Summary
Uma técnica de mancha ocidental de ultra-alta velocidade é desenvolvida melhorando a cinética da ligação antígeno-anticorpo através da tecnologia de drenagem e reposição cíclica (CDR) em conjunto com um agente de aumento de imunoreaction.
Abstract
Uma mancha ocidental (também conhecida como imunoblot) é um método canônico para pesquisa biomédica. É comumente usado para determinar o tamanho relativo e abundância de proteínas específicas, bem como modificações de proteína pós-translacional. Esta técnica tem uma rica história e permanece em uso generalizado devido à sua simplicidade. No entanto, o procedimento de mancha ocidental leva horas, até dias, para ser concluído, com um gargalo crítico sendo os longos tempos de incubação que limitam seu rendimento. Estas etapas de incubação são necessárias devido à lenta difusão de anticorpos da solução a granel para os antígenos imobilizados na membrana: a concentração de anticorpos perto da membrana é muito menor do que a concentração a granel. Aqui, apresentamos uma inovação que reduz drasticamente esses intervalos de incubação, melhorando a ligação de antígeno através da drenagem cíclica e reposição (CDR) da solução de anticorpos. Também utilizamos uma tecnologia de aprimoramento da imunoreação para preservar a sensibilidade do ensaio. Uma combinação do método CDR com um agente de aumento de imunoreaction comercial aumentou o sinal de saída e reduziu substancialmente o tempo de incubação de anticorpos. A mancha ocidental de ultra-alta velocidade resultante pode ser realizada em 20 minutos sem qualquer perda de sensibilidade. Este método pode ser aplicado a manchas ocidentais usando a detecção de chemiluminescente e fluorescente. Este protocolo simples permite que os pesquisadores explorem melhor a análise da expressão proteica em muitas amostras.
Introduction
Uma mancha ocidental (também conhecida como imunoblot) é uma técnica poderosa e fundamental em uma ampla gama de disciplinas científicas e clínicas. Esta técnica é usada para examinar a presença, abundância relativa, massa molecular relativa e modificações pós-translacionais de proteínas1. Combinado com a análise digital de imagens, este método pode analisar de forma confiável a abundância de proteínas e modificações proteicas2. Embora a mancha ocidental seja realizada rotineiramente, é um método demorado e intensivo em mão-de-obra. São necessárias longas incubações do anticorpo com membranas. Aqui, descrevemos uma modificação do método de incubação que supera essa limitação sem sacrificar a sensibilidade.
Durante a incubação da membrana, os anticorpos flutuam em solução enquanto os antígenos são imobilizados na membrana. Devido à sua alta afinidade, a taxa de ligação de anticorpos ao antígeno é mais rápida do que a difusão de anticorpos da solução a granel para a membrana. Isso cria uma baixa concentração "camada de esgotamento"(Figura 1). Pode levar horas para anticorpos mais distantes chegarem à membrana por meio da difusão passiva, que é o principal fator responsável por longos tempos de incubação nesta técnica. Esse efeito é chamado de limitação de transporte de massa (MTL)3. Foi proposto que a drenagem repetitiva e a reposição da solução contendo anticorpos podem interromper a camada de esgotamento e superar o MTL4. Aqui, elaboramos uma técnica única que implementa este conceito de drenagem e reposição cíclica (CDR) para diminuir o efeito do MTL em um protocolo tradicional de manchas ocidentais e comentou encurtar o período de incubação necessário.
Para manter a sensibilidade de detecção com um curto tempo de incubação, fizemos uso de uma tecnologia de aprimoramento da imunoreaction que acelera a reação de anticorpos de antígeno, melhorando assim a relação sinal-ruído5. Muitos agentes de imunoreação disponíveis comercialmente (IRE) consistem em 2 componentes (Solução 1 e 2, ver Tabela de Materiais). A composição proprietária ou mecanismo de ação do IRE não foi divulgada, mas descobrimos anteriormente que o IRE diminuiu a constante de dissociação entre o antígeno e o anticorpo em ensaios de ligação de fase sólida, indicando que o aumento da afinidade é, pelo menos em parte, responsável pelo efeito de aumento do IRE6. A combinação de CDR com IRE produz um protocolo de manchas ocidentais de ultra-alta velocidade que reduz todo o tempo de procedimento sem sacrificar a sensibilidade.
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Protocol
1. SDS-PAGE e transferência para uma membrana PVDF
- Execute o SDS-PAGE para separar proteínas com base no tamanho relativo.
NOTA: Qualquer sistema de gel comercial ou caseiro está bem. Por favor, siga o protocolo do fabricante. - Transfira proteínas separadas de um gel para uma membrana PVDF.
NOTA: Os métodos comuns de transferência (transferência semi-seca ou úmida) são adequados. Por favor, siga o protocolo do fabricante.
2. Bloqueio de membranas PVDF
- Incubar as membranas em tampões de bloqueio apropriados por 1h com agitação à temperatura ambiente.
NOTA: Dependendo do sistema de anticorpos e detecção primário, um buffer de bloqueio apropriado deve ser selecionado. Por exemplo, os bloqueadores mais típicos são BSA, leite seco sem gordura, caseína e polímeros sintéticos comerciais. PBS e/ou TBS com 0,1% Tween20 são os buffers mais utilizados. Esta etapa de bloqueio pode ser feita durante a noite a 4 °C.
3. Incubação com anticorpo primário
- Prepare 10% de imunoreaction melhorando a solução agent-1 (IRE-1) com água destilada. Vórtice bem.
- Prepare o anticorpo primário diluído com 10% de IRE-1. Misture-o suavemente e bem.
- Se usar uma membrana maior (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm), adicione 8 mL da solução de anticorpos em tubos de centrífuga cônica de 50 mL. Se utilizar uma membrana menor (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm), adicione 3 mL da solução de anticorpos em tubo de polipropileno de fundo redondo de 14 mL(Tabela de Materiais).
- Pegue a membrana PVDF com pinças e drene brevemente a solução de bloqueio. Insira a membrana PVDF neste tubo com os dedos enluvados e certifique-se de que toda a membrana adere à parede do tubo. Quando a membrana PVDF é inserida em um tubo, encare o "lado proteico" da membrana que estava originalmente em contato com o gel para dentro. Feche a tampa com força.
- Insira o tubo de 50 mL em uma garrafa de vidro para o forno de hibridização.
NOTA: Quando forem utilizados tubos de 14 mL para esta incubação, insira um tubo de 14 mL no tubo de 50 mL, utilizando um par de suportes de anel plástico para manter o tubo interno no centro do tubo de 50 mL. - Ligue o forno de hibridização.
- Incubar a membrana com rotação de 6 rpm por pelo menos 5 min.
NOTA: Certifique-se de que a membrana adere à parede o tempo todo e que o tubo (interno) esteja horizontal para cobrir a membrana uniformemente com a solução de anticorpos. Calibrar a diluição do anticorpo e o tempo de incubação antes do experimento real.
4. Lavagem de membrana
- Pare a rotação.
- Remova cuidadosamente a membrana PVDF do tubo com pinças e coloque a membrana em um recipiente com 50 mL de PBS-T.
- Enxágüe a membrana brevemente com PBS-T.
- Enxágüe a membrana no recipiente com água destilada até que não apareçam bolhas. Isto é para remover a maioria do anticorpo.
- Transfira a membrana PVDF do recipiente para o rotador de salada que contém 250 mL de PBS-T.
- Coloque a cesta de coador no rotador. Certifique-se de que a tampa foi colocada com segurança.
- Ative o rotador e execute-o por cerca de 20-30 s.
- Descarte a solução e enxágue brevemente o interior do rotador com água destilada.
- Adicione 250 mL de PBS-T no spinner novamente.
- Repita as etapas 4.6 e 4.7.
5. Incubação com o anticorpo secundário
- Prepare 10% de imunoreaction melhorando a solução agent-2 (IRE-2) com água destilada. Vórtice bem.
- Prepare o anticorpo secundário diluído com 10% de IRE-2. Misture-o suavemente e bem.
- Selecione o volume da solução de anticorpos e do tubo conforme indicado na etapa 3.3.
- Pegue a membrana PVDF com pinças e drene a solução brevemente. Insira a membrana PVDF no tubo conforme indicado na etapa 3.4.
- Insira o tubo de 50 mL em uma garrafa de vidro para o forno de hibridização.
- Ligue o forno de hibridização.
- Incubar a membrana com rotação de 6 rpm por pelo menos 5 min. Certifique-se de que a membrana adere à parede o tempo todo e que o tubo (interno) esteja horizontal para cobrir uniformemente a membrana com a solução de anticorpos.
NOTA: Calibrar o tempo de incubação antes do experimento real. Quando o anticorpo secundário for fluorescentemente conjugado, realize a incubação no escuro.
6. Lavagem de membrana
- Siga os passos 4.1 às 4:10.
7. Aquisição de imagens
- Detecção de chemiluminescente
- Coloque um pedaço de filme flexível semi-transplante (10 cm x 15 cm) em uma superfície plana.
- Misture 2 componentes do substrato chemiluminescente em um tubo de 5 mL.
- Transfira imediatamente 1,5 mL do substrato misto para a filmagem flexível semi-transplante e coloque a membrana PVDF sobre ele. Em seguida, transfira o resto da solução do substrato para a membrana.
- Incubar a membrana PVDF com o substrato misto em uma película flexível semi-transparente por 1 min.
- Pegue a membrana PVDF com pinças e escorra brevemente a solução do substrato.
- Sanduíche a membrana entre um par de filmes de transparência.
- Adquira a imagem sob o modo chemiluminescent.
- Detecção fluorescente
- Pegue a membrana PVDF com pinças e drene a solução brevemente.
- Sanduíche a membrana entre um par de filmes de transparência.
- Adquira a imagem sob o modo fluorescente.
NOTA: As etapas 7.1 e 7.2 devem ser realizadas nas proximidades da máquina de imagem para garantir a máxima sensibilidade. - Quando o sinal de fundo estiver alto, realize um passo de lavagem em um recipiente com 80-100 mL de PBS-T: 10 min enxágue 3 vezes para o anticorpo primário e 5 min enxágue 6 vezes para o anticorpo secundário.
NOTA: Tanto os anticorpos primários quanto secundários diluídos com soluções IRE de 10% podem ser usados até 8-10 vezes sem perda de sensibilidade6. A solução deve ser mantida em 4 °C por até 1 mês.
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Representative Results
Este exemplo ilustra a eficácia do método CDR juntamente com a tecnologia de imunoenhancing na mancha ocidental. A incubação estática foi realizada em uma película flexível semi-transparente onde as membranas PVDF foram incubadas com a solução de anticorpos, enquanto a incubação da CDR estava em um forno de hibridização por tubos rotativos que continham as membranas e a solução de anticorpos (Movie). A Figura 2 mostrou quantidades de antígeno e anticorpo, respectivamente, necessários para a detecção de chemiluminescente em manchas ocidentais. Em ambas as incubações estáticas e cdr, o uso da solução IRE aumentou a sensibilidade: o IRE reduziu a menor quantidade de licores celulares (antígeno) necessários para detectar ß-actin de 2,2 μg para 1,1 μg em condições estáticas e reduziu ainda mais de 1,1 μg para 0,275 μg usando CDR(Figura 2A). Da mesma forma, a concentração mínima de anticorpo anti-6x Sua tag foi reduzida de 100 ng/mL para 50 ng/mL em condições estáticas e de 100 ng/mL para 12,5 ng/mL sob condição de CDR(Figura 2B). A incubação da CDR por 5 min ou 10 min reduziu drasticamente o limite de detecção em comparação com a incubação estática (60 min com primário e 30 min com anticorpos secundários). Finalmente, a combinação de CDR com IRE revelou sensibilidade superior na mancha ocidental (0,275 μg de lisecelulares para detecção de ß-actin e 12,5 ng/mL de anticorpo anti-6x) mesmo dentro deste período de incubação extremamente curto.
O segundo exemplo demonstra a aplicação bem sucedida deste método a uma mancha ocidental com detecção fluorescente(Figura 3). A detecção fluorescente, em contraste com a detecção quemiluminescente, tem a capacidade única de detectar vários alvos na mesma mancha ao mesmo tempo sem desmontar/re-sondar anticorpos. (Dele) 6 AP marcados e ß-actin nos lysatos celulares foram detectados simultaneamente usando um fluoróforo de duas cores. A incubação da CDR com IRE não só acelerou a detecção como também aumentou a sensibilidade, resultando em desmascarar a degradação de (His)6 marcado AP (Figura 3A).
Figura 1: Ilustração esquemática do método de reposição de drenagem cíclica (CDR).
(A) Uma camada de esgotamento perto da membrana se forma rapidamente em condições estáticas quando uma sonda tem uma alta afinidade com o antígeno, mas uma capacidade limitada de difundir através da solução. Assim, a viagem da sonda para a membrana torna-se um passo limitante de taxa e longos tempos de incubação compensam a limitação de transferência de massa. (B) Método CDR girando o tubo enquanto a membrana adere à parede elimina a camada de esgotamento e repõe a mesma solução da sonda para manter a concentração da sonda perto da constante da membrana. Este número foi modificado de Higashi et al.6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: (A) Diferentes quantidades de 293 lysates de células (diluições seriais de 1:2 a partir de 8,8 μg/pista) foram separadas por SDS-PAGE, seguidas pela transferência para uma membrana PVDF e bloqueio com 5% de leite desnatado em PBS-T. A mancha foi sondada com anticorpo anti-ß-actin do rato (diluição de 1:3.000). (B) Após a separação da mídia condicionada derivada de 293 células transfeinadas com pAPTAG5 (GenHunter) contendo o fosfattase alcalina secretada(AP, 8 x 10-14 mol/lane), as proteínas foram transferidas para membranas PVDF. Cada membrana foi submetida a mancha ocidental com diferentes concentrações de anticorpo anti-6x Sua tag (diluições seriais 1:2 de 400 ng/mL). As membranas foram imagens como uma única imagem e linhas pontilhadas indicam a borda das membranas individuais. Este número foi modificado de Higashi et al.6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Detecção simultânea de múltiplos alvos em uma mancha ocidental usando detecção fluorescente e CDR em conjunto com IRE.
Diferentes quantidades de lises (diluições seriais 1:2 de 10 μg/pista) de 293 células transfeinadas com pAPTAG5 foram separadas e transferidas para uma membrana PVDF. Depois de bloquear com o Buffer de Bloqueio para detecção fluorescente (BFD) por 1 h, a mancha foi sondada com anticorpos anti-6X Sua tag e anticorpos anti-ß-actin, seguido por IRDye 800CW cabra anti-coelho IgG e IRDye 680RD anti-rato IgG. R: anticorpos diluídos com solução IRE de 10% sob condição de CDR, B: anticorpos diluídos com BFD contendo 0,1% Tween20 em condição estática. Devido à maior sensibilidade com a combinação CDR e IRE, a degradação de (His)6 tagged AP foi vista. Este número foi modificado de Higashi et al.6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Ilustração esquemática de uma mancha ocidental de CDR de velocidade aprimorada e ultra-alta em comparação com um método estático tradicional.
Este número foi modificado de Higashi et al.6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A mancha ocidental é uma técnica analítica amplamente utilizada para detectar proteínas específicas que foram desenvolvidas ~40 anos atrás7,8. Desde então, a técnica continuou a evoluir, com inovações subsequentes melhorando a sensibilidade, velocidade e quantitação da técnica2,9,10,11,12,13. O protocolo aprimorado de manchas ocidentais de ultra-alta velocidade apresentado aqui faz vários aprimoramentos substanciais à técnica existente. Reduzimos o tempo de incubação sem sacrificar a sensibilidade, diminuindo o limiar de detecção com o IRE. Não é necessário equipamento especial ou caro: girar um tubo em um forno de hibridização é suficiente para superar o MTL. A principal inovação é que a CDR elimina efetivamente a camada de esgotamento no ensaio. Embora um aparelho de cultura de rolo seja comumente empregado para reduzir o volume de solução, o potencial deste método para superar a MTL e reduzir os tempos de incubação não foi ilustrado. Devido à redução drástica do tempo geral para todo o procedimento (Figura 4), quantidades muito maiores de dados de manchas ocidentais por dia podem ser obtidas quando as membranas bloqueadas estão em mãos, o que é quase impossível fazê-lo com um protocolo tradicional de manchas ocidentais. Deve-se notar que a incubação da membrana em um agitador de plataforma de balanço equivale à incubação estática4,6. Enxaguar membranas PVDF em um rotador de salada comercial doméstico com um grande volume de solução de lavagem também diminui a duração do procedimento (Figura 4).
O uso bem-sucedido deste protocolo depende da otimização da diluição de anticorpos com solução IRE e tempo de incubação. Uma ampla gama de titulação de anticorpos é recomendada no início dos ensaios, uma vez que a CDR em conjunto com a IRE aumenta substancialmente a sensibilidade(Figura 2). O tempo de incubação é outro fator a ser considerado. Quando se tem bons resultados de manchas ocidentais com incubação de 1 h com anticorpos primários em condições estáticas, o tempo de incubação poderia ser reduzido para 5-10 min em condições de CDR em geral. Quando a incubação noturna é necessária com anticorpos primários, por exemplo, um tempo de incubação de CDR ligeiramente maior (30 min - 6 h) deve ser avaliado. O tempo de diluição e incubação com anticorpos secundários também são críticos. Incubações superiores a 30 min em condições de CDR geralmente dão maior histórico. Assim, é necessária uma titulação cuidadosa de anticorpos secundários com até 30 minutos de incubação de CDR. Quando o sinal de fundo estiver alto após a titulação cuidadosa dos anticorpos, devem ser realizadas etapas de lavagem extensivas (10 min enxaguar 3 vezes para o anticorpo primário e 5 min enxaguar 6 vezes para o anticorpo secundário em um recipiente com 80-100 mL de solução de lavagem).
A qualidade dos dados da mancha ocidental muitas vezes depende dos anticorpos utilizados. Quando tínhamos um anticorpo difícil usado para mancha ocidental, marcadores de proteína às vezes mostravam sinais substanciais mesmo após a titulação cuidadosa de anticorpos e lavagem extensiva. Uma vez que notamos que o método CDR com IRE tende a aumentar a ligação não específica, a adição de reagentes de bloqueio (como leite desnatado e outros) em diluentes de anticorpos pode melhorar a relação sinal-ruído14. É uma etapa de triagem demorada, mas vale a pena tentar.
A mancha ocidental tornou-se importante para aplicações quantitativas2. Uma semi-quantitação pode ser realizada com a detecção de chemiluminescente. O procedimento aqui apresentado é aplicável à desmontagem e re-sondagem para este final6. Devido a um alcance dinâmico mais amplo, a detecção fluorescente é a melhor opção. Com este protocolo, a detecção fluorescente fornece um alcance dinâmico linear para análise quantitativa6. Vale ressaltar que o tempo de incubação da CDR com detecção fluorescente parece mais longo do que com a detecção de chemiluminescente.
A mancha ocidental tem uma ampla gama de aplicações e continua sendo um método universal para estudar a abundância de proteínas, interações proteína-proteína e modificações pós-translacionais. Por exemplo, anticorpos anti-carboidratos podem ser facilmente usados para manchas ocidentais com este protocolo14. Uma vez que uma variedade de moieties de carboidratos expressos na superfície externa do viral, bacteriano e fugus são específicos do patógeno, eles são alvos inestimáveis para o reconhecimento e diagnóstico de doenças infecciosas. Assim, a aplicação desse protocolo simples poderia impactar muitas áreas de investigação, raspando horas de espera não apenas para experimentos, mas também imunodiagnósticos clínicos que dependem da tecnologia de manchas ocidentais.
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Disclosures
Os autores declararam que não há interesses concorrentes diretamente relevantes para o conteúdo deste artigo.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Divisão de Pesquisa Intramuros, Instituto Nacional de Coração, Pulmão e Sangue, Institutos Nacionais de Saúde. A S.H. foi apoiada pelo Programa de Estudos de Estudantes de Parceria Público-Privada do Japão no Exterior, e H.N. e K.Y. foram pela Valor e V Drug Overseas Training Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
References
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