Summary
Een ultrasnelle westerse blotting-techniek wordt ontwikkeld door de kinetiek van antigeen-antilichaambinding te verbeteren door middel van cyclische draining- en replenishing (CDR)-technologie in combinatie met een immunoreactieverhogend middel.
Abstract
Een westerse vlek (ook wel immunoblot) is een canonieke methode voor biomedisch onderzoek. Het wordt vaak gebruikt om de relatieve grootte en overvloed van specifieke eiwitten te bepalen, evenals post-translationele eiwitaanpassingen. Deze techniek heeft een rijke geschiedenis en wordt nog steeds op grote schaal gebruikt vanwege de eenvoud. De westelijke vlekprocedure duurt echter uren, zelfs dagen, om te voltooien, met een kritiek knelpunt zijn de lange incubatietijden die de doorvoer beperken. Deze incubatiestappen zijn nodig vanwege de langzame diffusie van antilichamen van de bulkoplossing naar de geïmmobiliseerde antigenen op het membraan: de antilichaamconcentratie in de buurt van het membraan is veel lager dan de bulkconcentratie. Hier presenteren we een innovatie die deze incubatie-intervallen drastisch vermindert door de antigeenbinding te verbeteren via cyclische afvoer en aanvulling (CDR) van de antilichaamoplossing. We gebruikten ook een immunoreactieverhogende technologie om de gevoeligheid van de test te behouden. Een combinatie van de CDR-methode met een commercieel immunoreactieverhogend middel verhoogde het uitgangssignaal en verminderde de incubatietijd van antilichamen aanzienlijk. De resulterende ultrasnelle westerse vlek kan in 20 minuten worden bereikt zonder verlies van gevoeligheid. Deze methode kan worden toegepast op westerse vlekken met behulp van zowel chemiluminescente als fluorescerende detectie. Dit eenvoudige protocol stelt onderzoekers in staat om de analyse van eiwitexpressie in veel monsters beter te onderzoeken.
Introduction
Een westerse vlek (ook bekend als een immunoblot) is een krachtige en fundamentele techniek in een breed scala aan wetenschappelijke en klinische disciplines. Deze techniek wordt gebruikt om de aanwezigheid, relatieve overvloed, relatieve moleculaire massa en post-translationele modificaties van eiwitten te onderzoeken1. In combinatie met digitale beeldanalyse kan deze methode op betrouwbare wijze de overvloed aan eiwitten en eiwitmodificaties analyseren2. Hoewel western blot routinematig wordt uitgevoerd, is het een tijdrovende en arbeidsintensieve methode. Lange incubaties van het antilichaam met membranen zijn vereist. Hier beschrijven we een wijziging van de incubatiemethode die deze beperking overwint zonder de gevoeligheid op te offeren.
Tijdens incubatie van het membraan zweven antilichamen in oplossing terwijl antigenen op het membraan worden geïmmobiliseerd. Vanwege hun hoge affiniteit is de snelheid van antilichaambinding aan het antigeen sneller dan de diffusie van antilichamen van de bulkoplossing naar het membraan. Hierdoor ontstaat een lage concentratie "uitputtingslaag" (figuur 1). Het kan uren duren voordat meer verre antilichamen het membraan bereiken via passieve diffusie, wat de belangrijkste factor is die verantwoordelijk is voor lange incubatietijden in deze techniek. Dit effect wordt de massatransportbeperking (MTL)3genoemd. Er is voorgesteld dat het herhaaldelijk aftappen en aanvullen van de antilichaambevattende oplossing de uitputtingslaag kan verstoren en MTL4kan overwinnen . Hier hebben we een unieke techniek ontwikkeld die dit cyclische draining and replenishing (CDR) concept implementeert om het effect van MTL in een traditioneel westers blotting protocol te verminderen en de vereiste incubatietijd te verkorten.
Om de detectiegevoeligheid met een korte incubatietijd te behouden, hebben we gebruik gemaakt van een immunoreactieverhogende technologie die de antigeen-antilichaamreactie versnelt, waardoor de signaal-ruisverhouding5wordt verbeterd. Veel in de handel verkrijgbare immunoreactieverhogende middelen (IRE) bestaan uit 2 componenten (oplossing 1 en 2, zie tabel met materialen). De eigen samenstelling of werkingsmechanisme van IRE is niet bekendgemaakt, maar we hebben eerder vastgesteld dat IRE de dissociatieconstante tussen het antigeen en het antilichaam in vastefasebindende tests heeft verminderd, wat erop wijst dat verhoogde affiniteit ten minste gedeeltelijk verantwoordelijk is voor het versterkende effect van IRE6. De combinatie van CDR met IRE levert een ultrasnel westers vlekkenprotocol op dat de hele proceduretijd vermindert zonder in te boeten aan gevoeligheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SDS-PAGE en overdracht naar een PVDF-membraan
- Voer SDS-PAGE uit om eiwitten te scheiden op basis van de relatieve grootte.
OPMERKING: Elk commercieel of zelfgemaakt gelsysteem is prima. Volg het protocol van de fabrikant. - Breng gescheiden eiwitten van een gel over op een PVDF-membraan.
OPMERKING: Gemeenschappelijke overdrachtsmethoden (halfdroge of natte overdracht) zijn geschikt. Volg het protocol van de fabrikant.
2. Blokkeren van PVDF membranen
- Incubeer de membranen gedurende 1 uur in geschikte blokkeerbuffers met agitatie bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Afhankelijk van het primaire antilichaam en detectiesysteem moet een geschikte blokkeringsbuffer worden geselecteerd. De meest typische blokkers zijn bijvoorbeeld BSA, vetvrije droge melk, caseïne en commerciële synthetische polymeren. PBS en/of TBS met 0,1% Tween20 zijn de meest gebruikte buffers. Deze blokkeringsstap kan 's nachts bij 4 °C worden uitgevoerd.
3. Incubatie met primair antilichaam
- Bereid 10% immunoreactieverhogende agent-1-oplossing (IRE-1) met gedestilleerd water. Vortex goed.
- Bereid het verdunde primaire antilichaam voor met 10% IRE-1. Meng het voorzichtig en grondig.
- Als u een groter membraan (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm) gebruikt, voeg dan 8 ml van de antilichaamoplossing toe aan conische centrifugebuizen van 50 ml. Als u een kleiner membraan (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm) gebruikt, voeg dan 3 ml van de antilichaamoplossing toe aan 14 ml polypropyleenbuis met ronde bodem(materialentabel).
- Pak het PVDF-membraan op met een pincet en laat de blokkeeroplossing kort leeglopen. Steek het PVDF-membraan met gehandschoende vingers in deze buis en zorg ervoor dat het hele membraan aan de wand van de buis hecht. Wanneer het PVDF-membraan in een buis wordt gestoken, kijk dan naar de "eiwitzijde" van het membraan dat oorspronkelijk in contact kwam met de gel naar binnen. Sluit de dop goed.
- Steek de buis van 50 ml in een glazen fles voor de hybridisatieoven.
OPMERKING: Wanneer voor deze incubatie 14 ml buizen worden gebruikt, plaatst u een buis van 14 ml in de buis van 50 ml, met behulp van een paar plastic ringhouders om de binnenband in het midden van de buis van 50 ml te houden. - Zet de hybridisatieoven aan.
- Incubeer het membraan met 6 tpm rotatie gedurende ten minste 5 minuten.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het membraan te allen tijde aan de muur hecht en dat de (binnen)buis horizontaal is om het membraan gelijkmatig te bedekken met de antilichaamoplossing. Kalibreer de verdunning van het antilichaam en de incubatietijd voorafgaand aan het eigenlijke experiment.
4. Membraanwas
- Stop de rotatie.
- Verwijder voorzichtig het PVDF-membraan met een pincet uit de buis en plaats het membraan in een container met 50 ml PBS-T.
- Spoel het membraan kort af met PBS-T.
- Spoel het membraan in de container af met gedestilleerd water totdat er geen bubbels verschijnen. Dit is om het grootste deel van het antilichaam te verwijderen.
- Breng het PVDF-membraan over van de container naar de saladespinner die 250 ml PBS-T bevat.
- Plaats de zeefmand in de spinner. Zorg ervoor dat het deksel goed is aangebracht.
- Activeer de spinner en voer deze ongeveer 20-30 s uit.
- Gooi de oplossing weg en spoel de binnenkant van de spinner kort af met gedestilleerd water.
- Voeg weer 250 ml PBS-T toe aan de spinner.
- Herhaal stap 4.6 en 4.7.
5. Incubatie met het secundaire antilichaam
- Bereid 10% immunoreactieverhogende agent-2-oplossing (IRE-2) met gedestilleerd water. Vortex goed.
- Bereid het verdunde secundaire antilichaam voor met 10% IRE-2. Meng het voorzichtig en grondig.
- Selecteer het volume van de antilichaamoplossing en -buis zoals vermeld in stap 3.3.
- Pak het PVDF-membraan op met een pincet en laat de oplossing kort uitlekken. Steek het PVDF-membraan in de buis zoals vermeld in stap 3.4.
- Steek de buis van 50 ml in een glazen fles voor de hybridisatieoven.
- Zet de hybridisatieoven aan.
- Incubeer het membraan met 6 tpm rotatie gedurende ten minste 5 minuten. Zorg ervoor dat het membraan te allen tijde aan de muur hecht en dat de (binnen)buis horizontaal is om het membraan gelijkmatig te bedekken met de antilichaamoplossing.
OPMERKING: Kalibreer de incubatietijd voorafgaand aan het eigenlijke experiment. Wanneer het secundaire antilichaam fluorescerend is geconjugeerd, voert u de incubatie in het donker uit.
6. Membraanwas
- Volg stap 4.1 tot en met 4.10.
7. Beeldverwerving
- Chemiluminescente detectie
- Plaats een stuk semi-transplantatie flexibele film (10 cm x 15 cm) op een vlakke ondergrond.
- Meng 2 componenten van het chemiluminescente substraat in een buis van 5 ml.
- Breng onmiddellijk 1,5 ml van het gemengde substraat over op de semitransplantatie flexibele film en plaats het PVDF-membraan erop. Breng vervolgens de rest van de substraatoplossing over op het membraan.
- Incubeer het PVDF-membraan met het gemengde substraat gedurende 1 minuut op een semi-transparante flexibele film.
- Pak het PVDF-membraan op met een pincet en laat de substraatoplossing kort uitlekken.
- Sandwich het membraan tussen een paar transparantiefilms.
- Verkrijg het beeld in de chemiluminescente modus.
- Fluorescerende detectie
- Pak het PVDF-membraan op met een pincet en laat de oplossing kort uitlekken.
- Sandwich het membraan tussen een paar transparantiefilms.
- Verkrijg de afbeelding in de fluorescerende modus.
OPMERKING: De stappen 7.1 en 7.2 moeten in de nabijheid van de beeldvormingsmachine worden uitgevoerd om een maximale gevoeligheid te garanderen. - Wanneer het achtergrondsignaal hoog is, voert u een wasstap uit in een container met 80-100 ml PBS-T: 10 minuten spoelen 3 keer voor het primaire antilichaam en 5 minuten spoelen 6 keer voor het secundaire antilichaam.
OPMERKING: Zowel primaire als secundaire antilichamen verdund met 10% IRE-oplossingen kunnen tot 8-10 keer worden gebruikt zonder verlies van gevoeligheid6. De oplossing moet tot 1 maand op 4 °C worden bewaard.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit voorbeeld illustreert de effectiviteit van de CDR-methode samen met immuno-fenhancingtechnologie op western blot. Statische incubatie werd uitgevoerd op een semi-transparante flexibele film waar PVDF-membranen werden geïncubeerd met de antilichaamoplossing, terwijl cdr-incubatie zich in een hybridisatieoven bevond door roterende buizen die de membranen en de antilichaamoplossing bevatten (Movie). Figuur 2 toonde de hoeveelheden antigeen en antilichamen die nodig zijn voor chemiluminescente detectie op westelijke vlekken. Bij zowel statische als CDR-incubaties verhoogde het gebruik van IRE-oplossing de gevoeligheid: IRE verminderde de laagste hoeveelheid cellysaten (antigeen) die nodig was om ß-actine te detecteren van 2,2 μg naar 1,1 μg onder statische omstandigheden en daalde verder van 1,1 μg naar 0,275 μg met cdr (figuur 2A). Evenzo werd de minimumconcentratie van anti-6x His tag antibody verlaagd van 100 ng/ml naar 50 ng/ml onder statische omstandigheden en van 100 ng/ml naar 12,5 ng/ml onder CDR-toestand (figuur 2B). Cdr-incubatie gedurende 5 min of 10 min verlaagde de detectielimiet drastisch in vergelijking met statische incubatie (60 min met primaire en 30 min met secundaire antilichamen). Ten slotte toonde de combinatie van CDR met IRE een superieure gevoeligheid op de westelijke vlek (0,275 μg cellysaten voor ß-actinedetectie en 12,5 ng/ml anti-6x His tag antilichaam) zelfs binnen deze extreem korte incubatieperiode.
Het tweede voorbeeld toont de succesvolle toepassing van deze methode op een westelijke vlek met fluorescerende detectie (figuur 3). Fluorescerende detectie heeft, in tegenstelling tot chemiluminescente detectie, het unieke vermogen om meerdere doelen tegelijkertijd op dezelfde vlek te detecteren zonder antilichamen te strippen / opnieuw te onderzoeken. (Zijn) 6 getagd AP en ß-actine in de cel lysates werden tegelijkertijd gedetecteerd met behulp van een tweekleurige fluorofore. CDR incubatie met IRE versnelde niet alleen de detectie, maar verhoogde ook de gevoeligheid, wat resulteerde in het ontmaskeren van de afbraak van (Zijn)6 getagde AP (Figuur 3A).
Figuur 1: Schematische illustratie van de cyclische draining-replenishing (CDR) methode.
(A) Een uitputtingslaag in de buurt van het membraan vormt zich snel onder statische omstandigheden wanneer een sonde een hoge affiniteit heeft met het antigeen, maar een beperkt vermogen om door de oplossing te diffunderen. Zo wordt de verplaatsing van de sonde naar het membraan een snelheidsbeperkende stap en compenseren lange incubatietijden de beperking van de massaoverdracht. (B) CDR-methode door de buis te draaien terwijl het membraan aan de muur hecht, elimineert de uitputtingslaag en vult dezelfde sondeoplossing aan om de sondeconcentratie in de buurt van het membraan constant te houden. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Higashi et al.6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: (A) Verschillende hoeveelheden 293 cellysaten (1:2 seriële verdunningen van 8,8 μg/lane) werden gescheiden door SDS-PAGE, gevolgd door overdracht naar een PVDF-membraan en blokkering met 5% magere melk in PBS-T. De vlek werd onderzocht met muis anti-ß-actine antilichaam (1:3.000 verdunning). (B) Na scheiding van geconditioneerde media afgeleid van getransfecteerde 293 cellen met pAPTAG5 (GenHunter) met daarin de afgescheiden (His)6 tagged alkalische fosfatase (AP, 8 x 10-14 mol/lane), werden eiwitten overgebracht naar PVDF-membranen. Elk membraan werd onderworpen aan westelijke vlek met verschillende concentraties anti-6x Zijn tag antilichaam (1:2 seriële verdunningen van 400 ng/ml). De membranen werden als één beeld in beeld gesteld en stippellijnen geven de rand van individuele membranen aan. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Higashi et al.6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gelijktijdige detectie van meerdere doelen op een westelijke vlek met behulp van fluorescentiedetectie en CDR in combinatie met IRE.
Verschillende hoeveelheden lysaten (1:2 seriële verdunningen van 10 μg/lane) van 293 cellen getransfecteerd met pAPTAG5 werden gescheiden en overgebracht naar een PVDF-membraan. Na het blokkeren met de Blocking Buffer voor fluorescentiedetectie (BFD) gedurende 1 uur, werd de vlek onderzocht met anti-6X His tag en anti ß-actine antilichamen, gevolgd door IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG en IRDye 680RD goat anti-mouse IgG. A: antilichamen verdund met 10% IRE-oplossing onder CDR-toestand, B: antilichamen verdund met BFD die 0,1% Tween20 bevatten onder statische toestand. Door een hogere gevoeligheid met CDR en IRE combinatie werd de degradatie van (Zijn)6 tagged AP gezien. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Higashi et al.6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Schematische illustratie van een verbeterde en ultrasnelle CDR western vlek in vergelijking met een traditionele statische methode.
Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Higashi et al.6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Western blot is een veel gebruikte analytische techniek om specifieke eiwitten te detecteren die ~40 jaar geleden werd ontwikkeld7,8. Sindsdien is de techniek verder geëvolueerd, waarbij latere innovaties de gevoeligheid, snelheid en kwantificering van de techniekverbeterden 2,9,10,11,12,13. Het verbeterde ultrasnelle westerse blottingprotocol dat hier wordt gepresenteerd, maakt verschillende substantiële verbeteringen aan de bestaande techniek. We verkorten de incubatietijd zonder in te boeten aan gevoeligheid door de detectiedrempel te verlagen met IRE. Er is geen speciale of dure apparatuur nodig: het draaien van een buis in een hybridisatieoven is voldoende om MTL te overwinnen. De belangrijkste innovatie is dat CDR effectief de uitputtingslaag in de test elimineert. Hoewel een roller-culture apparaat vaak wordt gebruikt om het volume van de oplossing te verminderen, is het potentieel van deze methode om MTL te overwinnen en incubatietijden te verminderen niet geïllustreerd. Vanwege de drastische vermindering van de totale tijd voor de hele procedure (figuur 4), kunnen veel hogere hoeveelheden westerse vlekgegevens per dag worden verkregen wanneer de geblokkeerde membranen in de hand liggen, wat bijna onmogelijk is om dit te doen met een traditioneel westers vlekprotocol. Opgemerkt moet worden dat incubatie van het membraan op een schommelplatformschudd is gelijk aan statische incubatie4,6. Het spoelen van PVDF-membranen in een huishoudelijke commerciële saladespinner met een groot volume wasoplossing vermindert ook de duur van de procedure (figuur 4).
Het succesvolle gebruik van dit protocol is afhankelijk van de optimalisatie van de antilichaamverdunning met IRE-oplossing en incubatietijd. Aan het begin van de tests wordt een breed scala aan antilichaamtitratie aanbevolen, omdat CDR in combinatie met IRE de gevoeligheid aanzienlijk verhoogt (figuur 2). Incubatietijd is een andere factor die in overweging moet worden genomen. Wanneer men goede westerse vlekresultaten heeft met 1 uur incubatie met primaire antilichamen onder statische omstandigheden, kan de incubatietijd worden teruggebracht tot 5-10 min onder CDR-omstandigheden in het algemeen. Wanneer 's nachts incubatie nodig is met primaire antilichamen bijvoorbeeld, moet een iets langere CDR-incubatietijd (30 min - 6 uur) worden geëvalueerd. Verdunning en incubatietijd met secundaire antilichamen zijn ook van cruciaal belang. Incubaties groter dan 30 minuten onder CDR-omstandigheden geven meestal een hogere achtergrond. Daarom is zorgvuldige titratie van secundaire antilichamen vereist met maximaal 30 minuten CDR-incubatie. Wanneer het achtergrondsignaal hoog is na zorgvuldige titratie van antilichamen, moeten uitgebreide wasstappen (10 minuten spoelen 3 keer voor het primaire antilichaam en 5 minuten spoelen 6 keer voor het secundaire antilichaam in een container met 80-100 ml wasoplossing) worden uitgevoerd.
De kwaliteit van de westerse vlekgegevens hangt vaak af van de gebruikte antilichamen. Toen we een moeilijk antilichaam hadden dat werd gebruikt voor western blot, vertoonden eiwitmarkers soms substantiële signalen, zelfs na zorgvuldige antilichaamtitratie en uitgebreid wassen. Aangezien we merkten dat de CDR-methode met IRE de neiging heeft om de niet-specifieke binding te verhogen, kan toevoeging van blokkerende reagentia (zoals magere melk en anderen) in antilichaamverdunningsmiddelen de signaal-ruisverhouding verbeteren14. Het is een tijdrovende screeningstap, maar het is het proberen waard.
De westelijke vlek is belangrijk geworden voor kwantitatieve toepassingen2. Een semi-kwantificering kan worden uitgevoerd met chemiluminescente detectie. De hier gepresenteerde procedure is van toepassing op het strippen en opnieuw onderzoeken daartoe6. Door een breder dynamisch bereik is fluorescerende detectie de beste optie. Met dit protocol biedt fluorescentiedetectie een lineair dynamisch bereik voor kwantitatieve analyse6. Het is vermeldenswaard dat de CDR-incubatietijd met fluorescerende detectie langer lijkt dan die met chemiluminescente detectie.
De westelijke vlek heeft een breed scala aan toepassingen en blijft een universele methode om eiwitrijkdom, eiwitinteracties en post-translationele modificaties te bestuderen. Anti-koolhydraatantilichamen kunnen bijvoorbeeld gemakkelijk worden gebruikt voor westerse vlekken met dit protocol14. Omdat een verscheidenheid aan koolhydraatmoieties uitgedrukt op het buitenoppervlak van virale, bacteriële en fugus ziekteverwekkerspecifiek zijn, zijn ze van onschatbare waarde voor de herkenning van pathogenen en de diagnose van infectieziekten. De toepassing van dit eenvoudige protocol kan dus van invloed zijn op veel onderzoeksgebieden, scheeruren van wachttijden, niet alleen voor experimenten, maar ook voor klinische immunodiagnostiek die afhankelijk zijn van westerse vlektechnologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende belangen verklaard die rechtstreeks relevant zijn voor de inhoud van dit artikel.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de afdeling Intramuraal Onderzoek, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health. S.H. werd ondersteund door Japan Public-Private Partnership Student Study Abroad Program, en H.N. en K.Y. waren door Valor en V Drug Overseas Training Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
References
- MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
- Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
- Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
- Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html (2020).
- Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
- Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852 (2016).
- Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
- Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).
