluoreszierende Detektion hat im Gegensatz zur chemilumineszierenden Detektion die einzigartige Fähigkeit, mehrere Ziele auf demselben Fleck gleichzeitig zu erkennen, ohne Antikörper zu entfernen/re-probing. (Seine) 6 markierte AP- und ß-Actin in den Zelllysaten wurden gleichzeitig mit einem zweifarbigen Fluorophor nachgewiesen. Die CDR-Inkubation mit IRE beschleunigte nicht nur die Erkennung, sondern erhöhte auch die Empfindlichkeit, was dazu führte, dass der Abbau von (His)6 mit Tags AP(Abbildung 3A)entlarvt wurde .
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Methode der zyklischen Entleerung (CDR).
(A) Eine Erschöpfungsschicht in der Nähe der Membran bildet sich unter statischen Bedingungen schnell, wenn eine Sonde eine hohe Affinität zum Antigen hat, aber eine begrenzte Fähigkeit, durch die Lösung zu diffundieren. So wird das Reisen der Sonde zur Membran zu einem geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt und lange Inkubationszeiten kompensieren die Massentransferbegrenzung. (B) CDR-Methode durch Drehen des Rohres, während die Membran an der Wand haftet, eliminiert die Erschöpfungsschicht und füllt die gleiche Sondenlösung auf, um die Sondenkonzentration in der Nähe der Membran konstant zu halten. Diese Zahl wurde von Higashi et al.6geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: (A) Unterschiedliche Mengen von 293 Zelllysaten (1:2 serielle Verdünnungen ab 8,8 g/Spur) wurden durch SDS-PAGE getrennt, gefolgt von der Übertragung auf eine PVDF-Membran und der Blockierung mit 5% Magermilch in PBS-T. Der Blot wurde mit Maus-Anti-ß-Actin-Antikörpern (1:3.000 Verdünnung) untersucht. (B) Nach der Trennung von konditionierten Medien aus transfizierten 293 Zellen mit pAPTAG5 (GenHunter) mit der sezernierten (Seine)6 getaggten alkalischen Phosphatase (AP, 8 x 10-14 mol/Lane) wurden Proteine in PVDF-Membranen übertragen. Jede Membran wurde einem westlichen Blot mit unterschiedlichen Konzentrationen von Anti-6x His Tag Antikörper (1:2 serielle Verdünnungen von 400 ng/ml) ausgesetzt. Die Membranen wurden als ein einziges Bild abgebildet und gepunktete Linien zeigen den Rand einzelner Membranen an. Diese Zahl wurde von Higashi et al.6geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Gleichzeitige Detektion mehrerer Ziele auf einem westlichen Fleck mit Fluoreszenzdetektion und CDR in Verbindung mit IRE.
Verschiedene Mengen an Lysaten (1:2 serielle Verdünnungen aus 10 g/Spur) aus 293 mit pAPTAG5 transfizierten Zellen wurden abgetrennt und auf eine PVDF-Membran übertragen. Nach der Blockierung mit dem Blocking Buffer zur Fluoreszenzdetektion (BFD) für 1 h wurde der Blot mit Anti-6X His-Tag und Anti-ß-Actin-Antikörpern untersucht, gefolgt von IRDye 800CW Ziege Anti-Kaninchen IgG und IRDye 680RD Ziege Anti-Maus-IgG. A: Antikörper, die mit 10% IRE-Lösung unter CDR-Bedingung verdünnt werden, B: Antikörper, die mit BFD verdünnt werden und 0,1% Tween20 unter statischem Zustand enthalten. Aufgrund der höheren Empfindlichkeit mit CDR- und IRE-Kombination wurde der Abbau von (Seinem)6 getaggten AP beobachtet. Diese Zahl wurde von Higashi et al.6geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Schematische Darstellung eines verbesserten und ultrahochschnellen CDR-Western-Blots im Vergleich zu einer herkömmlichen statischen Methode.
Diese Zahl wurde von Higashi et al.6geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Western Blot ist eine weit verbreitete analytische Technik zum Nachweis spezifischer Proteine, die vor 40 Jahren entwickelt wurde7,8. Seitdem hat sich die Technik weiterentwickelt, mit nachfolgenden Innovationen zur Verbesserung der Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Quantifizierung der Technik2,9,10,11,12,13. Das hier vorgestellte erweiterte Ultra-High-Speed-Western-Blotting-Protokoll stellt einige wesentliche Verbesserungen der bestehenden Technik dar. Wir reduzieren die Inkubationszeit, ohne die Empfindlichkeit zu opfern, indem wir die Erkennungsschwelle mit IRE senken. Es ist keine spezielle oder teure Ausrüstung erforderlich: Das Drehen eines Rohres in einem Hybridisierungsofen reicht aus, um MTL zu überwinden. Die wichtigste Neuerung ist, dass CDR die Erschöpfungsschicht im Test effektiv eliminiert. Obwohl ein Rollenkulturapparat häufig eingesetzt wird, um das Lösungsvolumen zu reduzieren, wurde das Potenzial dieser Methode, MTL zu überwinden und inkubationszeiten zu reduzieren, nicht dargestellt. Aufgrund der drastischen Verkürzung der Gesamtzeit für das gesamte Verfahren (Abbildung 4) können viel höhere Mengen westlicher Blotdaten pro Tag erhalten werden, wenn die blockierten Membranen in der Hand sind, was mit einem traditionellen westlichen Blotting-Protokoll fast unmöglich ist. Es sollte beachtet werden, dass die Inkubation der Membran auf einem Schaukelplattform-Shaker der statischen Inkubation4,6entspricht. Das Spülen von PVDF-Membranen in einem privaten kommerziellen Salatspinner mit einer großen Menge an Waschlösung verringert auch die Dauer des Verfahrens (Abbildung 4).
Die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls beruht auf der Optimierung der Antikörperverdünnung mit IRE-Lösung und Inkubationszeit. Zu Beginn der Tests wird eine breite Palette von Antikörpertitrationen empfohlen, da CDR in Verbindung mit IRE die Empfindlichkeit erheblich erhöht (Abbildung 2). Die Inkubationszeit ist ein weiterer zu berücksichtigender Faktor. Wenn man gute Western-Blot-Ergebnisse mit 1 h Inkubation mit primären Antikörpern unter statischen Bedingungen hat, könnte die Inkubationszeit unter CDR-Bedingungen im Allgemeinen auf 5-10 min reduziert werden. Wenn beispielsweise bei Primärantikörpern eine nächtliche Inkubation erforderlich ist, sollte eine etwas längere CDR-Inkubationszeit (30 min - 6 h) ausgewertet werden. Verdünnungs- und Inkubationszeit mit sekundären Antikörpern sind ebenfalls kritisch. Inkubationen von mehr als 30 min unter CDR-Bedingungen geben in der Regel einen höheren Hintergrund. Daher ist eine sorgfältige Titration von sekundären Antikörpern mit bis zu 30 min CDR-Inkubation erforderlich. Wenn das Hintergrundsignal nach sorgfältiger Titration von Antikörpern hoch ist, sollten umfangreiche Waschschritte (10 min Spülung 3 mal für den Primärantikörper und 5 min Spülung 6 mal für den Sekundärantikörper in einem Behälter mit 80-100 ml Waschlösung) durchgeführt werden.
Die Qualität der westlichen Blot-Daten hängt oft von den verwendeten Antikörpern ab. Wenn wir einen schwierigen Antikörper für Western Blot verwendet hatten, zeigten Proteinmarker manchmal auch nach sorgfältiger Antikörpertitration und ausgiebigem Waschen erhebliche Signale. Da wir festgestellt haben, dass die CDR-Methode mit IRE dazu neigt, die unspezifische Bindung zu erhöhen, kann die Zugabe von blockierenden Reagenzien (wie Magermilch und andere) in Antikörperverdünnungsmittel das Signal-Rausch-Verhältnis14verbessern. Es ist ein zeitaufwändiger Screening-Schritt, aber es lohnt sich, es zu versuchen.
Der westliche Fleck ist für quantitative Anwendungen wichtig geworden2. Eine Halbquantitation kann mit chemilumineszierender Detektion durchgeführt werden. Das hier vorgestellte Verfahren gilt für das Abisolieren und erneute Prüfen zu diesem Ende6. Aufgrund eines größeren Dynamikbereichs ist die Fluoreszenzdetektion die beste Option. Mit diesem Protokoll bietet die Fluoreszenzdetektion einen linearen Dynamikbereich für die quantitative Analyse6. Es ist erwähnenswert, dass die CDR-Inkubationszeit mit Fluoreszenzdetektion länger zu sein scheint als die mit chemilumineszierender Detektion.
Der Western Blot hat eine breite Palette von Anwendungen und bleibt eine universelle Methode, um Proteinreichtum, Protein-Protein-Wechselwirkungen und post-translationale Modifikationen zu untersuchen. Zum Beispiel können Anti-Kohlenhydrat-Antikörper leicht für Western Blot mit diesem Protokoll14verwendet werden. Da eine Vielzahl von Kohlenhydrat-Moieties, die auf der äußeren Oberfläche von Viralen, Bakterien und Fugus ausgedrückt werden, pathogenspezifisch sind, sind sie unschätzbare Ziele für die Erkennung von Krankheitserregern und die Diagnose von Infektionskrankheiten. So könnte die Anwendung dieses einfachen Protokolls viele Untersuchungsbereiche beeinflussen und stundenlange Wartezeiten nicht nur für Experimente, sondern auch für klinische Immundiagnostiken, die auf der westlichen Blotting-Technologie basieren, belasten.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen für den Inhalt dieses Artikels für unmittelbar relevant erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Intramurale Forschung, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, unterstützt. S.H. wurde vom Japan Public-Private Partnership Student Study Abroad Program unterstützt, und H.N. und K.Y. waren von Valor und V Drug Overseas Training Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
References
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