Summary
טכניקת סופג מערבית במהירות גבוהה במיוחד מפותחת על ידי שיפור הקינטיקה של אנטיגן-נוגדנים מחייב באמצעות ניקוז מחזורי וחידוש (CDR) טכנולוגיה בשילוב עם סוכן שיפור immunoreaction.
Abstract
כתם מערבי (באנגלית: Western blot) היא שיטה קנונית למחקר ביו-רפואי. הוא משמש בדרך כלל כדי לקבוע את הגודל היחסי ואת השפע של חלבונים ספציפיים, כמו גם שינויים בחלבון שלאחר התרגום. טכניקה זו יש היסטוריה עשירה ונשאר בשימוש נרחב בשל הפשטות שלה. עם זאת, הליך הבליעה המערבי המפורסם לוקח שעות, אפילו ימים, כדי להשלים, עם צוואר בקבוק קריטי להיות זמני הדגירה הארוכים המגבילים את התפוקה שלה. צעדי דגירה אלה נדרשים עקב דיפוזיה איטית של נוגדנים מהתמיסה בתפזורת לאנטיגנים משותקים על הממברנה: ריכוז הנוגדנים ליד הממברנה נמוך בהרבה מהריכוז בצובר. כאן, אנו מציגים חידוש המפחית באופן דרמטי מרווחי דגירה אלה על ידי שיפור כריכת אנטיגן באמצעות ניקוז מחזורי וחידוש (CDR) של פתרון הנוגדנים. השתמשנו גם בטכנולוגיה לשיפור האימונוריאציה כדי לשמר את הרגישות של ההסתעפות. שילוב של שיטת CDR עם סוכן שיפור אימונוריאציה מסחרי הגביר את אות הפלט והפחית באופן משמעותי את זמן הדגירה של הנוגדנים. הכתם המערבי במהירות גבוהה במיוחד יכול להתבצע בתוך 20 דקות ללא כל אובדן רגישות. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כתמים מערביים באמצעות זיהוי chemiluminescent ו פלואורסצנטי. פרוטוקול פשוט זה מאפשר לחוקרים לחקור טוב יותר את הניתוח של ביטוי חלבון בדגימות רבות.
Introduction
כתם מערבי (ידוע גם בשם immunoblot) היא טכניקה חזקה ויסודית על פני מגוון רחב של דיסציפלינות מדעיות וקליניות. טכניקה זו משמשת לבחינת הנוכחות, השפע היחסי, המסה המולקולרית היחסית והשינויים שלאחר התרגום של חלבונים1. בשילוב עם ניתוח תמונה דיגיטלית, שיטה זו יכולה לנתח באופן אמין את שפע החלבונים ושינויי החלבון2. למרות כתם המערבי מבוצע באופן שגרתי, היא שיטה זמן רב ועבודה אינטנסיבית. דגירה ארוכה של הנוגדן עם ממברנות נדרשים. כאן, אנו מתארים שינוי בשיטת הדגירה המתגברת על מגבלה זו מבלי להקריב רגישות.
במהלך הדגירה של הממברנה, נוגדנים צפים בתמיסה בעוד אנטיגנים משותקים על הממברנה. בגלל הזיקה הגבוהה שלהם, שיעור הנוגדנים המחייבים את האנטיגן מהיר יותר מפיזור הנוגדנים מהתמיסה בתפזורת לקרום. פעולה זו יוצרת "שכבת דלדול" בריכוז נמוך (איור 1). זה עלול לקחת שעות עבור נוגדנים רחוקים יותר להגיע לקרום באמצעות דיפוזיה פסיבית, שהוא הגורם העיקרי האחראי על זמני דגירה ארוכים בטכניקה זו. אפקט זה נקרא הגבלת הסעת המונים (MTL)3. הוצע כי ניקוז חוזר ונשנה וחידוש הפתרון המכיל נוגדנים עלול לשבש את שכבת הדלדול ולהתגבר על MTL4. כאן, פיתחנו טכניקה ייחודית המיישמת את המושג הזה ניקוז מחזורי וחידוש (CDR) כדי להפחית את ההשפעה של MTL בפרוטוקול סופג מערבי מסורתי ולקצר באופן הערות את תקופת הדגירה הנדרשת.
על מנת לשמור על רגישות הגילוי עם זמן דגירה קצר, עשינו שימוש בטכנולוגיה לשיפור אימונוריאציה המאיצה את תגובת האנטיגן-נוגדנים, ובכך משפרת את יחס האות לרעש5. סוכנים רבים לשיפור האימונו-ראציה הזמינים מסחרית (IRE) מורכבים מ-2 רכיבים (פתרון 1 ו-2, ראו טבלת חומרים). ההרכב הקנייני או מנגנון הפעולה של IRE לא נחשפו, אך מצאנו בעבר כי IRE הפחית את קבוע הדיסוציאציה בין האנטיגן והנוגדן ב מבחני כריכת פאזה מוצקים, מה שמצביע על זיקה מוגברת היא, לפחות בחלקה, אחראית לשיפור ההשפעה של IRE6. השילוב של CDR עם IRE מניב פרוטוקול נפיחות מערבי במהירות גבוהה במיוחד המפחית את זמן ההליך כולו מבלי להתפשר על הרגישות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SDS-PAGE והעברה לקרום PVDF
- בצעו SDS-PAGE להפרדת חלבונים לפי גודל יחסי.
הערה: כל מערכת ג'ל מסחרית או ביתית היא בסדר. נא פעל בהתאם לפרוטוקול היצרן. - מעבירים חלבונים מופרדים מג'ל לקרום PVDF.
הערה: שיטות העברה נפוצות (העברה יבשה למחצה או רטובה) מתאימות. נא פעל בהתאם לפרוטוקול היצרן.
2. חסימת קרום PVDF
- דגירה את הממברנות במאגרי חסימה מתאימים במשך 1 שעות עם עצבנות בטמפרטורת החדר.
הערה: בהתאם למערכת הנוגדנים והזיהוי העיקרית, יש לבחור מאגר חסימה מתאים. לדוגמה, החוסמים האופייניים ביותר הם BSA, חלב יבש דל שומן, קזאין ופולימרים סינתטיים מסחריים. PBS ו/או TBS עם 0.1% Tween20 הם המאגרים הנפוצים ביותר. שלב חסימה זה יכול להיעשות בן לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
3. דגירה עם נוגדן ראשוני
- הכן 10% שיפור אימונוריאציה סוכן-1 פתרון (IRE-1) עם מים מזוקקים. וורטקס היטב.
- הכינו את הנוגדן העיקרי המדולל עם 10% IRE-1. מערבבים אותו בעדינות וביסודיות.
- אם משתמשים בקרום גדול יותר (4 ס"מ x 8 ס"מ – 8 ס"מ x 8 ס"מ), מוסיפים 8 מ"ל של פתרון הנוגדנים לצינורות צנטריפוגה חרוטים של 50 מ"ל. אם משתמשים בקרום קטן יותר (2 ס"מ x 8 ס"מ – 4 ס"מ x 8 ס"מ), מוסיפים 3 מ"ל של פתרון הנוגדנים לצינור פוליפרופילן עגול 14 מ"ל(שולחן החומרים).
- להרים את קרום PVDF עם פינצטה ולנקות את פתרון החסימה לזמן קצר. הכנס את קרום PVDF לתוך צינור זה עם אצבעות כפפות ולהבטיח כי הממברנה כולה נצמדת לקיר הצינור. כאשר קרום PVDF מוכנס לתוך צינור, פנים "צד החלבון" של הממברנה כי היה במקור במגע עם הג'ל פנימה. סגור את המכסה בחוזקה.
- הכנס את הצינור 50 מ"ל לתוך בקבוק זכוכית לתנור הכלאה.
הערה: כאשר צינורות 14 מ"ל משמשים דגירה זו, להכניס צינור 14 מ"ל לתוך הצינור 50 מ"ל, באמצעות זוג מחזיקי טבעת פלסטיק כדי לשמור על הצינור הפנימי במרכז הצינור 50 מ"ל. - הפעל את תנור ההכלאה.
- דגירה הממברנה עם סיבוב 6 סל"ד לפחות 5 דקות.
הערה: ודא כי הממברנה נצמדת לקיר בכל עת וכי הצינור (הפנימי) הוא אופקי כדי לכסות את הממברנה עם פתרון הנוגדן באופן שווה. כייל את הדילול של זמן הנוגדן והדגירה לפני הניסוי עצמו.
4. שטיפת ממברנות
- עצור את הסיבוב.
- בזהירות להסיר את קרום PVDF מהצינור עם פינצטה, ומניחים את הממברנה לתוך מיכל עם 50 מ"ל של PBS-T.
- יש לשטוף את הממברנה לזמן קצר באמצעות PBS-T.
- יש לשטוף את הממברנה במיכל במים מזוקקים עד שלא יופיעו בועות. זה כדי להסיר את רוב הנוגדן.
- מעבירים את קרום ה-PVDF מהמכל לטווח הסלט המכיל 250 מ"ל של PBS-T.
- מניחים את סל מסננת ספינר. ודא שהמכסה הונח בצורה מאובטחת.
- הפעל את ספינר ולהפעיל אותו במשך כ 20-30 שניות.
- להשליך את הפתרון ולשטוף בקצרה את החלק הפנימי של ספינר עם מים מזוקקים.
- הוסף 250 מ"ל של PBS-T לתוך ספינר שוב.
- חזור על שלבים 4.6 ו- 4.7.
5. דגירה עם הנוגדן המשני
- הכן 10% שיפור אימונוריאציה סוכן-2 פתרון (IRE-2) עם מים מזוקקים. וורטקס היטב.
- הכינו את הנוגדן המשני המדולל עם 10% IRE-2. מערבבים אותו בעדינות וביסודיות.
- בחר את נפח פתרון הנוגדנים והצינור כאמור בשלב 3.3.
- להרים את קרום PVDF עם פינצטה ולנקות את הפתרון בקצרה. הכנס את קרום PVDF לתוך הצינור כאמור בשלב 3.4.
- הכנס את הצינור 50 מ"ל לתוך בקבוק זכוכית לתנור הכלאה.
- הפעל את תנור ההכלאה.
- דגירה הממברנה עם סיבוב 6 סל"ד לפחות 5 דקות. ודא כי הממברנה נצמדת לקיר בכל עת וכי הצינור (הפנימי) הוא אופקי כדי לכסות באופן שווה את הממברנה עם פתרון הנוגדן.
הערה: כייל את זמן הדגירה לפני הניסוי עצמו. כאשר הנוגדן המשני מצומד באופן פלואורסצנטי, בצע את הדגירה בחושך.
6. שטיפת ממברנות
- בצע את שלבים 4.1 עד 4.10.
7. רכישת תמונה
- זיהוי צ'מילומינסנטי
- מניחים חתיכת סרט גמיש חצי השתלה (10 ס"מ x 15 ס"מ) על משטח שטוח.
- מערבבים 2 מרכיבים של המצע המלומינסנטי בצינור 5 מ"ל.
- להעביר מיד 1.5 מ"ל של המצע המעורב לסרט חצי השתלה גמיש ומניחים את קרום PVDF על זה. לאחר מכן, להעביר את שאר פתרון המצע על הממברנה.
- דגירה קרום PVDF עם מצע מעורב על סרט גמיש שקוף למחצה במשך 1 דקות.
- להרים את קרום PVDF עם פינצטה ולנקות את פתרון המצע בקצרה.
- כריך הממברנה בין זוג סרטי שקיפות.
- לרכוש את התמונה תחת מצב chemiluminescent.
- זיהוי פלואורסצנטי
- להרים את קרום PVDF עם פינצטה ולנקות את הפתרון בקצרה.
- כריך הממברנה בין זוג סרטי שקיפות.
- רכוש את התמונה במצב פלואורסצנטי.
הערה: יש לבצע את שלבים 7.1 ו- 7.2 בסמיכות למכונת ההדמיה כדי להבטיח רגישות מרבית. - כאשר אות הרקע גבוה, בצע שלב כביסה במיכל עם 80-100 מ"ל של PBS-T: 10 דקות לשטוף 3 פעמים עבור הנוגדן העיקרי 5 דקות לשטוף 6 פעמים עבור הנוגדן המשני.
הערה: הן נוגדנים ראשוניים והן משניים מדוללים עם 10% פתרונות IRE ניתן להשתמש עד 8-10 פעמים ללא אובדן רגישות6. הפתרון צריך להישמר ב 4 מעלות צלזיוס עד 1 חודש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דוגמה זו ממחישה את האפקטיביות של שיטת CDR יחד עם טכנולוגיית אימונוהאנסינג על כתם מערבי. הדגירה הסטטית בוצעה על סרט גמיש שקוף למחצה שבו קרום PVDF דגירה עם פתרון הנוגדנים, ואילו דגירה CDR היה בתנור הכלאה על ידי סיבוב צינורות שהכילו את הממברנות ואת פתרון הנוגדנים (סרט). איור 2 הראה כמויות של אנטיגן ונוגדנים, בהתאמה, הדרושים לגילוי צ'מילומינסנט על כתמים מערביים. הן בדגירה סטטית והן בדגירה CDR, השימוש בתמיסת IRE הגביר את הרגישות: IRE הפחית את הכמות הנמוכה ביותר של ליסטטים של תאים (אנטיגן) הדרושים לגילוי ß-actin מ- 2.2 מיקרוגרם ל- 1.1 מיקרוגרם בתנאים סטטיים והצטמצם עוד יותר מ- 1.1 מיקרוגרם ל- 0.275 מיקרוגרם באמצעות CDR (איור 2A). באופן דומה, הריכוז המינימלי של נוגדן התג שלו נגד 6x הונמך מ-100 ננומטר למ"ל ל-50 ננומטר/מ"ל בתנאים סטטיים ומ-100 ננומטר למ"ל ל-12.5 ננו ג'/מ"ל במצב CDR (איור 2B). דגירה CDR במשך 5 דקות או 10 דקות הורידה באופן דרמטי את מגבלת הגילוי בהשוואה לדיגור סטטי (60 דקות עם ראשוני ו -30 דקות עם נוגדנים משניים). לבסוף, השילוב של CDR עם IRE גילה רגישות מעולה על הכתם המערבי (0.275 מיקרוגרם של ליסקטים של תאים לגילוי ß-actin ו 12.5 ng/mL של נוגדן תג אנטי 6x שלו) אפילו בתוך תקופת דגירה קצרה מאוד זו.
הדוגמה השנייה מדגימה את היישום המוצלח של שיטה זו כתם מערבי עם זיהוי פלואורסצנטי (איור 3). גילוי פלואורסצנטי, בניגוד לגילוי chemiluminescent, יש את היכולת הייחודית לזהות מטרות מרובות על אותו כתם באותו זמן מבלי להפשיט / מחדש חיטוט נוגדנים. (שלו) 6 מתויגים AP ו ß-actin ב lysates התא זוהו בו זמנית באמצעות פלואור דו צבעי. דגירה CDR עם IRE לא רק האיצה את הגילוי אלא גם הגבירה את הרגישות, וכתוצאה מכך חשף את השפלה של (שלו)6 מתויג AP (איור 3A).
איור 1: איור סכמטי של שיטת חידוש מלאי מחזורי (CDR).
(A) שכבת דלדול ליד הממברנה נוצרת במהירות בתנאים סטטיים כאשר לבדיקה יש זיקה גבוהה לאנטיגן אך יכולת מוגבלת להתפזר דרך הפתרון. לכן, הנסיעה של החללית לממברנה הופכת לצעד מגביל קצב ותקופות הדגירה הארוכות מפצות על הגבלת העברה המונית. (B) שיטת CDR על ידי סיבוב הצינור בעוד הממברנה נצמדת לקיר מבטלת את שכבת הדלדול ומחדשת את אותו פתרון בדיקה כדי לשמור על ריכוז הבדיקה ליד הממברנה קבוע. נתון זה שונה מהיגאשי ואח '6. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: (A) כמויות שונות של 293 ליטסטים של תאים (1:2 דילול סדרתי מ- 8.8 מיקרוגרם / נתיב) הופרדו על ידי SDS-PAGE, ואחריו העברה לקרום PVDF וחסימת עם 5% חלב רזה ב- PBS-T. הכתם נבדק עם נוגדן נגד ß-actin העכבר (1:3,000 דילול). (B) לאחר הפרדת מדיה מותנית נגזר 293 תאים transfected עם pAPTAG5 (GenHunter) המכיל את המופרש (שלו)6 מתויג phosphatase אלקליין (AP, 8 x 10-14 מול / נתיב), חלבונים הועברו קרום PVDF. כל קרום היה נתון כתם מערבי עם ריכוזים שונים של נוגדן תג שלו אנטי 6x (1:2 דילול סדרתי מ 400 ng/mL). הקרומים צולמו כתמונה אחת וקווים מנוקדים מצביעים על גבול הממברנות הבודדות. נתון זה שונה מהיגאשי ואח '6. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: זיהוי בו-זמני של יעדים מרובים על כתם מערבי באמצעות זיהוי פלואורסצנטי ו- CDR בשילוב עם IRE.
כמויות שונות של ליסטים (1:2 דילול סדרתי מ 10 מיקרוגרם / נתיב) מ 293 תאים transfected עם pAPTAG5 הופרדו והועברו קרום PVDF. לאחר חסימה עם מאגר חסימה לגילוי פלואורסצנטי (BFD) במשך 1 שעות, הכתם נבדק עם אנטי 6X התג שלו נוגדנים אנטי ß-actin, ואחריו IRDye 800CW עז נגד ארנב IgG ו IRDye 680RD עז נגד עכבר IgG. A: נוגדנים מדוללים עם 10% פתרון IRE במצב CDR, B: נוגדנים מדוללים עם BFD המכיל 0.1% Tween20 במצב סטטי. בשל רגישות גבוהה יותר עם שילוב CDR ו- IRE, נראה ההשפלה של (שלו)6 מתויג AP. נתון זה שונה מהיגאשי ואח '6. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: איור סכמטי של כתם CDR מערבי משופר ומהיר במיוחד בהשוואה לשיטה סטטית מסורתית.
נתון זה שונה מהיגאשי ואח '6. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתם מערבי הוא טכניקה אנליטית בשימוש נרחב כדי לזהות חלבונים ספציפיים שפותחו ~ לפני 40 שנה7,8. מאז, הטכניקה המשיכה להתפתח, עם חידושים הבאים לשפר את הרגישות, המהירות, ואת הכמות של הטכניקה2,9,10,11,12,13. פרוטוקול סופג מערבי מהיר במיוחד המוצג כאן מבצע מספר שיפורים משמעותיים בטכניקה הקיימת. אנו מפחיתים את זמן הדגירה מבלי להתפשר על הרגישות על-ידי הורדת סף הגילוי באמצעות IRE. אין צורך בציוד מיוחד או יקר: סיבוב צינור בתנור הכלאה מספיק כדי להתגבר על MTL. החידוש העיקרי הוא ש- CDR מבטל ביעילות את שכבת הדלדול במהלך ההסתעפות. למרות מנגנון תרבות רולר משמש בדרך כלל כדי להפחית את נפח הפתרון, הפוטנציאל של שיטה זו כדי להתגבר על MTL ולהפחית את זמני הדגירה לא הודגם. בשל הצמצום הדרסטי של הזמן הכולל לכל ההליך (איור 4), ניתן להשיג כמויות גבוהות בהרבה של נתוני כתמים מערביים ליום כאשר הקרומים החסומים נמצאים ביד, וזה כמעט בלתי אפשרי לעשות זאת עם פרוטוקול פריחה מערבי מסורתי. יש לציין כי דגירה של הממברנה על שייקר פלטפורמת נדנדה שווה דגירה סטטית4,6. שטיפת קרום PVDF בסלט מסחרי ביתי עם נפח גדול של פתרון כביסה גם מקצרת את משך ההליך (איור 4).
השימוש המוצלח בפרוטוקול זה מסתמך על אופטימיזציה של דילול הנוגדנים עם פתרון IRE וזמן הדגירה. בתחילת מבחני הנוגדנים מומלץ להשתמש במגוון רחב של נוגדנים, שכן CDR בשילוב עם IRE מגבירים את הרגישות באופן משמעותי (איור 2). זמן הדגירה הוא גורם נוסף שיש לקחת בחשבון. כאשר אחד יש תוצאות כתם מערבי טוב עם דגירה 1 h עם נוגדנים ראשוניים בתנאים סטטיים, זמן הדגירה יכול להיות מופחת ל 5-10 דקות בתנאי CDR בכלל. כאשר יש צורך בדגירה לילה עם נוגדנים ראשוניים למשל, יש להעריך זמן דגירה CDR מעט ארוך יותר (30 דקות - 6 שעות). זמן דילול ודגרה עם נוגדנים משניים הם גם קריטיים. דגירה גדולה מ 30 דקות בתנאי CDR בדרך כלל לתת רקע גבוה יותר. לכן, טיטרציה זהירה של נוגדנים משניים נדרשת עם עד 30 דקות של דגירה CDR. כאשר אות הרקע גבוה לאחר טיטרציה זהירה של נוגדנים, יש לבצע צעדי כביסה נרחבים (10 דקות שטיפה 3 פעמים עבור הנוגדן העיקרי ו-5 דקות שטיפה 6 פעמים לנוגדן המשני במיכל עם 80-100 מ"ל של פתרון כביסה).
איכות נתוני הכתם המערביים תלויה לעתים קרובות בנוגדנים המשמשים. כאשר היה לנו נוגדן קשה המשמש כתם מערבי, סמני חלבון לפעמים הראו אותות משמעותיים גם לאחר titration נוגדנים זהיר כביסה נרחבת. מאז שמנו לב כי שיטת CDR עם IRE נוטה להגדיל את מחייב לא ספציפי, תוספת של חסימת ריאגנטים (כגון חלב רזה ואחרים) לתוך diluents נוגדנים עשוי לשפר את יחס אות לרעש14. זהו שלב סינון גוזל זמן, אבל כדאי לנסות.
הכתם המערבי הפך חשוב עבור יישומים כמותיים2. ניתן לבצע כמות חלקית עם זיהוי כימלומינסנטי. ההליך המוצג כאן חל על הפשטה וחיטוט מחדש עד סוף זה6. בגלל טווח דינמי רחב יותר, זיהוי פלואורסצנטי הוא האפשרות הטובה ביותר. באמצעות פרוטוקול זה, זיהוי פלואורסצנטי מספק טווח דינמי ליניארי לניתוח כמותי6. ראוי לציין כי זמן הדגירה CDR עם זיהוי פלואורסצנטי נראה ארוך יותר מזה עם זיהוי chemiluminescent.
הכתם המערבי יש מגוון רחב של יישומים ונשאר שיטה אוניברסלית ללמוד שפע חלבון, אינטראקציות חלבון חלבון, ושינויים שלאחר תרגום. לדוגמה, נוגדנים נגד פחמימות ניתן להשתמש בקלות עבור כתם מערבי עם פרוטוקול זה14. מאז מגוון רחב של moieties פחמימות לידי ביטוי על פני השטח החיצוניים של ויראלי, חיידקי, פוגוס הם ספציפיים לפתוגן, הם מטרות שלא יסולא בפז לזיהוי פתוגן ואבחון של מחלות זיהומיות. לפיכך, היישום של פרוטוקול פשוט זה יכול להשפיע על תחומי חקירה רבים, גילוח שעות של זמן המתנה לא רק לניסויים אלא גם אימונודיאגנוסטיקה קלינית המסתמכת על טכנולוגיית סופג המערבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים הצהירו כי אין אינטרסים מתחרים הרלוונטיים ישירות לתוכן מאמר זה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי האגף למחקר פנים-ארצי, מכון הלב, הריאות והדם הלאומי, המכונים הלאומיים לבריאות. S.H. נתמך על ידי יפן ציבורית-פרטית שותפות סטודנטים ללמוד בחו"ל תוכנית, ו H.N. ו K.Y. היו על ידי גבור ו V סמים בחו"ל הכשרה מלגת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
References
- MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
- Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
- Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
- Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html (2020).
- Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
- Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852 (2016).
- Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
- Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).
