Summary
Una técnica de distensión occidental de ultra alta velocidad se desarrolla mejorando la cinética de la unión antígeno-anticuerpo a través de la tecnología de drenaje cíclico y reposición (CDR) junto con un agente que mejora la inmunorreacción.
Abstract
Una mancha occidental (también conocida como inmunoblot) es un método canónico para la investigación biomédica. Se utiliza comúnmente para determinar el tamaño relativo y la abundancia de proteínas específicas, así como modificaciones de proteínas post-traslacionales. Esta técnica tiene una rica historia y permanece en uso generalizado debido a su simplicidad. Sin embargo, el procedimiento de hinchazón occidental famosamente toma horas, incluso días, para completar, con un cuello de botella crítico siendo los largos tiempos de incubación que limitan su rendimiento. Estos pasos de incubación son necesarios debido a la lenta difusión de anticuerpos de la solución a granel a los antígenos inmovilizados en la membrana: la concentración de anticuerpos cerca de la membrana es mucho menor que la concentración a granel. Aquí, presentamos una innovación que reduce drásticamente estos intervalos de incubación mediante la mejora de la unión de antígenos a través del drenaje cíclico y la reposición (CDR) de la solución de anticuerpos. También utilizamos una tecnología de mejora de la inmunorreacción para preservar la sensibilidad del ensayo. Una combinación del método CDR con un agente comercial de mejora de la inmunorreacción aumentó la señal de salida y redujo sustancialmente el tiempo de incubación de anticuerpos. La mancha occidental de ultra alta velocidad resultante se puede lograr en 20 minutos sin ninguna pérdida de sensibilidad. Este método se puede aplicar a las manchas occidentales utilizando detección quimioluminiscente y fluorescente. Este sencillo protocolo permite a los investigadores explorar mejor el análisis de la expresión proteica en muchas muestras.
Introduction
Una mancha occidental (también conocida como inmunoblot) es una técnica poderosa y fundamental en una amplia gama de disciplinas científicas y clínicas. Esta técnica se utiliza para examinar la presencia, la abundancia relativa, la masa molecular relativa y las modificaciones post-traslacionales de las proteínas1. Combinado con el análisis de imágenes digitales, este método puede analizar de forma fiable la abundancia de proteínas y modificaciones de proteínas2. Aunque la mancha occidental se realiza de forma rutinaria, es un método que consume mucho tiempo y requiere mucho trabajo. Se requieren largas incubaciones del anticuerpo con membranas. Aquí, describimos una modificación del método de incubación que supera esta limitación sin sacrificar la sensibilidad.
Durante la incubación de la membrana, los anticuerpos flotan en solución mientras que los antígenos se inmovilizan en la membrana. Debido a su alta afinidad, la tasa de unión de anticuerpos al antígeno es más rápida que la difusión de anticuerpos de la solución a granel a la membrana. Esto crea una "capa de agotamiento" de baja concentración (Figura 1). Los anticuerpos más distantes pueden tardar horas en llegar a la membrana a través de la difusión pasiva, que es el principal factor responsable de los largos tiempos de incubación en esta técnica. Este efecto se denomina limitación de transporte masivo (MTL)3. Se ha propuesto que el drenaje repetitivo y la reposición de la solución que contiene anticuerpos puedan interrumpir la capa de agotamiento y superar el MTL4. Aquí, hemos ideado una técnica única que implementa este concepto cíclico de drenaje y reposición (CDR) para disminuir el efecto de MTL en un protocolo tradicional de hinchazón occidental y acortar notablemente el período de incubación requerido.
Con el fin de mantener la sensibilidad de detección con un corto tiempo de incubación, hicimos uso de una tecnología de mejora de la inmunorreacción que acelera la reacción antígeno-anticuerpo, mejorando así la relación señal-ruido5. Muchos agentes de mejora de inmunorreacción disponibles comercialmente (IRE) constan de 2 componentes (Solución 1 y 2, véase Tabla de Materiales). La composición o mecanismo de acción patentado de la IRE no se ha divulgado, pero hemos encontrado previamente que la IRE disminuyó la constante de disociación entre el antígeno y el anticuerpo en ensayos de unión de fase sólida, lo que indica que el aumento de la afinidad es, al menos en parte, responsable del efecto de mejora del IRE6. La combinación de CDR con IRE produce un protocolo de distensión occidental de ultra alta velocidad que reduce todo el tiempo de procedimiento sin sacrificar la sensibilidad.
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Protocol
1. SDS-PAGE y transferir a una membrana PVDF
- Realice SDS-PAGE para separar las proteínas en función del tamaño relativo.
NOTA: Cualquier sistema de gel comercial o casero está bien. Por favor, siga el protocolo del fabricante. - Transfiera proteínas separadas de un gel a una membrana PVDF.
NOTA: Los métodos de transferencia comunes (transferencia semi-seca o húmeda) son adecuados. Por favor, siga el protocolo del fabricante.
2. Bloqueo de membranas PVDF
- Incubar las membranas en amortiguadores de bloqueo adecuados durante 1 h con agitación a temperatura ambiente.
NOTA: Dependiendo del anticuerpo principal y del sistema de detección, se debe seleccionar un búfer de bloqueo adecuado. Por ejemplo, los bloqueadores más típicos son BSA, leche seca sin grasa, caseína y polímeros sintéticos comerciales. PBS y/o TBS con 0,1% Tween20 son los búferes más utilizados. Este paso de bloqueo se puede realizar durante la noche a 4 °C.
3. Incubación con anticuerpo primario
- Prepare una solución agente-1 que mejore la inmunorreacción al 10% (IRE-1) con agua destilada. Vórtice bien.
- Prepare el anticuerpo primario diluido con un 10% IRE-1. Mézclalo suave y a fondo.
- Si utiliza una membrana más grande (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm), agregue 8 ml de la solución de anticuerpos en tubos centrífugas cónicos de 50 ml. Si utiliza una membrana más pequeña (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm), agregue 3 ml de la solución de anticuerpos en tubo de polipropileno de fondo redondo de 14 ml (Tabla de materiales).
- Recoja la membrana PVDF con pinzas y escurra brevemente la solución de bloqueo. Inserte la membrana PVDF en este tubo con los dedos enguantados y asegúrese de que toda la membrana se adhiere a la pared del tubo. Cuando la membrana PVDF se inserta en un tubo, se enfrenta al "lado proteico" de la membrana que originalmente estaba en contacto con el gel hacia adentro. Cierre bien la tapa.
- Inserte el tubo de 50 ml en una botella de vidrio para el horno de hibridación.
NOTA: Cuando se utilicen tubos de 14 ml para esta incubación, inserte un tubo de 14 ml en el tubo de 50 ml, utilizando un par de soportes de anillo de plástico para mantener el tubo interno en el centro del tubo de 50 ml. - Encienda el horno de hibridación.
- Incubar la membrana con rotación de 6 rpm durante al menos 5 minutos.
NOTA: Asegúrese de que la membrana se adhiere a la pared en todo momento y de que el tubo (interno) es horizontal para cubrir la membrana con la solución de anticuerpos uniformemente. Calibrar la dilución del anticuerpo y el tiempo de incubación antes del experimento real.
4. Lavado de membrana
- Detenga la rotación.
- Retire cuidadosamente la membrana PVDF del tubo con pinzas y coloque la membrana en un recipiente con 50 ml de PBS-T.
- Enjuague brevemente la membrana con PBS-T.
- Enjuague la membrana del recipiente con agua destilada hasta que no aparezcan burbujas. Esto es para eliminar la mayoría del anticuerpo.
- Transfiera la membrana PVDF del recipiente al hilandero de ensalada que contiene 250 ml de PBS-T.
- Coloque la cesta del colador en el spinner. Asegúrese de que la tapa se haya puesto de forma segura.
- Activa el spinner y corre durante unos 20-30 s.
- Deseche la solución y enjuague brevemente el interior del hilandero con agua destilada.
- Agregue 250 mL de PBS-T en el spinner otra vez.
- Repita los pasos 4.6 y 4.7.
5. Incubación con el anticuerpo secundario
- Prepare una solución agente-2 que mejore la inmunorreacción al 10% (IRE-2) con agua destilada. Vórtice bien.
- Prepare el anticuerpo secundario diluido con un 10% IRE-2. Mézclalo suave y a fondo.
- Seleccione el volumen de la solución de anticuerpos y el tubo como se indica en el paso 3.3.
- Recoja la membrana PVDF con pinzas y escurra la solución brevemente. Inserte la membrana PVDF en el tubo como se indica en el paso 3.4.
- Inserte el tubo de 50 ml en una botella de vidrio para el horno de hibridación.
- Encienda el horno de hibridación.
- Incubar la membrana con rotación de 6 rpm durante al menos 5 minutos. Asegúrese de que la membrana se adhiere a la pared en todo momento y de que el tubo (interno) es horizontal para cubrir uniformemente la membrana con la solución de anticuerpos.
NOTA: Calibrar el tiempo de incubación antes del experimento real. Cuando el anticuerpo secundario esté conjugado fluorescentemente, realice la incubación en la oscuridad.
6. Lavado de membrana
- Siga los pasos 4.1 a 4.10.
7. Adquisición de imágenes
- Detección de quimioluminiscentes
- Coloque una pieza de película flexible semi-trasplantada (10 cm x 15 cm) sobre una superficie plana.
- Mezcle 2 componentes del sustrato quimioluminiscente en un tubo de 5 ml.
- Transfiera inmediatamente 1,5 ml del sustrato mixto a la película flexible semi-trasplante y coloque la membrana PVDF sobre ella. A continuación, transfiera el resto de la solución de sustrato a la membrana.
- Incubar la membrana PVDF con el sustrato mixto en una película flexible semitransparente durante 1 min.
- Recoja la membrana PVDF con pinzas y escurra brevemente la solución de sustrato.
- Empareje la membrana entre un par de películas de transparencia.
- Adquiera la imagen bajo modo quimioluminiscente.
- Detección fluorescente
- Recoja la membrana PVDF con pinzas y escurra la solución brevemente.
- Empareje la membrana entre un par de películas de transparencia.
- Adquiera la imagen en modo fluorescente.
NOTA: Los pasos 7.1 y 7.2 deben realizarse cerca de la máquina de imágenes para garantizar la máxima sensibilidad. - Cuando la señal de fondo es alta, realice un paso de lavado en un recipiente con 80-100 ml de PBS-T: 10 minutos de enjuague 3 veces para el anticuerpo primario y 5 minutos de enjuague 6 veces para el anticuerpo secundario.
NOTA: Los anticuerpos primarios y secundarios diluidos con soluciones IRE del 10% se pueden utilizar hasta 8-10 veces sin pérdida de sensibilidad6. La solución debe mantenerse a 4 °C durante un mes.
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Representative Results
Este ejemplo ilustra la eficacia del método CDR junto con la tecnología de inmunoenhancing en western blot. La incubación estática se realizó en una película flexible semitransparente donde las membranas PVDF fueron incubadas con la solución de anticuerpos, mientras que la incubación de CDR fue en un horno de hibridación mediante tubos giratorios que contenían las membranas y la solución de anticuerpos (Movie). La Figura 2 mostró cantidades de antígeno y anticuerpos, respectivamente, necesarias para la detección quimioluminiscente en manchas occidentales. Tanto en incubaciones estáticas como CDR, el uso de la solución IRE aumentó la sensibilidad: IRE redujo la menor cantidad de lysatos celulares (antígeno) necesarios para detectar ß-actin de 2,2 μg a 1,1 μg en condiciones estáticas y se redujo aún más de 1,1 μg a 0,275 μg utilizando CDR (Figura 2A). Del mismo modo, la concentración mínima de anticuerpos anti-6x Su anticuerpo de etiqueta se redujo de 100 ng/mL a 50 ng/mL en condiciones estáticas y de 100 ng/mL a 12,5 ng/mL en condición CDR (Figura 2B). La incubación de CDR durante 5 min o 10 min redujo drásticamente el límite de detección en comparación con la incubación estática (60 min con primaria y 30 min con anticuerpos secundarios). Por último, la combinación de CDR con IRE reveló una sensibilidad superior en la mancha occidental (0,275 μg de lysatos celulares para la detección de ß-actin y 12,5 ng/ml de anticuerpo anti-6x Su etiqueta) incluso dentro de este período de incubación extremadamente corto.
En el segundo ejemplo se muestra la aplicación correcta de este método a una mancha occidental con detección fluorescente (Figura 3). La detección fluorescente, a diferencia de la detección quimioluminiscente, tiene la capacidad única de detectar múltiples objetivos en la misma mancha al mismo tiempo sin desnudamiento/re-sondeo de anticuerpos. (El suyo) 6 ap etiquetados y ß-actin en los lysates celulares fueron detectados simultáneamente usando un fluoróforo bicolor. La incubación cdr con IRE no sólo aceleró la detección, sino que también aumentó la sensibilidad, lo que resultó en desenmascarar la degradación de (Su)6 etiquetada AP (Figura 3A).
Figura 1: Ilustración esquemática del método de reabastecimiento de drenaje cíclico (CDR).
(A) Una capa de agotamiento cerca de la membrana se forma rápidamente en condiciones estáticas cuando una sonda tiene una alta afinidad por el antígeno, pero una capacidad limitada para difundir a través de la solución. Por lo tanto, el viaje de la sonda a la membrana se convierte en un paso limitante de velocidad y los largos tiempos de incubación compensan la limitación de la transferencia de masa. (B) Método CDR girando el tubo mientras la membrana se adhiere a la pared elimina la capa de agotamiento y repone la misma solución de sonda para mantener la concentración de la sonda cerca de la membrana constante. Esta cifra ha sido modificada desde Higashi et al.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: (A) Diferentes cantidades de 293 lysatos celulares (1:2 diluciones en serie de 8,8 μg/carril) fueron separados por SDS-PAGE, seguido de transferencia a una membrana PVDF y bloqueo con 5% de leche descremada en PBS-T. La mancha fue sondeada con anticuerpo anti-ß-actin del ratón (dilución de 1:3.000). (B) Después de la separación de los medios condicionados derivados de células transfectadas 293 con pAPTAG5 (GenHunter) que contienen el secreto (Su)6 fosfatasa alcalina etiquetada (AP, 8 x 10-14 mol/carril), las proteínas fueron transferidas a las membranas PVDF. Cada membrana fue sometida a mancha occidental con diferentes concentraciones de anticuerpo anti-6x Su etiqueta (diluciones serie 1:2 de 400 ng/mL). Las membranas fueron imágenes como una sola imagen y las líneas punteadas indican el borde de las membranas individuales. Esta cifra ha sido modificada desde Higashi et al.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Detección simultánea de múltiples objetivos en una mancha occidental utilizando detección fluorescente y CDR en conjunto con IRE.
Diferentes cantidades de lysates (diluciones serie 1:2 de 10 μg/carril) de 293 células transfectadas con pAPTAG5 fueron separadas y transferidas a una membrana PVDF. Después de bloquear con el amortiguador de bloqueo para la detección fluorescente (BFD) durante 1 h, la mancha fue sondeada con anticuerpos anti-6X Su etiqueta y anticuerpos anti ß-actin, seguido por IRDye 800CW cabra anti-conejo IgG e IRDye 680RD cabra anti-ratón IgG. R: anticuerpos diluidos con solución IRE al 10% en condición CDR, B: anticuerpos diluidos con BFD que contienen 0,1% Tween20 en estado estático. Debido a una mayor sensibilidad con la combinación CDR e IRE, se vio la degradación de (Su)6 etiquetada AP. Esta cifra ha sido modificada desde Higashi et al.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ilustración esquemática de una mancha occidental CDR mejorada y de ultra alta velocidad en comparación con un método estático tradicional.
Esta cifra ha sido modificada desde Higashi et al.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Western blot es una técnica analítica ampliamente utilizada para detectar proteínas específicas que se desarrolló ~Hace 40 años7,8. Desde entonces, la técnica ha seguido evolucionando, con innovaciones posteriores mejorando la sensibilidad, velocidad y cuantificación de la técnica2,9,10,11,12,13. El protocolo mejorado de hinchazón occidental de ultra alta velocidad presentado aquí hace varias mejoras sustanciales a la técnica existente. Reducimos el tiempo de incubación sin sacrificar la sensibilidad reduciendo el umbral de detección con IRE. No se necesita ningún equipo especial o costoso: girar un tubo en un horno de hibridación es suficiente para superar el MTL. La innovación clave es que cdr elimina eficazmente la capa de agotamiento en el ensayo. Aunque un aparato de cultivo de rodillos se emplea comúnmente para reducir el volumen de solución, no se ha ilustrado el potencial de este método para superar mtl y reducir los tiempos de incubación. Debido a la drástica reducción del tiempo total para todo el procedimiento(Figura 4),se pueden obtener cantidades mucho más altas de datos de manchas occidentales por día cuando las membranas bloqueadas están en su mano, lo cual es casi imposible de hacer con un protocolo tradicional de hinchazón occidental. Cabe señalar que la incubación de la membrana en una coctelera de plataforma mecedora es equivalente a la incubación estática4,6. Enjuagar las membranas PVDF en un hilandero de ensalada comercial doméstico con un gran volumen de solución de lavado también disminuye la duración del procedimiento(Figura 4).
El uso exitoso de este protocolo se basa en la optimización de la dilución de anticuerpos con solución IRE y tiempo de incubación. Se recomienda una amplia gama de valoración de anticuerpos al comienzo de los ensayos, ya que cdr en conjunto con IRE aumenta sustancialmente la sensibilidad (Figura 2). El tiempo de incubación es otro factor a tener en cuenta. Cuando uno tiene buenos resultados de mancha occidental con incubación de 1 h con anticuerpos primarios en condiciones estáticas, el tiempo de incubación podría reducirse a 5-10 min en condiciones cdr en general. Cuando se necesita incubación durante la noche con anticuerpos primarios, por ejemplo, se debe evaluar un tiempo de incubación de CDR ligeramente más largo (30 min - 6 h). El tiempo de dilución e incubación con anticuerpos secundarios también es crítico. Las incubaciones superiores a 30 min en condiciones CDR suelen dar mayores antecedentes. Por lo tanto, se requiere una valoración cuidadosa de anticuerpos secundarios con hasta 30 minutos de incubación de CDR. Cuando la señal de fondo es alta después de una valoración cuidadosa de anticuerpos, se deben realizar pasos de lavado extensos (10 minutos de enjuague 3 veces para el anticuerpo primario y 5 minutos de enjuague 6 veces para el anticuerpo secundario en un recipiente con 80-100 ml de solución de lavado).
La calidad de los datos de manchas occidentales a menudo depende de los anticuerpos utilizados. Cuando teníamos un anticuerpo difícil utilizado para la mancha occidental, los marcadores de proteínas a veces mostraban señales sustanciales incluso después de una cuidadosa valoración de anticuerpos y un lavado extensivo. Dado que nos dimos cuenta de que el método CDR con IRE tiende a aumentar la unión no específica, la adición de reactivos de bloqueo (como la leche descremada y otros) en diluyentes de anticuerpos puede mejorar la relación señal-ruido14. Es un paso de detección que consume mucho tiempo, pero vale la pena intentarlo.
La mancha occidental se ha vuelto importante para las aplicaciones cuantitativas2. Se puede realizar una semi-cuantificación con detección quimioluminiscente. El procedimiento presentado aquí es aplicable a la desmontaje y el re-sondeo a este fin6. Debido a un rango dinámico más amplio, la detección fluorescente es la mejor opción. Con este protocolo, la detección fluorescente proporciona un rango dinámico lineal para el análisis cuantitativo6. Vale la pena mencionar que el tiempo de incubación cdr con detección fluorescente parece más largo que con la detección quimioluminiscente.
La mancha occidental tiene una amplia gama de aplicaciones y sigue siendo un método universal para estudiar la abundancia de proteínas, interacciones proteína-proteínas y modificaciones post-traslacionales. Por ejemplo, los anticuerpos contra los carbohidratos se pueden utilizar fácilmente para la mancha occidental con este protocolo14. Dado que una variedad de mitades de carbohidratos expresadas en la superficie externa de virales, bacterianos y fugus son específicas de patógenos, son objetivos invaluables para el reconocimiento y diagnóstico de enfermedades infecciosas. Por lo tanto, la aplicación de este sencillo protocolo podría afectar a muchas áreas de investigación, afeitando horas de tiempo de espera no sólo para experimentos, sino también inmunodiagnósticos clínicos que dependen de la tecnología de distensión occidental.
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Disclosures
Los autores no han declarado intereses competidores directamente relevantes para el contenido de este artículo.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la División de Investigación Intramuros, Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre, Institutos Nacionales de Salud. S.H. fue apoyado por el Programa de Estudio estudiantil de asociación público-privada de Japón en el extranjero, y H.N. y K.Y. fueron por Valor y V Beca de Capacitación en El Extranjero de Drogas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
References
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