Summary
Ultra yüksek hızlı batı şişkinlik tekniği, bir immünoreaksiyon arttırıcı madde ile birlikte döngüsel drenaj ve ikmal (CDR) teknolojisi ile antijen-antikor bağlama kinetiğinin iyileştirilmesi ile geliştirilmiştir.
Abstract
Batı lekesi (immünoblot olarak da bilinir) biyomedikal araştırmalar için kurallı bir yöntemdir. Genellikle belirli proteinlerin bağıl boyutunu ve bolluğunu ve çeviri sonrası protein modifikasyonlarını belirlemek için kullanılır. Bu teknik zengin bir geçmişe sahiptir ve sadeliği nedeniyle yaygın kullanımda kalır. Bununla birlikte, batı şişkinlik prosedürünün tamamlanması saatler, hatta günler alır ve kritik bir darboğaz, verimini sınırlayan uzun kuluçka süreleridir. Bu inkübasyon adımları, antikorların toplu çözeltiden membran üzerindeki hareketsiz antijenlere kadar yavaşça yayılması nedeniyle gereklidir: zarın yakınındaki antikor konsantrasyonu, toplu konsantrasyondan çok daha düşüktür. Burada, antikor çözeltisinin döngüsel drenajı ve yenilenmesi (CDR) yoluyla antijen bağlanmasını iyileştirerek bu kuluçka aralıklarını önemli ölçüde azaltan bir yenilik sunuyoruz. Ayrıca tahlil hassasiyetini korumak için bir immünoreaksiyon arttırıcı teknoloji kullandık. CDR yönteminin ticari bir immünoreaksiyon arttırıcı madde ile kombinasyonu çıkış sinyalini artırdı ve antikor inkübasyon süresini önemli ölçüde azalttı. Elde edilen ultra yüksek hızlı batı lekesi, hassasiyet kaybı olmadan 20 dakikada gerçekleştirilebilir. Bu yöntem hem chemiluminescent hem de floresan tespiti kullanılarak batı lekelerine uygulanabilir. Bu basit protokol, araştırmacıların birçok örnekte protein ekspresyonunun analizini daha iyi keşfetmelerini sağlar.
Introduction
Batı lekesi (immünoblot olarak da bilinir), çok çeşitli bilimsel ve klinik disiplinlerde güçlü ve temel bir tekniktir. Bu teknik, proteinlerin varlığını, bağıl bolluğunu, bağıl moleküler kütlesini ve çeviri sonrası modifikasyonlarını incelemek için kullanılır1. Dijital görüntü analizi ile birlikte, bu yöntem proteinlerin bolluğunu ve protein modifikasyonlarını güvenilir bir şekilde analiz edebilir2. Batı lekesi rutin olarak yapılsa da zaman alan ve emek yoğun bir yöntemdir. Antikorun membranlarla uzun inkübasyonları gereklidir. Burada, duyarlılıktan ödün vermeden bu sınırlamanın üstesinden gelen kuluçka yönteminin bir değişikliğini açıklıyoruz.
Membran inkübasyonu sırasında, antikorlar çözelti içinde yüzerken, antijenler membran üzerinde hareketsiz hale getirilir. Yüksek benzeşimleri nedeniyle, antijene antikor bağlanma hızı, antikorların dökme çözeltiden zara yayılmasından daha hızlıdır. Bu, düşük konsantrasyonda bir "tükenme katmanı" oluşturur (Şekil 1). Bu teknikte uzun kuluçka sürelerinin ana faktörü olan pasif difüzyon yoluyla daha uzak antikorların zara ulaşması saatler alabilir. Bu etkiye toplu taşıma sınırlaması (MTL)3denir. Antikor içeren çözeltinin tekrar tekrar boşaltılması ve yenilenmesinin tükenme tabakasını bozabileceği ve MTL4'ünüstesinden gelebileceği önerilmiştir. Burada, geleneksel bir batı blotting protokolünde MTL'nin etkisini azaltmak ve gerekli kuluçka süresini kısaltmak için bu döngüsel drenaj ve ikmal (CDR) kavramını uygulayan benzersiz bir teknik tasarladık.
Algılama hassasiyetini kısa bir kuluçka süresiyle korumak için, antijen-antikor reaksiyonunu hızlandıran ve böylece sinyal-gürültü oranını artıran bir immünoreaksiyon arttırıcı teknoloji kullandık5. Piyasada bulunan birçok immünoreaksiyon arttırıcı madde (IRE) 2 bileşenden oluşur (Çözüm 1 ve 2, bkz. Malzeme Tablosu). IRE'nin tescilli bileşimi veya etki mekanizması açıklanmadı, ancak daha önce IRE'nin katı faz bağlama testlerinde antijen ve antikor arasındaki ayrışma sabitini azalttığını bulduk, bu da artan benzeşimin en azından kısmen IRE6'nınarttırıcı etkisinden sorumlu olduğunu gösteriyor. CDR'nin IRE ile kombinasyonu, hassasiyettan ödün vermeden tüm prosedür süresini azaltan ultra yüksek hızlı bir batı blotting protokolü verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SDS-PAGE ve bir PVDF membran aktarın
- Proteinleri göreli boyuta göre ayırmak için SDS-PAGE gerçekleştirin.
NOT: Herhangi bir ticari veya ev yapımı jel sistemi iyidir. Lütfen üreticinin protokolüne uyun. - Ayrılmış proteinleri bir jelden PVDF zarına aktarın.
NOT: Yaygın transfer yöntemleri (yarı kuru veya ıslak transfer) uygundur. Lütfen üreticinin protokolüne uyun.
2. PVDF membranlarının engellenmesi
- Membranları oda sıcaklığında ajitasyon ile 1 saat boyunca uygun engelleme tamponlarında kuluçkaya yatırın.
NOT: Birincil antikor ve algılama sistemine bağlı olarak uygun bir blokaj tamponu seçilmelidir. Örneğin, en tipik blokerler BSA, yağsız kuru süt, kazein ve ticari sentetik polimerlerdir. %0,1 Ara20 ile PBS ve/veya TBS en sık kullanılan arabelleklerdir. Bu engelleme adımı 4 °C'de bir gecede yapılabilir.
3. Primer antikor ile inkübasyon
- Damıtılmış su ile %10 immünoreaksiyon arttırıcı ajan-1 çözeltisi (IRE-1) hazırlayın. Girdap iyi.
- Seyreltilmiş primer antikoru% 10 IRE-1 ile hazırlayın. Hafifçe ve iyice karıştırın.
- Daha büyük bir membran (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm) kullanıyorsanız, 50 mL konik santrifüj tüplerine 8 mL antikor çözeltisi ekleyin. Daha küçük bir membran (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm) kullanıyorsanız, 14 mL yuvarlak tabanlı polipropilen tüpe(Malzeme Tablası)3 mL antikor çözeltisi ekleyin.
- PVDF membranını cımbızla alın ve engelleme solüsyonunu kısa bir süre boşaltın. PVDF zarını eldivenli parmaklarla bu tüpe yerleştirin ve tüm zarın tüpün duvarına yapıştığından emin olun. PVDF membran bir tüpe yerleştirildiğinde, başlangıçta jel ile içe doğru temas eden zarın "protein tarafı" ile yüzleşin. Kapağı sıkıca kapatın.
- 50 mL'lik tüpü hibridizasyon fırını için bir cam şişeye yerleştirin.
NOT: Bu inkübasyon için 14 mL tüp kullanıldığında, iç tüpü 50 mL tüpün ortasında tutmak için bir çift plastik halka tutucu kullanarak 50 mL'lik tüpe 14 mL'lik bir tüp yerleştirin. - Hibridizasyon fırınını açın.
- Membranı en az 5 dakika boyunca 6 rpm dönüşle kuluçkaya yatırın.
NOT: Membranın her zaman duvara yapıştığından ve (iç) tüpün membranı antikor çözeltisi ile eşit şekilde kaplayacak şekilde yatay olduğundan emin olun. Gerçek deneyden önce antikorun seyreltilmesini ve kuluçka süresini kalibre edin.
4. Membran yıkama
- Dönüşü durdurun.
- PVDF membranını cımbızla tüpten dikkatlice çıkarın ve membranı 50 mL PBS-T içeren bir kaba yerleştirin.
- Membranı PBS-T ile kısa bir süre durulayın.
- Zarı kabarmış su ile kabarcık görününe kadar durulayın. Bu antikorun çoğunluğunu çıkarmaktır.
- PVDF membranını kaptan 250 mL PBS-T içeren salata spinner'a aktarın.
- Süzgeç sepetini spinner'a yerleştirin. Kapağın güvenli bir şekilde takıldığından emin olun.
- Spinner'ı etkinleştirin ve yaklaşık 20-30 s boyunca çalıştırın.
- Çözeltiyi atın ve spinner'ın içini damıtılmış suyla kısa bir süre durulayın.
- Spinner'a tekrar 250 mL PBS-T ekleyin.
- 4.6 ve 4.7 adımlarını yineleyin.
5. İkincil antikor ile inkübasyon
- Damıtılmış su ile %10 immünoreaksiyon arttırıcı ajan-2 çözeltisi (IRE-2) hazırlayın. Girdap iyi.
- Seyreltilmiş ikincil antikorun %10 IRE-2 ile hazırlanması. Hafifçe ve iyice karıştırın.
- Adım 3.3'te belirtildiği gibi antikor çözeltisinin ve tüpün hacmini seçin.
- PVDF zarını cımbızla alın ve çözeltiyi kısaca boşaltın. 3.4. adımda belirtildiği gibi PVDF membranını tüpe yerleştirin.
- 50 mL'lik tüpü hibridizasyon fırını için bir cam şişeye yerleştirin.
- Hibridizasyon fırınını açın.
- Membranı en az 5 dakika boyunca 6 rpm dönüşle kuluçkaya yatırın. Zarın her zaman duvara yapıştığından ve (iç) tüpün membranı antikor çözeltisi ile eşit şekilde kaplayacak şekilde yatay olduğundan emin olun.
NOT: Gerçek denemeden önceki kuluçka süresini kalibre edin. İkincil antikor floresan konjuge edildiğinde, inkübasyonu karanlıkta gerçekleştirin.
6. Membran yıkama
- 4.1 ile 4.10 arasında olan adımları izleyin.
7. Görüntü alımı
- Chemiluminescent algılama
- Düz bir yüzeye bir parça yarı nakil esnek film (10 cm x 15 cm) yerleştirin.
- Chemiluminescent substratının 2 bileşenini 5 mL'lik bir tüpte karıştırın.
- Karışık substratın 1,5 mL'sini hemen yarı nakil esnek filme aktarın ve üzerine PVDF zarını yerleştirin. Daha sonra, substrat çözeltisinin geri kalanını zara aktarın.
- PVDF membranı, yarı saydam esnek bir film üzerindeki karışık substrat ile 1 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
- PVDF membranını cımbızla alın ve substrat çözeltisini kısa bir süre boşaltın.
- Membranı bir çift şeffaflık filmi arasına sıkıştırın.
- Görüntüyü chemiluminescent modu altında alın.
- Floresan algılama
- PVDF zarını cımbızla alın ve çözeltiyi kısaca boşaltın.
- Membranı bir çift şeffaflık filmi arasına sıkıştırın.
- Görüntüyü floresan modunda elde edin.
NOT: Maksimum hassasiyet sağlamak için 7.1 ve 7.2 adımları görüntüleme makinesine yakın bir yerde yapılmalıdır. - Arka plan sinyali yüksek olduğunda, 80-100 mL PBS-T içeren bir kapta yıkama adımı gerçekleştirin: birincil antikor için 3 kez 10 dakika durulayın ve ikincil antikor için 5 dakika durulayın.
NOT: %10 IRE çözeltileri ile seyreltilmiş hem birincil hem de ikincil antikorlar hassasiyet kaybı olmadan 8-10 kata kadar kullanılabilir6. Çözelti 1 aya kadar 4 °C'de tutulmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu örnek, CDR yönteminin batı blot üzerindeki immünoenhancing teknolojisi ile birlikte etkinliğini göstermektedir. Statik inkübasyon, PVDF membranlarının antikor çözeltisi ile inkübe edildiği yarı saydam esnek bir film üzerinde yapılırken, CDR inkübasyonu membranları ve antikor çözeltisini (Film) içeren tüpleri döndürerek hibridizasyon fırınında yapıldı. Şekil 2'de batı lekelerinde chemiluminescent tespiti için gerekli olan antijen ve antikor miktarları gösterildi. Hem statik hem de CDR inkübasyonlarında, IRE çözeltisinin kullanımı hassasiyeti artırdı: IRE, statik koşullar altında ß-actin tespit etmek için gereken en düşük hücre lysates (antijen) miktarını 2,2 μg'den 1,1 μg'ye düşürdü ve CDR kullanarak 1,1 μg'den 0,275 μg'ye düşürüldü (Şekil 2A). Benzer şekilde, anti-6x Etiket antikorunun minimum konsantrasyonu statik koşullar altında 100 ng/mL'den 50 ng/mL'ye, CDR koşulunda ise 100 ng/mL'den 12,5 ng/mL'ye düşürüldü (Şekil 2B). 5 dakika veya 10 dakika boyunca CDR inkübasyonu, statik inkübasyona kıyasla algılama sınırını önemli ölçüde düşürdü (birincil ile 60 dk ve ikincil antikorlarla 30 dk). Son olarak, CDR'nin IRE ile kombinasyonu, bu son derece kısa inkübasyon süresi içinde bile batı blotunda (ß-actin tespiti için 0.275 μg hücrelysates ve 12.5 ng/mL anti-6x His tag antikoru) üstün hassasiyet ortaya koydu.
İkinci örnek, bu yöntemin floresan algılamalı batı lekesine başarılı bir şekilde uygulanmasını gösterir (Şekil 3). Floresan algılama, chemiluminescent algılamanın aksine, antikorları sıyırmadan / yeniden yoklamadan aynı blot üzerindeki birden fazla hedefi aynı anda tespit etme benzersiz bir yeteneğe sahiptir. (Onun) Hücre lysates 6 etiketli AP ve ß-actin aynı anda iki renkli bir florofor kullanılarak tespit edildi. IRE ile CDR inkübasyonu sadece algılamayı hızlandırmakla kalmadı, aynı zamanda hassasiyeti de artırdı, bu da (His)6 etiketli AP'nin(Şekil 3A)bozulmasının maskesini düşürdü.
Şekil 1: Döngüsel boşaltma-yenileme (CDR) yönteminin şematik çizimi.
(A) Bir probun antijen için yüksek bir benzeşime sahip olmasına rağmen çözelti yoluyla yayılması sınırlı bir yeteneğe sahip olduğunda, membranın yakınındaki bir tükenme tabakası statik koşullar altında hızla oluşur. Böylece, probun membrana seyahat etmesi bir hız sınırlayıcı adım haline gelir ve uzun kuluçka süreleri kütle transferi sınırlamasını telafi eder. (B) Membran duvara yapışırken tüpü döndürerek CDR yöntemi tükenme tabakasını ortadan kaldırır ve prob konsantrasyonunu membranın yakınında sabit tutmak için aynı prob çözeltisini yeniler. Bu rakam Higashi ve ark.6'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: (A) Farklı miktarlarda 293 hücreli lysates (8.8 μg/ şeritten 1:2 seri seyreltme) SDS-PAGE ile ayrıldı, ardından bir PVDF membranine transfer edildi ve PBS-T'de% 5 yağsız süt ile bloke edildi. Leke fare anti-ß-actin antikor (1:3.000 seyreltme) ile araştırıldı. (B) Salgılanan (His) 6 etiketli alkalin fosfataz (AP, 8 x 10-14 mol/şerit) içeren pAPTAG5 (GenHunter) ile transfected 293 hücreden elde edilen koşullu ortamın ayrılmasından sonra proteinler PVDF membranlarına aktarıldı. Her membran, farklı anti-6x His etiket antikor konsantrasyonlarına sahip batı lekesine maruz kaldı (400 ng / mL'den 1:2 seri seyreltme). Membranlar tek bir görüntü olarak resmedildi ve noktalı çizgiler tek tek zarların kenarlıklarını gösteriyor. Bu rakam Higashi ve ark.6'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: IRE ile birlikte floresan algılama ve CDR kullanılarak batı lekesi üzerindeki birden fazla hedefin aynı anda algılanmasını.
pAPTAG5 ile transfected 293 hücreden farklı miktarlarda lysates (10 μg/şeritten 1:2 seri seyreltme) ayrılarak bir PVDF zarı içine aktarıldı. Floresan algılama için Engelleme Tamponu (BFD) ile 1 saat boyunca bloke edildikten sonra, leke anti-6X His etiketi ve anti ß-actin antikorları ile araştırıldı, ardından IRDye 800CW keçi anti-tavşan IgG ve IRDye 680RD keçi anti-fare IgG. A: CDR durumu altında% 10 IRE çözeltisi ile seyreltilmiş antikorlar, B: statik durum altında% 0.1 Tween20 içeren BFD ile seyreltilmiş antikorlar. CDR ve IRE kombinasyonu ile daha yüksek hassasiyet nedeniyle, (His)6 etiketli AP'nin bozulması görüldü. Bu rakam Higashi ve ark.6'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Geleneksel statik yönteme kıyasla gelişmiş ve ultra yüksek hızlı CDR batı lekesinin şematik illüstrasyonu.
Bu rakam Higashi ve ark.6'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Batı blotu, ~40 yıl önce7,8. O zamandan beri, teknik gelişmeye devam etti, sonraki yenilikler tekniğin hassasiyetini, hızını ve niceliğini geliştirdi2, 9,10,11,12,13. Burada sunulan gelişmiş ultra yüksek hızlı batı şişkinlik protokolü, mevcut teknikte birkaç önemli geliştirme yapar. IRE ile algılama eşiğini düşürerek hassasiyetten ödün vermeden kuluçka süresini azaltıyoruz. Özel veya pahalı ekipmana gerek yoktur: Bir tüpü hibridizasyon fırınında döndürmek MTL'nin üstesinden gelmek için yeterlidir. Temel yenilik, CDR'nin testteki tükenme katmanını etkili bir şekilde ortadan kaldırmasıdır. Çözelti hacmini azaltmak için yaygın olarak bir silindir kültürü aparatı sınansa da, bu yöntemin MTL'yi aşma ve kuluçka sürelerini azaltma potansiyeli açıklanmamıştır. Tüm prosedür için genel sürenin büyük ölçüde azaltılması nedeniyle (Şekil 4), tıkanmış zarlar kişinin elinde olduğunda günde çok daha yüksek miktarlarda batı blot verisi elde edilebilir, bu da geleneksel bir batı blotting protokolü ile neredeyse imkansızdır. Membran inkübasyonunun sallanan bir platform çalkalayıcıda statik inkübasyona eşdeğer olduğu belirtilmelidir4,6. PVDF membranlarının büyük hacimli yıkama çözeltisi ile bir ev ticari salata iplikçisinde durulaması da prosedürün süresini azaltır (Şekil 4).
Bu protokolün başarılı kullanımı, antikor seyreltmenin IRE çözeltisi ve kuluçka süresi ile optimizasyonuna dayanır. IRE ile birlikte CDR duyarlılığı önemli ölçüde artırdığından, tahlillerin başında çok çeşitli antikor titrasyonu önerilir(Şekil 2). Kuluçka süresi dikkate alınması gereken bir diğer faktördür. Statik koşullar altında primer antikorlarla 1 saat inkübasyon ile iyi batı lekesi sonuçları elde edildiğinde, inkübasyon süresi genel olarak CDR koşullarında 5-10 dakikaya düşürülebilir. Örneğin primer antikorlarla gecelik inkübasyon gerektiğinde, biraz daha uzun bir CDR inkübasyon süresi (30 dk - 6 saat) değerlendirilmelidir. sekonder antikorlarla seyreltme ve inkübasyon süresi de kritik öneme sahiptir. CDR koşullarında 30 dakikadan büyük inkübasyonlar genellikle daha yüksek arka plan verir. Bu nedenle, 30 dakikaya kadar CDR inkübasyonu ile ikincil antikorların dikkatli bir şekilde titrasyonu gerekir. Antikorların dikkatli titrasyondan sonra arka plan sinyali yüksek olduğunda, 80-100 mL yıkama çözeltisi olan bir kapta geniş yıkama adımları (primer antikor için 10 dakika durulama 3 kez ve ikincil antikor için 5 dakika durulama 6 kez) yapılmalıdır.
Batı blot verilerinin kalitesi genellikle kullanılan antikorlara bağlıdır. Batı lekesi için kullanılan zor bir antikorumuz olduğunda, protein belirteçleri bazen dikkatli antikor titrasyonu ve kapsamlı yıkamadan sonra bile önemli sinyaller gösterdi. IRE ile CDR yönteminin spesifik olmayan bağlamayı artırma eğiliminde olduğunu fark ettiğimizden, antikor seyrelticilerine bloke reaktiflerin (yağsız süt ve diğerleri gibi) eklenmesi sinyal-gürültü oranını artırabilir14. Zaman alıcı bir tarama adımıdır, ancak denemeye değer.
Batı lekesi nicel uygulamalar için önemli hale gelmiştir2. Yarı nicellik, chemiluminescent algılama ile gerçekleştirilebilir. Burada sunulan prosedür, bu amaçla sıyırma ve yeniden yoklama için geçerlidir6. Daha geniş bir dinamik aralık nedeniyle, floresan algılama en iyi seçenektir. Bu protokol ile floresan algılama, nicel analiz6için doğrusal bir dinamik aralık sağlar. Floresan algılamalı CDR inkübasyon süresinin, chemiluminescent algılama ile bundan daha uzun göründüğünü belirtmek gerekir.
Batı blot çok çeşitli uygulamalara sahiptir ve protein bolluğunu, protein-protein etkileşimlerini ve çeviri sonrası modifikasyonları incelemek için evrensel bir yöntem olmaya devam etmektedir. Örneğin, anti-karbonhidrat antikorları bu protokol14ile batı lekesi için kolayca kullanılabilir. Viral, bakteriyel ve fugus'un dış yüzeyinde ifade edilen çeşitli karbonhidrat moieties patojene özgü olduğundan, patojen tanıma ve bulaşıcı hastalıkların teşhisi için paha biçilmez hedeflerdir. Bu nedenle, bu basit protokolün uygulanması, sadece deneyler için değil, aynı zamanda batı şişkinlik teknolojisine dayanan klinik immünodiagnostikler için de birçok araştırma alanını, tıraş saatlerini etkileyebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, bu makalenin içeriğiyle doğrudan ilgili rakip çıkarlar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma Intramural Araştırma Bölümü, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklendi. S.H., Japonya Kamu-Özel Ortaklığı Öğrenci Yurtdışında Eğitim Programı tarafından desteklendi ve H.N. ve K.Y. Valor ve V Drug Overseas Training Scholarship tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
References
- MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
- Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
- Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
- Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html (2020).
- Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
- Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852 (2016).
- Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
- Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).
